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成纖維細胞生長因子1改構體凝膠劑制備及在糖尿病足治療中的應用.pdf

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纖維 細胞 生長因子 改構體 凝膠 制備 糖尿病足 治療 中的 應用
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摘要
申請專利號:

CN201210430489.7

申請日:

20121026

公開號:

CN103083226A

公開日:

20130508

當前法律狀態:

有效性:

有效

法律詳情:
IPC分類號: A61K9/06,A61K38/18,A61K47/32,A61P9/14,A61P17/02,A61P3/10 主分類號: A61K9/06,A61K38/18,A61K47/32,A61P9/14,A61P17/02,A61P3/10
申請人: 溫州醫學院,浙江格魯斯特生物科技有限公司
發明人: 田海山,李校堃,王曉杰,金利泰,姜潮,唐祿
地址: 325035 浙江省溫州市茶山高教園區溫州醫學院
優先權: CN201210430489A
專利代理機構: 代理人:
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法律狀態
申請(專利)號:

CN201210430489.7

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法律狀態公告日:

法律狀態類型:

摘要

本發明提供了一種含有成纖維細胞生長因子-l改構體的凝膠劑的制備方法及在糖尿病足引起的慢性皮膚潰瘍治療中的應用。本發明所述的凝膠劑的組分及用量為:重組人成纖維細胞生長因子-1改構體(FGF-1135)蛋白20000~80000IU;低分子量肝素鈉為10?p?g~40μg;甘油含量為O.2g~1.Og;蛋白保護劑為50mg~150mg;凝膠基質為0.03g~0.05g;調節pH值,加注射用水至lOml。本發明中所用的成纖維細胞生長因子-1改構體比原序列更加穩定,制備成凝膠劑后更方便于臨床應用,并能達到較好的穩定性和緩釋效果,提高了蛋白的生物利用度,更有利于糖尿病足的治療。該凝膠劑還可用于燒燙傷及其他慢性、難愈性潰瘍的治療。

權利要求書

1.一種含有成纖維細胞生長因子一1改構體的治療糖尿病足凝膠劑的制備方法。以1000ml即100支(10g/支)凝膠劑制備量計,其組成配方為:①重組人成纖維細胞生長因子一1改構體蛋白2?X?lOIU~8?X?lOIU②蛋白保護劑????5g~15g;⑨低分子量肝素lmg~4mg;④甘油????20g~lOOg;⑤凝膠基質????3g~log;⑥注射用水,定容至1000ml。其中所述的蛋白保護劑為人血白蛋白,凝膠劑基質為卡波姆940。2.根據專利要求1所述的含有成纖維細胞生長因子一1改構體的治療糖尿病足的凝膠劑的制備優選方法,以1000ml凝膠劑制備量計,其組成配方為:①重組人成纖維細胞生長因子一1改構體蛋白6.75X?10IU②蛋白保護劑????10.Og;③低分子量肝素????3.Omg;④甘油????50.Og;⑤凝膠基質????4.Og;⑥注射用水,定容至1000ml。其中所述的蛋白保護劑為人血白蛋白,凝膠劑基質為卡波姆940。3.根據專利要求l或2所述的含有成纖維細胞生長因子一1改構體的治療糖尿病足的凝膠劑的制備方法,其特征是所述的成纖維細胞生長因子一1改構體選用重組人成纖維細胞生長因子一1改構體蛋白。4.根據專利要求1或2所述的含有成纖維細胞生長因子一1改構體蛋白凝膠劑的制備方法是:基質溶脹及滅菌:將卡波姆940中加入甘油,攪拌充分混勻,用適量注射用水充分溶脹,調節DH值使其形成透明凝膠,121。C、30min高壓滅菌。冷卻后備用;蛋白除菌過濾:將重組人成纖維細胞生長因子一l改構體蛋白、人血白蛋白及肝素,加入冷卻的注射用水中充分混勻,在無菌條件下用0.22μm濾膜過濾除菌;凝膠劑制備:在無菌條件下,將上述兩種物質充分混合,分裝即得。5.根據專利要求1~4包含不同含藥及組成劑量,在糖尿病足難愈性及慢性潰瘍組織中提供穩定性好并具有一定緩釋效果的成纖維細胞生長因子一1改構體蛋白凝膠劑,并提高蛋白的生物利用度。6.根據專利權要求1~5所述制備的含有重組人成纖維細胞生長因子一l改構體蛋白的凝膠劑,其特征是,還可應用于燒燙傷及其他慢性、難愈性潰瘍的治療。

說明書

技術領域

本發明涉及一種含有重組人成纖維細胞生長因子一l改構體(FGF-1135)蛋白的用于治療糖尿病足等疾病的凝膠劑制備及應用,屬生物醫藥領域。?

背景技術

糖尿病(Diabetes?mellitus,DM)是一種多種因素引起的全身代謝性疾病,目前全世界超過1.8億人患有糖尿病,已經成為全球性重大公共衛生問題。糖尿病患者中約有30%~80%合并有皮膚損害,嚴重危害糖尿病病人的健康,其中最典型和危害最大的為糖尿病足。糖尿病足(DiabeticFoot,DF)是DM的常見慢性并發癥之一,主要是以糖代謝紊亂為前提的綜合因素作用的結果。糖尿病代謝異常引起的高血糖、高血脂及其所產生的代謝產物一方面可致神經軸突、神經鞘膜及雪旺細胞變性致使感覺神經、運動神經、自主神經功能障礙,導致感覺缺失、皮膚干裂、組織抵抗力降低易于感染壞疽;另一方面可使血小板聚集力增強、血液粘稠度增加,促進動脈粥樣硬化及血栓形成,使血管腔狹窄或閉塞,導致肢端缺血壞死潰爛。缺血及神經損傷又使局部組織愈合能力、抗感染能力降低因而傷口不易愈合。在病理生理方面主要表現為創面組織細胞代謝異常,免疫功能紊亂,尤其是創面局部巨噬細胞、肥大細胞功能失調,并伴隨有創面微環境中生長因子功能受損,創面局部微循環灌注障礙,組織缺氧等,從而造成創面經久不愈從而引起難以愈合的潰瘍,往往會導致壞疽或截肢,大大降低了患者的生存質量,而且治療相當困難,周期長,醫療費用高,給患者帶來極大痛苦及沉重的負擔。據統計每年大約有3%~6%糖尿病患者發生足部潰瘍,其中70%的患者需要手術治療,歐美國家40%~70%的下肢截肢與糖尿病有關,美國每年約有5萬例以上的糖尿病截肢手術,我國糖尿病截肢率在14%~22%。隨著現代糖尿病的發生率不斷上升,糖尿病足所帶來的社會問題和經濟負擔不斷加重。?

目前臨床上糖尿病足的治療方法主要有藥物治療、外科手術治療、自體干細胞移殖治療等。外科手術及自體干細胞移殖治療費用高、專業性強,對病人的耐受性也有較高要求,因此開發促進肉芽生長和創面愈合有效藥物,促進糖尿病足的早期愈合、縮短病程和降低致殘率,是當今醫學領域研究的重要課題之一,越來越受到研究人員和生產企業的重視。?

成纖維細胞生長因子一l亦稱為酸性成纖維細胞生長因子(acidic?Fibroblast?growthfactor,aFGF)是一類對來源于中胚層和神經外胚層的多種類型細胞具有廣泛的生物學活性?的細胞因子。作為一個高度保守的功能蛋白,大量的研究己充分證實了成纖維細胞生長因子家族成員在促進創傷愈合、潰瘍愈合、血管再生、神經組織修復、神經突起生長等方面具有突出的功效,孕育著巨大的臨床應用前景。由于潰瘍創面是細菌等微生物繁殖的溫床,創面自身及細菌等微生物的分泌物使創面這一微環境呈酸性。haFGF在這一微環境中較堿性成纖維細胞生長因子(bFGF)穩定,更有利于發揮其生物學活性。此外,與表皮生長因子(EGF)相比較,EGF可促進I型膠原的合成,導致瘢痕疙瘩形成,而haFGF能通過對I型前膠原基因表達的下行調節作用,抑制成纖維細胞的膠原合成,減少成纖維細胞的膠原蛋白的過量沉積,有助于防止瘢痕疙瘩的產生。因而應用haFGF治療糖尿病足潰瘍等慢性難愈性傷口有著廣闊的前景,可提高這類病人的傷口愈合速度和質量,進而提高患者的生活質量。?

目前,美國CardioVascularBioTherapeutics(CVBT)公司應用aFGF治療糖尿病足為目標的一期臨床試驗已完成,已進入二期臨床試驗階段,發展前景非常樂觀。國內外也有臨床使用bFGF、EGF、G—CSF、PDGF等生長因子與其他藥物配合治療糖尿病足的報道,顯示具有明顯的臨床療效。本發明中重組人成纖維細胞生長因子一1改構體(mrhFGF-l,FGF-1135)與美國CVBT公司相比具有以下特點:根據FGF一1的活性結構域位于c端,N末端部分氨基酸的缺失不影響FGF的生物學活性的特性,去除了N末端影響蛋白表達及穩定性的19個氨基酸,使表達量由80mg/L提升到200mg/L以上;體外細胞測活與藥效學表明,N末端缺失19個氫基酸不影響FGF—l的生物學活性:缺失后重組蛋白的N末端降解問題與二聚體形成明顯降低。同時,也通過動物實驗證實FGF-1135對糖尿病性皮膚潰瘍具有較為顯著療效,并進一步證明其用藥的安全性。?

發明內容

對目前成纖維細胞生長因子一1凍干粉制劑對糖尿病足等難愈性潰瘍的臨床應用中的不足進行改進,提供簡單實用、穩定性及療效好的凝膠劑及其制備方法。?

本發明目的是提供FGF-1凝膠劑制備方法。?

本發明進一步目的是在于提供FGF-1凝膠劑在糖尿病足潰瘍疾病中的應用。?

本發明還可應用于燒燙傷、褥瘡等難愈性潰瘍的臨床治療。?

本發明的上述目的是通過如下方案予以實現的:?

本發明提供了一種重組人成纖維細胞生長因子一l改構體凝膠劑的制備方法。按照發明的實施例方案,卡波姆重量0.3%~1.O%,優選0.5%作為凝膠基質:人血白蛋白重量0.5%~l_5%,優選1.0%作為蛋白保護劑;低分子量肝素重量O.1%mg~O.4%mg,優選O.5%mg作為保護細胞活性,并減緩其釋放;甘油重量2.O%~lO.0%,優選5.O%作為凝膠保濕劑。?

在本發明的凝膠劑中,重組人成纖維細胞生長因子一1改構體有效劑量2000?Iu/g~8000Iu/g,優選6750?Iu/g,該劑量能有效促進1型及2型糖尿病潰瘍模型創面的有效愈合。?

本發明還提供了凝膠劑的制備方法,包括基質溶脹及滅菌即將卡波姆940中加入甘油,攪拌充分混勻,用適量注射用水充分溶脹,調節pH值使其形成透明凝膠,121℃、30min高壓滅菌。冷卻后備用;將重組人成纖維細胞生長因子一1改構體蛋白、人血白蛋白及肝素,加入適量冷卻的注射用水中充分混勻,在無菌條件下用0.22?u?m濾膜過濾除菌;在無菌條件下,將上述兩種物質充分混合,分裝即得。?

本發明具有以下優點:?

1.本發明采用卡波姆940作為基質材料,具有延展性好、易于涂抹和附著于皮膚,對皮膚及粘膜無刺激性并能吸收組織滲透液,有利于分泌物的排出;無油膩性,釋藥迅速,與皮膚組織耦合效果好等特性。?

2.本發明配伍合理,可達到穩定負載FGF-1蛋白于凝膠劑中,并保持其生物活性、延緩釋放的作用,促進創面有效愈合。采用的組分均對皮膚無毒副作用、無刺激性,便于清潔。?

3.本發明產品可直接涂抹于創面部位,使用方便,增加患者的依從性和臨床應用。?

附圖說明

圖1皮膚外傷性潰瘍模型?

圖2皮膚燙傷性潰瘍模型?

圖3FGF-1135凝膠劑對1型糖尿病SD大鼠皮膚外傷及燙傷治療愈合情況?

圖4FGF-1135凝膠劑對2型糖尿病GK大鼠皮膚外傷及燙傷治療愈合情況?

圖5FGF-1135凝膠劑對1型糖尿病GK大鼠皮膚外傷及燙傷皮膚組織病理學檢查?

圖6FGF-1135凝膠劑對1型糖尿病GK大鼠皮膚創傷及燙傷皮膚組織病理學檢查?

具體實施方式

實施例1生產加載FGF-1135的凝膠劑?

基質溶脹及滅菌:將卡波姆940中加入甘油,攪拌充分混勻,用適量注射用水充分溶脹,調節pH值使其形成透明凝膠,121℃、30min高壓滅菌。冷卻后備用;?

蛋白除菌過濾:將重組人成纖維細胞生長因子一l改構體蛋白、人血白蛋白及肝素,加入冷卻的注射用水中充分混勻,在無菌條件下用0.22μm濾膜過濾除菌;?

凝膠劑制備:在無菌條件下,將上述兩種物質充分混合,分裝即得。?

作為基質材料卡波姆具有延展性好、易于涂抹和附著于皮膚,對皮膚及粘膜無刺激性并能吸收組織滲透液,有利于分泌物的排出;無油膩性,釋藥迅速,與皮膚組織耦合效果好等特性。加入低分子量肝素是因為FGF-1為肝素親和性生長因子,具有特異的糖胺聚糖一蛋白質相互作用,可達到穩定負載于載體材料中,并保持其生物活性、延緩釋放的作用,對細胞的生長、遷移具有調節作用。加入人血白蛋白及甘油對蛋白的穩定性具有良好保護作用。?

實施例2測定凝膠劑活性?

采用四甲基偶氮唑鹽比色法(MTT法)測定凝膠劑活性。Balb/c3T3細胞用完全培養液,于37℃、5%C02培養至對數生長期。棄去培養瓶中的培養液,消化并收集細胞,加完全培養基調整細胞懸液濃度,使待測細胞密度為50000-100000個/ml,按每孔100?u?l接種于96孔細胞培養板中,??37℃、5%C02培養24h,換維持培養基繼續培養24?h。棄去維持液,加入標準品及用培養基溶解并按一定濃度稀釋的凝膠樣品溶液,每孔100弘l,37。C、5%C02培養箱中培養64h~72h。每孔加入20μl?MTT溶液,繼續培養5?h。倒掉液體,每孔加100?μl二甲基亞砜溶液,混勻后在酶標儀上以630nm為參比波長,于波長570nm處測定吸光度,記錄測定結果,計算供試樣品的生物學活性。?

實施例3測定凝膠劑的穩定性?

通過測定不同溫度下,凝膠劑的穩定性實驗結果表明,在4℃、25。C、37。C保存12個月,凝膠劑無霉變現象,其外觀、pH值等理化指標均未發生變化;載藥凝膠劑的生物學活性在室溫條件下,穩定性差,放置3個月后活性有較明顯降低,而低溫條件對載藥凝膠劑的的存放無明顯影響。?

表1?FGF-1凝膠劑在25℃穩定性試驗結果?

時間(月) 生物學活性(IU/g) 理化指標 O 2.25XlO4 --- l 2.12×104 無變化 2 1.98X104 無變化 3 1.75×104 無變化 4 1.45X104 無變化 5 1.05×lO4 無變化 6 O.52×lO4 無變化

表2?FGF—l凝膠劑在4℃穩定性試驗結果?

時間(月) 生物學活性(IU/g) 理化指標 0 2.25×lO4 --- 1 2.23X104 無變化 3 2.18×lO4 無變化 6 2.12×lO4 無變化 12 2.02×104 無變化

實施例4在1型和2型糖尿病大鼠實驗模型中證明,含FGF-1135蛋白的凝膠制劑對糖尿病大鼠的皮膚創傷和燙傷創面有非常明顯的促進愈合作用?

實驗動物模型制備:

l、糖尿病模型?

①l型糖尿病模型:選用體重180-220g的雄性SD大鼠,用鏈脲佐菌素(streptozotocin,STZ)劑量按70?mg/kg,臨用前溶于0.1?mol/L檸檬酸緩沖液中腹腔注射,每天一次,連續2天,自第一次注射72?h后測量空腹血糖在兒.1mmo?1/L以上即為模型合格。?

②2型糖尿病模型:選用4月齡雄性GK大鼠。?

2、潰瘍模型:?

①外傷性潰瘍模型:大鼠用戊巴比妥納45mg/kg腹腔注射麻醉,背部用脫毛劑脫毛,在背部左右兩側各做一個直徑1.8cra圓形標記,用碘伏皮膚消毒后沿標記線將全層皮膚切除,形成面積約2.45cm2的新鮮創面(圖1)。創面按壓止血,暴露治療,編號并單籠飼養,給普通鼠糧自由攝取。。?

②燙傷性潰瘍模型:大鼠用戊巴比妥納45mg/kg腹月空注射麻醉,背部用脫毛劑脫毛,用燙傷儀在背部燙出直徑為L?8cm的深II度燙傷創面,燙傷條件為:燙頭溫度85。C;壓力O.5kg時間為10秒(圖2)。創面暴露不包扎,編號后單籠飼養,給普通鼠糧自由攝取。?

實驗動物分組:造模當日,選取造模成功的小鼠在不禁食狀態檢查血糖水平,將血糖水平接近的動物分在一組,共分為7組。?

第1組一FGF-1135凝膠劑10?u/cm2組?

第1I組一FGF-1135凝膠劑30?U/cm2組?

第1II組一FGF-1135凝膠劑90?U/cm2組?

第Ⅳ組一FGF-1135凝膠劑270?u/cm2組?

第V組一FGF-1135凍干粉陽性對照組?

第Ⅵ組一溶劑對照組(FGF-1135溶媒)?

第Ⅶ組一空白對照組(生理鹽水)?

每組均由10只小鼠組成,每日給藥1次,連續給藥21天。創面形成后當天開始治療,治療組一側(左側)創面涂相應濃度的受試藥物,另一側給等體積溶媒作為對照;陰性對照組一側創面給等體積的生理鹽水,另一側不做任何處理。創面形成后當天開始治療,每天一次,治療前用雙氧水、生理鹽水沖洗傷口并用碘伏消毒創面,然后用給相應藥物O.2ml并用棉簽涂均勻。?

測定對外傷性損傷和燙傷性損傷的治療作用:

1、1型糖尿病SD大鼠所有實驗動物從創面形成當天到治療結束,傷口表面干燥無滲出,無化膿潰爛現象,從表3和表4可以看出,載藥凝膠劑對I型糖尿病SD大鼠創傷性和燙傷性皮膚損傷均有較好的治療效果,從創面形成(0天)后開始,隨著治療時間的延長,各組傷口面積均逐漸縮小,并呈劑量依賴性。?

表3?F6F一1135凝膠劑對1型糖尿病SD大鼠皮膚外傷性損傷的治療作用(mean士SD)?

與空白對照組比較*P<O.05**P<O?Ol***P<O.001?

表4?FGF一1135凝膠劑對1型糖尿病SD大鼠皮膚燙傷的治療作用(mean士SD)?

與空白對照組比較*P<O.05**P<O.0l***P<0.00l?

2、2型糖尿病GK大鼠所有實驗動物從創面形成當天到治療結束,無感染化膿現象,從表5和表6可以看出,載藥凝膠劑對2型糖尿病GK大鼠外傷性和燙傷性皮膚損傷均有較好的治療效果,從創面形成(O天)后開始,隨著治療時間的延長,各組傷口面積均逐漸縮小,并呈劑量依賴性。?

表5?FGF一1la5凝膠劑對GK大鼠皮膚外傷性損傷的治療作用(mean士SD)?

與空白對照組比較*P<O.05**P<O.01***P<O.001?

表6??FGF—l136凝膠劑對GK大鼠皮膚燙傷的治療作用(mean士SD)?

與空白對照組比段*P<O.05**P<0.01??***P<O.001?

實驗結果表明,載藥凝膠劑對1型、2型糖尿病大鼠外傷性和燙傷性皮膚損傷均有較好的治療效果,從創面形成(0天)后開始,隨著治療時間的延長,各組傷口面積均逐漸縮小。(圖3、圖4)在相同時間點和空白對照組比較,糖尿病大鼠皮膚損傷模型270U劑量治療組和空白對照組的傷口面積比較即有顯著統計學意義。?

實驗動物創面區皮膚組織病理學檢查:脫臼處死動物,摘除皮膚,并且在10%中性福爾馬林中固定,進行HE染色并制病理片,觀察創面中成纖維細胞、纖維細胞、膠原纖維細胞和毛細血管生長情況。?

實驗結束每組動物選取3只做皮膚病理切片檢查,重點觀察成纖維細胞、纖維細胞、毛細血管和膠原纖維增生情況,采取半定量化評分方法,空白對照組成纖維細胞平均得分在3-4分,而rhaFGF高劑量組平均得分在8-9分,對纖維細胞增生也有明顯作用,并有促進新生血管形成的作用(圖5、圖6)。?

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