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地榆素在藥物中的用途.pdf

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地榆 藥物 中的 用途
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摘要
申請專利號:

CN201410032898.0

申請日:

20110914

公開號:

CN103948710A

公開日:

20140730

當前法律狀態:

有效性:

失效

法律詳情:
IPC分類號: A61K36/739,A61P35/00,A61P7/00,A61P7/06,A61P19/08 主分類號: A61K36/739,A61P35/00,A61P7/00,A61P7/06,A61P19/08
申請人: 成都科爾醫藥技術有限公司
發明人: 王達賓,蘇柘僮,楊明,楊勝,鄒文銓
地址: 610041 四川省成都市武侯區小天中街29號
優先權: 201010280772.7,201110186932.6
專利代理機構: 北京聿宏知識產權代理有限公司 代理人: 吳大建;歐穎
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法律狀態
申請(專利)號:

CN201410032898.0

授權公告號:

法律狀態公告日:

法律狀態類型:

摘要

本發明提供地榆素在制備具有保護骨髓細胞作用的藥物中的用途。在一種具體的實施方式中,所述地榆素為地榆素含量為100%的化合物。在另一種具體實施方式中,所述地榆素為含地榆素0.05~3wt%的混合物,優選含地榆素1~2wt%的混合物。在該發明中,優選所述混合物中還包含兒茶素和原花青素B2中的至少一種。本發明提供的地榆素能保護骨髓造血干細胞,緩解放療或化療藥物引起的小鼠骨髓DNA抑制,還能夠升高白細胞數量。

權利要求書

1.地榆素在制備具有保護骨髓細胞作用的藥物中的用途。2.根據權利要求1所述的用途,其特征在于,所述地榆素為地榆素含量為100%的化合物。3.根據權利要求1所述的用途,其特征在于,所述地榆素為含地榆素0.05~3wt%的混合物,優選含地榆素1~2wt%的混合物。4.根據權利要求3所述的用途,其特征在于,所述混合物中還包含兒茶素和原花青素B2中的至少一種,優選所述混合物中還包含兒茶素和原花青素B2。5.根據權利要求4所述的用途,其特征在于,所述混合物中兒茶素的含量為1~5wt%,優選為2~5wt%,所述混合物中原花青素B2的含量為0.05~1.5wt%,優選為0.05~0.4wt%。6.根據權利要求1~5中任意一項所述的用途,其特征在于,所述藥物是預防和/或治療由放療或化療引起的抑制正常骨髓細胞的藥物。7.根據權利要求1~5中任意一項所述的用途,其特征在于,所述藥物是預防和/或治療由放療或化療引起的貧血、白細胞減少癥或血小板減少癥的藥物。8.地榆素在制備治療白細胞減少癥的藥物中的用途。9.一種預防和/或治療骨髓細胞抑制或白細胞減少癥的藥物組合物,它是由有效量的地榆素加入藥學上可接受的輔料或輔助性成分制備成藥學上常用的制劑。10.根據權利要9所述的藥物組合物,其特征在于,所述制劑為口服制劑。

說明書

本申請是申請號為201180038931.5的分案申請,母案申請日為2011年9月14日,母案的發明名稱為一種地榆鞣質提取物及其制備方法和用途。

技術領域

本發明涉及地榆素在藥物中的用途。

背景技術

骨髓抑制,是指骨髓中的血細胞前體的活性下降。血液里的紅細胞和白細胞都源于骨髓中的造血干細胞。血液里的血細胞壽命短,常常需要不斷補充。為了達到及時補充的目的,作為血細胞前體的干細胞必須快速分裂。化學治療和放射治療以及許多其它抗腫瘤治療方法,都是針對快速分裂的細胞,因而常常導致正常骨髓細胞抑制,引起患者骨髓造血功能障礙,使得患者體內紅細胞、白細胞、血小板等降低,從而導致貧血、出血、免疫機制下降等現象。

白細胞減少癥,為常見血液病,它是指外周血液中白細胞持續低于4×109/L。白細胞是人體防御細菌入侵的巡邏兵。白細胞數減少,就會削弱人體抗菌能力,容易受感染。特別是放、化療、感染患者、風濕病科系統性紅斑狼瘡等使用免疫抑制劑、傳染病科使用抗結核藥物利福平等均能引起的外周血白細胞的減少,從而削弱人體抗菌能力,導致免疫力下降等不良反應。目前,白細胞減少癥主要分為原因不明性和繼發性兩種,前者多見,而后者多是由放療、化療、感染、免疫因素等引起的骨髓損傷而造成。

白細胞減少癥和骨髓抑制都存在白細胞減少這一顯著現象,但是,在用藥時還是存在一定差異,目前,某些具有升白作用的藥物,并不具有骨髓保護的作用,如rhG-CSF具有較強的升白作用,但其對骨髓細胞的損害作用不可忽視。因此,尋找能夠升高白細胞濃度并能有效保護骨髓細胞的藥物顯得十分必要。

地榆為薔薇科植物地榆Sanguisorba?officinalis?L.或長葉地榆Sanguisorbad?officinalis?L.var.longifolia(Bert.)Yu?et?Li的干燥根,具有涼血止血、解毒斂瘡之功效。地榆藥材中含有大量的鞣質類成分(約20%左右),除此之外,還含有皂苷、黃酮等化合物。當前對地榆的大多數研究都圍繞地榆皂苷進行,普遍認為地榆升高白細胞作用以及骨髓保護作用的有效成分為地榆皂苷,國內對地榆升白作用的物質基礎研究認為,地榆皂苷是促進小鼠骨髓細胞體外增殖的主要活性部位,地榆皂苷也能升高骨髓抑制小鼠的白細胞、紅細胞以及血小板數量,而地榆鞣質和地榆黃酮不能促進骨髓細胞增殖,反而在高濃度下會產生骨髓抑制作用(高小平等,地榆促造血作用的有效部位篩選,中國天然藥物,2006年4卷2期)。

目前,對地榆鞣質的藥效研究較為少見,國外有文獻報道稱,地榆鞣質具有抗癌作用[Bastow?kF.Bort?LD.Fukushrma?Y?et?al.Inhibition?of?DNA?topoisomerases?by?sanguim?H-6,a?cytotoxic?dimeric?ella-gitan-ton?from?sanguisorba?officinalis.Planta?Med,1993;59(3):240-245.]。對地榆鞣質的提取也有部分報道,如高小平等,采用70%含水丙酮對地榆進行提取,得到的提取物中鞣質含量為43.86%(中國天然藥物,2006年4卷2期);由于該方法是采用丙酮提取,未經過分離,得到提取物中除含有鞣質外,還含有皂苷類成分,其中皂苷含量經檢測約占15%;王滿力等,也采用氧化鋁柱來對地榆鞣質和地榆皂苷進行分離,最終將兩者分離開(貴州工學院學報,1993年22卷2期)。

目前尚未見將地榆素應用于骨髓保護以及治療白細胞減少癥的相關報道。

發明內容

本發明提供地榆素在制備具有保護骨髓細胞作用的藥物中的用途。

在一種具體的實施方式中,所述地榆素為地榆素含量為100%的化合物。

在本發明另一種具體實施方式中,所述地榆素為含地榆素0.05~3wt%的混合物,優選含地榆素1~2wt%的混合物。在該發明中,優選所述混合物中還包含兒茶素和原花青素B2中的至少一種,更優選所述混合物中還包含兒茶素和原花青素B2。

在一個具體實施例中,所述混合物中兒茶素的含量為1~5wt%,優選為2~5wt%,所述混合物中原花青素B2的含量為0.05~1.5wt%,優選為0.05~0.4wt%。

在上述實施方式中,具體地,所述藥物是預防和/或治療由放療或化療引起的抑制正常骨髓細胞的藥物。或者是,所述藥物是預防和/或治療由放療或化療引起的貧血、白細胞減少癥或血小板減少癥的藥物。

本發明還提供地榆素在制備治療白細胞減少癥的藥物中的用途。

本發明還提供一種預防和/或治療骨髓細胞抑制或白細胞減少癥的藥物組合物,它是由有效量的地榆素加入藥學上可接受的輔料或輔助性成分制備成藥學上常用的制劑,優選所述制劑為口服制劑。

本發明的目的在于提供一種地榆鞣質提取物;本發明的另一目的是提供該地榆鞣質提取物,地榆鞣質中含有的化合物的新用途。

本發明提供了一種地榆鞣質提取物,該提取物中含有鞣質的重量百分含量為35%-98.5%w/w;提取物中地榆總皂苷含量<10%w/w和地榆皂苷Ⅰ的含量<5%w/w。

優選地,一種地榆鞣質提取物,該提取物中含有鞣質的重量百分含量為35%-98.5%w/w;提取物中地榆總皂苷含量<10%w/w和地榆皂苷Ⅰ的含量<5%w/w。

進一步優選地,該提取物中,鞣質的重量百分含量為50%~98.5%。更進一步地,鞣質的重量百分含量為55%~98.5%。

進一步優選地,該提取物中,提取物中地榆總皂苷含量<7.2%w/w、地榆皂苷Ⅰ的含量<4.9%w/w。更進一步優選地,提取物中地榆總皂苷含量<0.001%w/w、地榆皂苷Ⅰ的含量<0.0001%w/w。

進一步地,地榆鞣質中含有地榆素、兒茶素、原花青素B2,其占該提取物中重量百分含量為地榆素0.05%-3.0%w/w,兒茶素1.0%-5.0%w/w,原花青素B2?0.05%-1.5%w/w。進一步優選地,其占該提取物中重量百分含量為地榆素1.0%-2.0%w/w,兒茶素2.0%-4.0%w/w,原花青素B2?0.05%-0.4%w/w。

更進一步地,該提取物中,鞣質的重量百分含量為62%~98.5%。

其中,該提取物來源于薔薇科植物地榆Sanguisorba?officinalis?L.或長葉地榆Sanguisorba?officinalis?L.var.longifolia(Bert.)Yu?et?Li的干燥根。

其中,該提取物是由下述方法制備而成:

(1)提取:取地榆藥材粉碎成粗粉,用水、乙醇、含水乙醇、丙酮或含水丙酮提取后,濾過,濃縮,得濃縮液;

(2)純化:取濃縮液,再經鞣質的常規分離方法處理后,即得地榆鞣質提取物。

其中,所述鞣質的常規分離方法包括色譜法、蛋白質沉淀法、溶劑法、或上述方法的結合。

進一步地,所述色譜法為吸附色譜,優選使用凝膠、大孔吸附樹脂。

進一步地,所述蛋白質沉淀法,優選采用明膠進行沉淀。

進一步地,所述溶劑法,是指將含濃縮液的水溶液脫脂處理后,再用乙酸乙酯提取,即得地榆鞣質提取物;

或將濃縮液溶于乙醇和乙酸乙酯中,加乙醚或石油醚沉淀析出地榆鞣質提取物。

更進一步地,該提取物是由下述方法制備而成:

(1)提取:取地榆藥材粉碎成粗粉,用水、乙醇、10%-90%的含水乙醇、丙酮或50-90%的含水丙酮提取后,濾過,濃縮,得濃縮液;

(2)純化:取濃縮液,采用大孔吸附樹脂進行吸附除雜,先用水洗脫至無色,再用10%乙醇洗脫,最后用60%乙醇洗脫,收集60%乙醇洗脫液,干燥,即得地榆鞣質提取物;或,

取濃縮液,脫脂后,用乙酸乙酯萃取,即得地榆鞣質提取物。

優選地,所述的含水乙醇的濃度為70%;含水丙酮的濃度為70%。

其中,所述大孔吸附樹脂為非極性樹脂或低極性樹脂,優選DA-201、D-101、LSA-20、HP-10或AB-8型大孔吸附樹脂。

本發明還提供了上述地榆鞣質提取物的制備方法,它包括如下操作步驟:

(1)提取:取地榆藥材粉碎成粗粉,用水、乙醇、含水乙醇、丙酮或含水丙酮提取后,濾過,濃縮,得濃縮液;

(2)純化:取濃縮液,再經鞣質的常規分離方法處理后,即得地榆鞣質提取物。

其中,所述鞣質的常規分離方法包括色譜法、蛋白質沉淀法、溶劑法、或上述方法的結合。

進一步地,所述色譜法為吸附色譜,優選使用凝膠、大孔吸附樹脂。

進一步地,所述蛋白質沉淀法,優選采用明膠進行沉淀。

進一步地,所述溶劑法,是指將含濃縮液的水溶液脫脂處理后,再用乙酸乙酯提取,即得地榆鞣質提取物;

或將濃縮液溶于乙醇和乙酸乙酯中,加乙醚或石油醚沉淀析出地榆鞣質提取物。

更進一步地,該提取物是由下述方法制備而成:

(1)提取:取地榆藥材粉碎成粗粉,用水、乙醇、10%-90%的含水乙醇、丙酮或50-90%的含水丙酮提取后,濾過,濃縮,得濃縮液;

(2)純化:取濃縮液,采用大孔吸附樹脂進行吸附除雜,先用水洗脫至無色,再用10%乙醇洗脫,最后用60%乙醇洗脫,收集60%乙醇洗脫液,干燥,即得地榆鞣質提取物;或,

取濃縮液,脫脂后,用乙酸乙酯萃取,即得地榆鞣質提取物。

優選地,所述的含水乙醇的濃度為70%;含水丙酮的濃度為70%。

其中,所述大孔吸附樹脂為非極性樹脂或低極性樹脂,優選DA-201、D-101、LSA-20、HP-10或AB-8型大孔吸附樹脂。

本發明還提供了上述地榆鞣質提取物在制備具有骨髓保護作用的藥物中的用途。

其中,所述的藥物是預防或/和治療骨髓抑制的藥物。

進一步地,所述的藥物是預防或/和治療由放療、化療引起的正常骨髓細胞抑制的藥物。

更進一步地,所述的藥物是預防或/和治療放療或化療引起的貧血、白細胞或血小板減少癥的藥物,優選為預防或/和治療放療、化療引起的白細胞減少癥的藥物。

本發明還提供了上述地榆鞣質提取物在制備治療白細胞減少癥的藥物中的用途。

本發明還提供了地榆素、原花青素B2在制備具有骨髓保護作用的藥物中的用途。

其中,所述的藥物是預防或/和治療骨髓抑制的藥物。

進一步地,所述的藥物是預防或/和治療由放療、化療引起的正常骨髓細胞抑制的藥物。

更進一步地,所述的藥物是預防或/和治療放療或化療引起的貧血、白細胞或血小板減少癥的藥物,優選為預防或/和治療放療、化療引起的白細胞減少癥的藥物。

本發明還提供了地榆素、原花青素B2在制備治療白細胞減少癥的藥物中的用途。

本發明還提供了一種預防或治療骨髓抑制、白細胞減少癥的藥物組合物,它是由有效量的地榆素、原花青素B2或上述的地榆鞣質提取物為活性成分,加入藥學上可接受的輔料或輔助性成分制備成藥學上常用的制劑。

其中,所述的制劑為口服制劑。

本發明還提供了腫瘤化療藥物與上述的地榆鞣質提取物在制備抗腫瘤的聯合用藥物中的用途。

其中,所述的腫瘤化療藥物為烷化劑類抗腫瘤藥。

進一步地,所述的腫瘤化療藥物為環磷酰胺。

本發明還提供了一種抗腫瘤藥物組合物,它是由有效量的腫瘤化療藥物和上述的地榆鞣質提取物為活性成分,加上藥學上可接受的輔料制備而成的制劑。

其中,所述的腫瘤化療藥物為烷化劑類抗腫瘤藥。

進一步地,所述的腫瘤化療藥物為環磷酰胺。

本發明地榆鞣質提取物中活性成分為地榆鞣質,具有保護骨髓造血干細胞的作用,其對化學物質和輻射引起的小鼠骨髓DNA抑制有顯著保護作用,為臨床緩解因放療、化療引起的正常骨髓細胞的抑制提供一種新的用藥選擇。此外,地榆鞣質還能夠升高白細胞,具有明顯的升白作用。本發明地榆鞣質提取物與化療藥物聯合使用時,不但增強了對腫瘤的療效,還可以保護骨髓細胞和全血細胞,降低或避免化療藥物對骨髓細胞和全血細胞的損傷。因此,在采用放療、化療方法治療癌癥前、后,或在治療過程中,均可以采用放、化療手段與本發明地榆鞣質提取物聯合治療的方法,以便減輕或避免放、化療對患者骨髓細胞以及白細胞帶來的損害。

具體實施方式

1、本發明中地榆鞣質含量測定:

照《中國藥典》2010年版一部附錄ⅩB鞣質含量測定項下:

本實驗應避光操作。

對照品溶液的制備:精密稱取沒食子酸對照品50mg,置100ml棕色量瓶中,加水溶解并稀釋至刻度,精密量取5ml,置50ml棕色量瓶中,用水稀釋至刻度,搖勻,即得(每1ml中含沒食子酸0.05mg)。

標準曲線的制備:精密量取對照品溶液0.5ml、1.0ml、2.0ml、3.0ml、4.0ml、5.0ml,分別置25ml棕色量瓶中,各加入磷鉬鎢酸試液1ml,再分別加水11.50ml、11ml、10ml、9ml、8ml、7ml,用29%碳酸鈉溶液稀釋至刻度,搖勻,放置30分鐘以相應的試劑為空白,照紫外-可見光光度法(附錄V?A),在760nm的波長處測定吸光度,以吸光度為縱坐標,濃度為橫坐標,繪制標準曲線。

供試品溶液的制備:取提取物粉末約0.1g,精密稱定,置250ml棕色量瓶中,加水150ml,放置過夜,超聲處理10分鐘,放冷,用水稀釋至刻度,搖勻,靜置(使固體物沉淀),濾過,棄去初濾液50ml,精密量取濾20ml,置100ml棕色量瓶中,用水稀釋至刻度,搖勻,即得。

測定法

總酚:精密量取供試品溶液2ml,置25ml棕色量瓶中,照標準曲線的制備項下的方法,自“加入磷鉬鎢酸試液1ml”起,加水10ml,依法測定吸光度,從標準曲線讀出供試品溶液中沒食子酸的量(mg),計算,即得。

不被吸附的多酚:精密量取供試品溶液25ml,加至已盛有酪素0.6g的100ml具塞錐形瓶中,密塞,置30℃水浴中報溫1小時,時時振搖,取出,放冷,搖勻,濾過,棄去初濾液,精密量取續濾液2ml,置25ml棕色量瓶中,照標準曲線的制備項下的方法,自“加入磷鎢酸試液1ml”起,加水10ml,依法測定吸光度,從標準曲線中讀出供試品溶液中沒食子酸的量(mg),計算,即得。

按下式計算鞣質的含量:鞣質含量=總酚量—不被吸附的多酚量。

2、地榆素、兒茶素、原花青素B2的含量測定方法見參照文獻:地榆多酚的組分分析及功能研究,劉海英,陜西師范大學,2009年。具體測定方法為:

2.1.儀器與試驗材料

2.1.1儀器

Agilent1200高效液相色譜儀(Agilent1200二極管陣列檢測器;四元泵在線脫氣系統;Agilent1200色譜工作站)(美國安捷倫科技有限公司);

Mettler?AE240十萬分之一電子分析天平(德國Mettler公司);

FA1104萬分之一電子分析天平(上海天平儀器廠);

KQ3200型超聲清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)。

2.1.2試藥

原花青素B2(純度:HPLC≥99%);

兒茶素(純度:HPLC≥99%);

地榆素(純度:HPLC≥99%);

甲醇為色譜純,水為重蒸水(自制),其它試劑均為分析純。

2.1.3地榆鞣質提取物

取實施例的方法制備的地榆鞣質提取物。

2.2.供試品溶液制備

取地榆鞣質提取物約1g,精密稱定置100mL容量瓶中,加水90mL,超聲處理(功率250W,頻率20KHz)30min,取出,放冷,加水定容至刻度,濾過,即得。

2.3.色譜條件的研究

2.3.1檢測波長的選擇

為了保證圖譜的最大信息量化,盡可能多地反映地榆組分全貌,采用甲醇:磷酸緩沖鹽二元梯度洗脫,將成分大致分開,柱溫30℃。利用二極管陣列檢測器(DAD)采集各色譜成分在195nm~400nm光譜區的所有色譜光譜信息,比較了各考察波長下的色譜圖中各峰的吸收情況,在265nm下各峰吸收值較大,且基線表現平穩。所以最終確定265nm作為檢測波長。

2.3.2色譜條件

試驗過程中采用了幾種流動相進行試驗,以確定最佳流動相,見表1。

表1?流動相和洗脫程序

時間(分) 甲醇(%) 0.05%磷酸緩沖鹽(%) 0 5 95 80 45 55 90 55 45 91 5 95 100 5 95

2.3.3耐用性考察

取同一批地榆鞣質提取物,分別使用三根不同的品牌和廠家的色譜柱進行試驗,以色譜峰分離度和色譜峰數量為評價指標,考察儀器耐用性。

環球柱在所選色譜條件下,所得色譜圖及各峰分離效果優于其他兩根色譜柱。故綜合考慮,選用環球柱。

通過以上試驗,確定色譜條件為:

環球色譜柱(4.6mm×250mm,5μm);DAD檢測器;甲醇-0.05%磷酸緩沖鹽梯度洗脫程序:0min→80min,甲醇5%→45%,0.05%磷酸緩沖鹽95%→55%;80min→90min,甲醇45%→55%,0.05%磷酸緩沖鹽55%→45%;90min→91min,甲醇55%→5%,0.05%磷酸緩沖鹽45%→95%;91min→100min,甲醇5%→5%,0.05%磷酸緩沖鹽95%→95%;檢測波長265nm;色譜柱溫度30℃;流速1.0ml/min;運行時間:100min。

2.3.4.專屬性研究

照“2”項下方法制備供試品溶液,照“3”項下色譜方法檢測,記錄90min內色譜峰及其保留時間和峰面積。分別精密吸取水溶液、混合對照品溶液10μl,注入高效液相色譜儀,記錄90min色譜,并記錄各對照物質的光譜圖,結果表明,在此條件下空白無干擾。

2.3.5含量測定

3、地榆鞣質提取物中地榆總皂苷和地榆皂苷Ⅰ進行測定,測定方法如下:

1)地榆總皂苷的含量測定方法

對照品溶液制備取5mg地榆皂苷Ⅰ于10ml容量瓶中,加無水乙醇約9ml,超聲溶解,放冷,加無水乙醇定容至刻度,即得(每1ml中含0.5mg)。

標準曲線的制備精密吸取對照品溶液0、200、300、400、500、600、800、1000μl分別置于10ml具塞中試管中,精密加入新配制的8%香草醛乙醇溶液(取香草醛8g,用無水乙醇定容至100ml)1ml,70%硫酸10ml(取70ml硫酸,緩緩注入30ml水中,即得),搖勻,密塞,置60℃水浴15min,放入冰水中冷卻2min,搖勻,以未加對照品的比色液為空白,照分光光度法(附錄VIB),在530nm波長處測定吸收度,以吸收度(A)為縱坐標,濃度(C)為橫坐標,繪制標準曲線。

供試品溶液制備取地榆鞣質提取物約5g,研細,精密稱定,置250ml容量瓶中,加無水乙醇約200ml,超聲提取30min,濾過,收集濾液于250ml容量瓶中,用無水乙醇定容至250ml,即得。

測定精密吸取供試品溶液1ml,置于10ml具塞中試管中,照標準曲線項下的方法依法測定吸收度,代入回歸方程計算,即得。

2)地榆皂苷Ⅰ的含量測定方法研究

色譜條件色譜柱,安捷倫-Zorbax(4.6mm×250mm,5μm);流動相,乙腈:水(32:68);流速,1ml/min;柱溫40℃;蒸發光散射檢測器。

對照品溶液制備取25mg地榆皂苷Ⅰ于25ml容量瓶中,加無水乙醇約20ml,超聲溶解,放冷,加無水乙醇定容刻度,即得(每1ml中含1mg)。

標準曲線的制備精密吸取上述對照品溶液1、2、3、4、5ml,分別置于5ml容量瓶中,加無水乙醇定容至刻度,精密吸取各溶液10μl,照上述色譜條件,進行測定,以峰面積的自然對數(Y)為縱坐標,進樣量的自然對數(X)為橫坐標,繪制標準曲線。

供試品溶液制備取地榆鞣質提取物約5g,研細,精密稱定,置100ml容量瓶中,加無水乙醇約90ml,超聲提取30min,放冷,用無水乙醇定容至刻度,搖勻,0.45μm微孔濾頭濾過,即得。

測定精密吸取供試品溶液10μl,照上述色譜條件,進行測定,代入回歸方程計算,即得。

實施例1:本發明地榆鞣質提取物的制備

取地榆藥材粉碎成粗粉,70%丙酮閃式提取2次,每次2min,溶媒量第一次10倍量,第二次8倍量,合并濾液,減壓濃縮,乙醚與濃縮液1:1體積比萃取脫脂至乙醚層無色,然后用乙酸乙酯與母液1:1體積比萃取富集總酚6次,合并乙酸乙酯,45℃減壓低溫濃縮至適量,45℃減壓干燥,即得。

含量測定結果為:提取物中含鞣質62%,地榆素1.32%,兒茶素2.61%,原花青素B20.08%,地榆皂苷:6.2%、地榆皂苷Ⅰ:3.7%,均為重量百分含量。

實施例2:本發明地榆鞣質提取物的制備

取地榆藥材粉碎成粗粉,70%乙醇回流提取3次,每次2h,溶媒量第一次10倍量,第二次8倍量,第三次6倍量,合并濾液,減壓濃縮,乙醚與濃縮液1:1體積比萃取脫脂至乙醚層無色,然后用乙酸乙酯與母液1:1體積比萃取富集總酚6次,合并乙酸乙酯,45℃減壓低溫濃縮至適量,45℃減壓干燥,即得。

含量測定結果為:提取物中含鞣質65%,地榆素1.41%,兒茶素2.65%,原花青素B20.09%,地榆皂苷:5.4%、地榆皂苷Ⅰ:3.1%,均為重量百分含量。

實施例3:本發明地榆鞣質提取物的制備

取地榆藥材粉碎成粗粉,70%乙醇回流提取3次,每次2h,溶媒量第一次10倍量,第二次8倍量,第三次6倍量,合并濾液,減壓濃縮,乙醚與濃縮液1:1體積比萃取脫脂至乙醚層無色,濃縮液進行大孔樹脂分離,先用水洗脫至無色,再用2倍柱體積的10%乙醇洗脫,最后用2倍柱體積的60%乙醇洗脫,收集60%乙醇洗脫液,55℃減壓濃縮至適量,噴霧干燥,即得。

含量測定結果為:提取物中含鞣質73%,地榆素1.52%,兒茶素2.88%,原花青素B20.11%,地榆皂苷:3.2%、地榆皂苷Ⅰ:1.7%,均為重量百分含量。

實施例4:本發明地榆鞣質提取物的制備

取地榆藥材粉碎成粗粉,70%乙醇回流提取3次,每次2h,溶媒量第一次10倍量,第二次8倍量,第三次6倍量,合并濾液,減壓濃縮,除去沉淀,上清液進行大孔樹脂分離,先用水洗脫至無色,再用2倍柱體積的10%乙醇洗脫,最后用2倍柱體積的60%乙醇洗脫,收集60%乙醇洗脫液,經膜濃縮至適量,然后噴霧干燥,即得。

含量測定結果為:提取物中含鞣質79%,地榆素1.72%,兒茶素3.24%,原花青素B20.13%,地榆皂苷:2.4%、地榆皂苷Ⅰ:1.3%,均為重量百分含量。

實施例5:本發明地榆鞣質提取物的制備

取地榆藥材粉碎成粗粉,水煎煮3次,每次2h,加水第一次10倍量,第二次8倍量,第三次6倍量,合并濾液,減壓濃縮,濃縮至適量,除去沉淀,藥液進行大孔樹脂分離,先用水洗脫至無色,再用2倍柱體積的10%乙醇洗脫,最后用2倍柱體積的60%乙醇洗脫,收集60%乙醇洗脫液,55℃減壓濃縮至適量,然后噴霧干燥,即得。

含量測定結果為:提取物中含鞣質61%,地榆素1.22%,兒茶素2.43%,原花青素B20.07%,地榆皂苷:6.9%、地榆皂苷Ⅰ:4.3%,均為重量百分含量。

實施例6:本發明地榆鞣質提取物的制備

取地榆藥材粉碎成粗粉,水煎煮3次,每次2h,加水第一次10倍量,第二次8倍量,第三次6倍量,合并濾液,減壓濃縮,濃縮至適量,除去沉淀,藥液進行大孔樹脂分離,先用水洗脫至無色,再用2倍柱體積的10%乙醇洗脫,最后用2倍柱體積的60%乙醇洗脫,收集60%乙醇洗脫液,經膜濃縮至適量,然后噴霧干燥,即得。

含量測定結果為:提取物中含鞣質67%,地榆素1.34%,兒茶素2.59%,原花青素B20.08%,地榆皂苷:5.5%、地榆皂苷Ⅰ:3.4%,均為重量百分含量。

實施例7:本發明地榆鞣質提取物的制備

取地榆藥材粉碎成粗粉,70%乙醇閃式提取2次,每次2min,溶媒量第一次10倍量,第二次8倍量,合并濾液,膜濃縮至適量,藥液進行大孔樹脂分離,先用水洗脫至無色,再用2倍柱體積的10%乙醇洗脫,最后用2倍柱體積的60%乙醇洗脫,收集60%乙醇洗脫液,經膜濃縮至適量,然后噴霧干燥,即得。

含量測定結果為:提取物中含鞣質78%,地榆素1.69%,兒茶素3.35%,原花青素B20.13%,地榆皂苷:3.1%、地榆皂苷Ⅰ:1.4%,均為重量百分含量。

實施例8:本發明地榆鞣質提取物的制備

取地榆藥材粗粉,用12倍量水60℃溫浸2次,每次3小時,過濾,合并濾液,濃縮至0.5g生藥/ml,置于離心機內,4000/轉離心10min,取上清液,以流速2BV/h緩緩上樣于D-101型大孔吸附樹脂,徑高比1:5,靜態吸附30min后,用2BV水以2BV/h洗滌,再用1BV10%乙醇以2BV/h洗滌,再用2BV60%乙醇以1BV/h洗滌,收集洗脫液,濃縮,干燥即得。

含量測定結果為:提取物中含有鞣質55%。本發明鞣質提取率高達13%以上。地榆皂苷:7.2%、地榆皂苷Ⅰ:4.9%。

其中,選擇10批該實施例制備的地榆鞣質,測定其中地榆素、兒茶素、原花青素B2的含量,測定結果為:

表2?十批地榆鞣質提取物含量測定

地榆素、兒茶素、原花青素B2的平均含量分別為:1.61%、3.02%、0.12%,均為重量百分含量。

實施例9:本發明地榆鞣質提取物的制備

取地榆藥材粉碎成粗粉,水煎煮2次,每次1.5h,加水第一次10倍量,第二次8倍量,合并濾液,減壓濃縮,濃縮至適量,除去沉淀,藥液進行大孔樹脂分離,先用水洗脫至無色,再用2倍柱體積的10%乙醇洗脫,最后用3倍柱體積的60%乙醇洗脫,收集60%乙醇洗脫液,減壓濃縮至適量,然后噴霧干燥,加水溶解,放置1h,濾過沉淀,濾液置于蒸發皿中,緩慢噴入明膠溶液,放置1h,收集沉淀,冷凍干燥12h后取出,研磨成細分,用90%丙酮解析2h,藥液于45℃減壓回收丙酮至完全,倒出濃縮液,冷凍干燥12h,即得、高純度的地榆鞣質,鞣質含量為98.5%。

1、地榆素、兒茶素、原花青素B2的含量為:地榆素2.29%,兒茶素4.85%,原花青素B2?0.38%

2、鞣質含量測定

照《中國藥典》2010年版一部附錄ⅩB鞣質含量測定項下:

本實驗應避光操作。

對照品溶液的制備:精密稱取沒食子酸對照品48.30mg,置100ml棕色量瓶中,加水溶解并稀釋至刻度,精密量取5ml,置50ml棕色量瓶中,用水稀釋至刻度,搖勻,即得(每1ml中含沒食子酸0.0483mg)。

標準曲線的制備:精密量取對照品溶液0.5ml、1.0ml、2.0ml、3.0ml、4.0ml、5.0ml,分別置25ml棕色量瓶中,各加入磷鉬鎢酸試液1ml,再分別加水11.50ml、11ml、10ml、9ml、8ml、7ml,用29%碳酸鈉溶液稀釋至刻度,搖勻,放置30分鐘以相應的試劑為空白,照紫外-可見光光度法(附錄V?A),在760nm的波長處測定吸光度,以吸光度為縱坐標,濃度為橫坐標,繪制標準曲線。

供試品溶液的制備:取三份提取物粉末0.101、0.105、0.997g,精密稱定,置250ml棕色量瓶中,加水150ml,放置過夜,超聲處理10分鐘,放冷,用水稀釋至刻度,搖勻,靜置(使固體物沉淀),濾過,棄去初濾液50ml,精密量取濾20ml,置100ml棕色量瓶中,用水稀釋至刻度,搖勻,即得。

測定法

總酚:精密量取供試品溶液2ml,置25ml棕色量瓶中,照標準曲線的制備項下的方法,自“加入磷鉬鎢酸試液1ml”起,加水10ml,依法測定吸光度,從標準曲線讀出供試品溶液中沒食子酸的量(mg),計算,即得。

不被吸附的多酚:精密量取供試品溶液25ml,加至已盛有酪素0.6g的100ml具塞錐形瓶中,密塞,置30℃水浴中報溫1小時,時時振搖,取出,放冷,搖勻,濾過,棄去初濾液,精密量取續濾液2ml,置25ml棕色量瓶中,照標準曲線的制備項下的方法,自“加入磷鎢酸試液1ml”起,加水10ml,依法測定吸光度,從標準曲線中讀出供試品溶液中沒食子酸的量(mg),計算,即得。

按下式計算鞣質的含量:鞣質含量=總酚量-不被吸附的多酚量。

3、地榆鞣質提取物中地榆總皂苷和地榆皂苷I的測定:

測定3批地榆鞣質提取物,結果HPLC分析完全檢測不到地榆皂苷Ⅰ的峰,紫外測定地榆總皂苷含量其吸光度為0.001,可推斷,地榆總皂苷含量<0.001%和地榆皂苷Ⅰ的含量<0.0001%。因此,當鞣質含量為98%以上時,地榆總皂苷和地榆皂苷Ⅰ的含量幾乎為零。

批號 地榆總皂苷(%) 地榆皂苷Ⅰ(%) 20100609 <0.001 <0.0001 20100613 <0.001 <0.0001

20100617 <0.001 <0.0001

結合實施例1-9中對地榆素、兒茶素、原花青素B2的測定結果可知,本發明地榆鞣質提取物中地榆素、兒茶素、原花青素B2的含量較為穩定,其占該提取物中重量百分含量為地榆素0.05%-3.0%w/w,兒茶素1.0%-5.0%w/w,原花青素B20.05%-1.5%w/w。進一步優選地,提取物中地榆素、兒茶素、原花青素B2的含量分別為1.0-2.0%w/w,兒茶素2.0-4.0%w/w,原花青素B20.05-0.4%w/w。

實施例10:大孔樹脂純化地榆鞣質的優化工藝考察

1樹脂種類的考察

1.1試驗方法大孔樹脂經晾干后,分別稱取15g,放入100ml具塞錐形瓶中,分別加入2%鹽酸50ml浸泡3h,然后用水沖洗至PH為中性,再分別加入2%NaOH溶液50ml浸泡3h,然后用水沖洗至PH為中性,分別加入60ml95%醇使其活化。分別量取地榆鞣質提取液(0.33g/ml)50ml置于已活化的裝有大孔樹脂的具塞錐形瓶中,使藥液完全浸沒大孔樹脂,使其浸泡24h。然后測定錐形瓶中剩余藥液中體積,確定大孔樹脂的吸附量;取出錐形瓶中大孔樹脂,用95%乙醇浸泡超聲1h,然后測定洗脫液中鞣質的含量,再根據吸附前后藥液鞣質含量確定其洗脫率。

最大吸附量=(吸附前鞣質含量-吸附后鞣質含量)/大孔樹脂質量

洗脫率=洗脫液中鞣質含量/(吸附前藥液鞣質含量-吸附后藥液鞣質含量)

根據DA-201、D-101、LSA-20、HP-10及AB-8五種大孔樹脂的最大吸附量、洗脫率確定樹脂種類。

1.2試驗結果試驗數據見表3。

表3?樹脂種類的篩選試驗

通過以上試驗,可確定,大孔樹酯對地榆鞣質具有較好地吸附、洗脫能力,因此,可以選擇大孔樹脂來進行鞣質的純化,本發明中選用D-101為優選樹脂。

2D-101大孔樹脂滲漏曲線的考察

將預處理的D-101大孔樹脂20g裝柱,柱體積為30.4cm3,徑高比為1:4,用地榆鞣質提取液60ml(0.33g生藥材/ml)動態法上樣,控制流速為0.77ml/min,使其恒定,從柱底收集流出液,每瓶收集5ml,共收集11瓶,測定各份流出液中鞣質含量。進而確定大孔樹脂的滲漏曲線。以體積為橫坐標,鞣質含量為縱坐標繪制大孔樹脂的滲漏曲線。

從每瓶中精密移取1ml,加水稀釋至100ml,精密量取供試品溶液2ml,置25ml棕色量瓶中,加入磷鉬鎢酸試液1ml,加水10ml,然后用29%碳酸鈉溶液定容至刻度,靜置30min后測定吸收值,從標準曲線中讀出供試品溶液中沒食子酸的量(mg)計算,即得。

表4?D-101大孔樹脂滲漏曲線數據

綜上,藥液在30ml后開始滲漏。最佳的上樣體積為30ml,藥液濃度為0.33g/ml生藥材,大孔樹脂的用量為20g,因此,最佳藥材與大孔樹脂的用量比為1:2。

3洗脫曲線的考察

取0.33g生藥材/ml的地榆鞣質提取液60ml,然后取篩選出的D-101大孔樹脂20g上柱,上樣流速控制恒定,柱體積為30.4cm3,徑高比為1:4,吸附1h,使其飽和,分別用1倍柱體積的水、10%乙醇、30%乙醇、50%乙醇、70%乙醇、90%乙醇進行洗脫,控制流速恒定,收集洗脫液,測定其鞣質的含量,比較不同洗脫劑濃度對大孔樹脂吸附的影響。

取洗脫液0.5ml,稀釋至100ml,精密量取供試品溶液2ml,置25ml棕色量瓶中,加入磷鉬鎢酸試液1ml,加水10ml,然后用29%碳酸鈉溶液定容至刻度,靜置30min后測定吸收值,從標準曲線中讀出供試品溶液中沒食子酸的量(mg)計算,即得。試驗數據見表5。

表5?不同洗脫溶劑對洗脫曲線的影響

綜合考慮洗脫曲線與實際生產成本,選用60%乙醇對鞣質進行洗脫。

4均勻設計優化工藝參數

以鞣質含量、轉移率及總評歸一值(OD值)為評價指標,采用U5(54)均勻設計表考察徑高比、藥液濃度、流速、60%醇用量5個水平對鞣質純化效果的影響。均勻設計表安排各因素、水平如表6,試驗數據如表7:

表6?均勻設計因素水平表

表7?均勻設計試驗數據表

經spss17.0軟件分析結果,主要輸出結果顯示選入了x3,R2=0.85,方差分析顯示F=16.192,P=0.026,逐步回歸有統計學意義。

Anovab

a.預測變量:(常量),x3。

b.因變量:y

方程系數,x3的偏回歸系數t統計量=-4.112,單側P=0.026,應保留,即回歸方程為y=1.092-0.172x3,因回歸方程x3項為負號,且不含x1,x2,x4項,故x3應取試驗范圍最小值。根據實際可取x1=1:5,x2=2,x4=0.5。最優點的近似估計為:x3=1,即,最佳工藝參數為:徑高比1:5、藥液濃度0.5、流速1BV/h、60%醇用量2倍。

系數a

a.因變量:y

5大孔吸附樹脂純化地榆鞣質工藝驗證試驗

按照上述最佳工藝,其OD值預測值為0.92,對該結果進行驗證。

表8?工藝驗證(HPLC)

結果表明,純化工藝結果較穩定。

6小結

根據以上實驗結果,擬定地榆純化條件為:取地榆提取液,濃縮至0.5g生藥/ml,置于離心機內,4000/轉離心10min,取上清液,以流速2BV/h緩緩上樣于D-101型大孔吸附樹脂,徑高比1:5,靜態吸附30min后,用2BV水以2BV/h洗滌,再用1BV10%乙醇以2BV/h洗滌,再用2BV60%乙醇以1BV/h洗滌,收集洗脫液,濃縮,干燥即得。

在應用過程中,也可以選擇其他大孔吸附樹脂對地榆鞣質進行純化。現有技術報道的地榆鞣質提取方法的得率低,均在10%以下;本發明方法提取率高,達13%以上。

以下通過具體藥效學試驗證明本發明的有益效果。

試驗例1?本發明地榆鞣質骨髓保護作用

1、地榆鞣質提取物

取實施例9制備的高純度地榆鞣質,鞣質含量為98.5%。

2、地榆鞣質對化學物質引起的骨髓抑制藥效研究

2.1實驗材料

KM小鼠(♀各半,18~22g,清潔級,合格證號:SCXK(川)2004-15,購自于四川省醫學科學院實驗動物研究所);全自動血球計數儀(MEK-6318,購自于日本光電工業株式會社);電子分析天平(BP211D,購自于德國賽多利斯公司);酶標儀;高純度地榆鞣質(鞣質含量98%以上);注射用環磷酰胺;重組人粒細胞集落刺激因子(rhG-CSF,75μg);生理鹽水。

2.2實驗方法

2.2.1分組與給藥

本實驗動物飼養于成都中醫藥大學藥理實驗動物觀察室,于實驗開始前適應環境3天,正常給予飲食和水。將60只小鼠按性別分層完全隨機分為6組(具體分組與給藥情況見表9,于造模前預防ig給藥3d。第4d除空白組ip給予等體積生理鹽水外,其余各組按小鼠當日體重ip環磷酰胺100mg/kg·d,連續3d。除西藥陽性組外,從造模當日起繼續ig給藥6d。第7~9天皮下注射rhG-CSF。

表9?動物分組與給藥劑量

2.2.2評價指標與數據處理

在造模后第7d眼眶采血,采用全自動血球計數儀檢測外周血常規參數,包括白細胞WBC數,紅細胞RBC,血紅蛋白HGB,血小板PLT,同時取脾臟稱重,計算脾臟系數。處死上述小鼠,取左側完整股骨,除凈軟組織,用0.005mol/L?CaCl2?10mL將全部骨髓沖入試管中,置4℃冰箱30min,2500r/min離心15min,棄去上清,將沉淀物加0.2mol/L?HClO4?5mL充分混勻,90℃加熱15min,放冷后3500r/min離心10min,取上清,用酶標儀于260nm波長處測定OD值。

實驗數據以mean±S.D.表示,采用SPSS軟件,統計檢驗用成組t檢驗和單因素F檢驗,檢驗水平α=0.05。

2.2.3結果分析

地榆鞣質對環磷酰胺所致小鼠外周血象的白細胞、紅細胞、血小板減少及脾臟系數的影響見表10。小鼠腹腔注射環磷酰胺可使外周血白細胞、紅細胞、血紅蛋白和血小板數明顯降低,脾臟系數、骨髓DNA含量明顯降低,與空白組比較有統計學差異。與模型組比較,地榆鞣質高、中、低劑量組以及rhG-CSF可明顯升高白細胞數(P<0.05),提高脾臟系數;地榆鞣質高劑量組可明顯升高外周紅細胞數與血小板數,地榆鞣質與rhG-CSF對血紅蛋白含量影響不大;地榆鞣質高劑量組可明顯升高骨髓DNA含量(P<0.05),而rhG-CSF對骨髓DNA含量反而起到損害作用。

表10?地榆鞣質對化學物質引起的骨髓抑制藥效研究(mean±S.D.,n=10)

Δ:與模型組比P<0.05;

由上述實驗可知,rhG-CSF具有較強的升白作用,可使白細胞數顯著高過正常組(P<0.05),但rhG-CSF沒有保護骨髓作用,還通過刺激加速骨髓細胞分化,進一步加重造血干細胞的負荷,這是其骨痛等副作用發生的原因之一。rhG-CSF是調節骨髓中粒系造血的主要細胞因子之一,對放化療所致的白細胞、紅細胞和血小板減少癥有顯著治療作用,其升白機理為選擇性作用于粒系造血祖細胞,直接促進其增殖、分化,并可增加粒系終末分化細胞的功能,從而使白細胞快速升高。

本發明地榆鞣質對化學物質環磷酰胺所致的小鼠骨髓抑制,包括外周血白細胞、紅細胞、血紅蛋白和血小板數明顯降低、骨髓DNA含量減少均有顯著保護作用(P<0.05),且呈現一定量效關系:高>中>低。本發明制備得到的地榆鞣質純度高達98%以上,試驗證明,地榆鞣質對化學物質所致的骨髓抑制以及白細胞、紅細胞和血小板減少癥具有明顯的治療作用。

3、地榆鞣質對輻射引起的骨髓抑制藥效研究

3.1實驗材料

KM小鼠(♀各半,18~22g,清潔級,合格證號:SCXK(川)2004-15,購自于四川省醫學科學院實驗動物研究所);全自動血球計數儀(MEK-6318,購自于日本光電工業株式會社);電子分析天平(BP211D,購自于德國賽多利斯公司);酶標儀;地榆鞣質(鞣質含量98%以上);鈷60射線外照機;重組人粒細胞集落刺激因子(rhG-CSF,75μg);生理鹽水。

3.2實驗方法

3.2.1分組與給藥

本實驗動物飼養于成都中醫藥大學藥理實驗動物觀察室,于實驗開始前適應環境3天,正常給予飲食和水。將60只小鼠按性別分層完全隨機分為6組(具體分組與給藥情況同“地榆鞣質對化學物質引起的骨髓抑制藥效研究”內容),于造模前預防ig給藥3d。第4d除了正常組,其余各組均置于分隔好的圓形塑料盒中,以盒蓋為中心定距離,用鈷60射線一次性全身照射7.5Gy,劑量率為82.6cGy/min,照射距離80cm。除西藥陽性組外,從造模當日起繼續ig給藥6d。第7~9天皮下注射rhG-CSF。

3.2.2評價指標與數據處理

本實驗采用白細胞WBC數為觀察指標。

實驗數據以mean±S.D.表示,采用SPSS軟件,統計檢驗用成組t檢驗和單因素F檢驗,檢驗水平α=0.05。

3.3結果分析

地榆鞣質對鈷射線所致小鼠骨髓抑制的影響見表11。

表11?地榆鞣質對鈷射線所致小鼠骨髓抑制的影響(mean±S.D.,n=10)

Δ:P<0.05,與模型組比較;另,地榆鞣質也對紅細胞、血小板等有升高趨勢(P<0.05)。

由結果可知,rhG-CSF具有極強的升白作用,可使白細胞數顯著高過正常組(P<0.05),但是,與“地榆鞣質對化學物質引起的骨髓抑制藥效研究”相同,給予rhG-CSF組的骨髓DNA含量反而呈降低趨勢。

地榆鞣質對化學物質所致小鼠骨髓DNA含量減少以及白細胞降低均有顯著保護作用(P<0.05),且呈現一定量效關系:高>中>低。本發明地榆鞣質純度高于98%以上,試驗證明,地榆鞣質對輻射引起的骨髓抑制以及白細胞、紅細胞和血小板減少癥具有明顯的治療作用。

試驗例2?本發明地榆鞣質及其組分的藥效研究

有文獻報道稱地榆鞣質中含有地榆素、兒茶素、原花青素B2、沒食子兒茶素、兒茶素沒食子酸酯、表兒茶素、表沒食子兒茶素沒食子酸酯(地榆多酚的組分分析及功能研究,劉海英,陜西師范大學,2009年),因此,設計以下實驗以揭示本發明地榆鞣質中的主要活性物質,并與單一化合物進行活性的對比。

1、地榆鞣質及其組分對化學物質引起的骨髓抑制藥效研究

1.1實驗材料

KM小鼠(♀各半,18~22g,清潔級,合格證號:SCXK(川)2004-15,購自于四川省醫學科學院實驗動物研究所);全自動血球計數儀(MEK-6318,購自于日本光電工業株式會社);電子分析天平(BP211D,購自于德國賽多利斯公司);酶標儀;注射用環磷酰胺;重組人粒細胞集落刺激因子(rhG-CSF,75μg);生理鹽水;高純度地榆鞣質(實施例9制得,鞣質含量98%以上);地榆素(HPLC>99%);兒茶素(HPLC>99%);原花青素B2(HPLC>99%);沒食子兒茶素(HPLC>99%);兒茶素沒食子酸酯(HPLC>99%);表兒茶素(HPLC>99%);表沒食子兒茶素沒食子酸酯(HPLC>99%),上述單體化合物均購買于成都普瑞法科技有限公司。

1.2實驗方法

1.2.1分組與給藥

本實驗動物飼養于成都中醫藥大學藥理實驗動物觀察室,于實驗開始前適應環境3天,正常給予飲食和水。將110只小鼠按性別分層完全隨機分為11組(具體分組與給藥情況見表12),于造模前預防ig給藥3d。第4d除空白組ip給予等體積生理鹽水外,其余各組按小鼠當日體重ip環磷酰胺100mg/kg·d,連續3d。除西藥陽性組外,從造模當日起繼續ig給藥6d。第7~9天皮下注射rhG-CSF。

表12?動物分組與給藥劑量

1.2.2評價指標與數據處理

本實驗采用白細胞WBC數為觀察指標。

實驗數據以mean±S.D.表示,采用SPSS軟件,統計檢驗用成組t檢驗和單因素F檢驗,檢驗水平α=0.05。

1.2.3結果分析

表13?地榆鞣質及其組分對化學物質引起的骨髓抑制藥效研究(mean±S.D.,n=10)

Δ:P<0.05,與模型組比較;

:P<0.05,地榆鞣質與兒茶素比較;另,地榆鞣質也對紅細胞、血小板等有升高趨勢(P<0.05)。

上述實驗結果證明,地榆鞣質中所含的兒茶素、地榆素、沒食子兒茶素、兒茶素沒食子酸酯等組分,均對環磷酰胺所致的小鼠骨髓抑制有一定治療作用,其中地榆素、兒茶素、原花青素B2有顯著性作用(P<0.05),且地榆素藥效最強,兒茶素次之,原花青素B2稍弱。此外,相同劑量下,地榆鞣質的作用較地榆素、兒茶素等組分強,揭示各組分之間有協同作用。

2、地榆鞣質及其組分對輻射引起的骨髓抑制藥效研究

2.1實驗材料

KM小鼠(♀各半,18~22g,清潔級,合格證號:SCXK(川)2004-15,購自于四川省醫學科學院實驗動物研究所);全自動血球計數儀(MEK-6318,購自于日本光電工業株式會社);電子分析天平(BP211D,購自于德國賽多利斯公司);酶標儀;鈷60射線外照機;重組人粒細胞集落刺激因子(rhG-CSF,75μg);生理鹽水;高純度地榆鞣質(實施例9制得,鞣質含量98%以上);地榆素(HPLC>99%);兒茶素(HPLC>99%);原花青素B2(HPLC>99%);沒食子兒茶素(HPLC>99%);兒茶素沒食子酸酯(HPLC>99%);表兒茶素(HPLC>99%);表沒食子兒茶素沒食子酸酯(HPLC>99%)。

2.2實驗方法

2.2.1分組與給藥

本實驗動物飼養于成都中醫藥大學藥理實驗動物觀察室,于實驗開始前適應環境3天,正常給予飲食和水。將110只小鼠按性別分層完全隨機分為11組(具體分組與給藥情況同“地榆鞣質及其組分對化學物質引起的骨髓抑制藥效研究”內容),于造模前預防ig給藥3d。第4d除了正常組,其余各組均置于分隔好的圓形塑料盒中,以盒蓋為中心定距離,用鈷60射線一次性全身照射7.5Gy,劑量率為82.6cGy/min,照射距離80cm。除西藥陽性組外,從造模當日起繼續ig給藥6d。第7~9天皮下注射rhG-CSF。

2.2.2評價指標與數據處理

同試驗例1。

2.3結果分析

表14?地榆鞣質及其組分對輻射引起的骨髓抑制藥效研究(mean±S.D.,n=10)

Δ:P<0.05,與模型組比較;

:P<0.05,地榆鞣質與兒茶素比較;另,地榆鞣質提取物也對紅細胞、血小板等有升高趨勢(P<0.05)。

實驗證明,地榆鞣質中所含的兒茶素、地榆素、沒食子兒茶素、兒茶素沒食子酸酯等組分,均對輻射所致的小鼠骨髓抑制有一定治療作用,其中地榆素、兒茶素、原花青素B2有顯著性作用(P<0.05),且地榆素藥效最強,原花青素B2次之,兒茶素稍弱。此外,相同劑量下,地榆鞣質的作用較地榆素、兒茶素、原花青素B2等組分強,各組分之間有協同作用。

綜上,地榆鞣質對化學損傷和輻射損傷所造成的骨髓抑制和白細胞、紅細胞、血小板減少的主要活性成分為地榆素、原花青素B2、兒茶素,其中地榆素對兩種模型治療作用均較強,而兒茶素和原花青素B2各有側重,兒茶素對化學損傷保護作用較好,原花青素B2側重于對物理損傷的保護。通過上述研究也表明了,地榆鞣質各組分之間有協同作用。

上述實驗充分說明,地榆鞣質能夠對抗由化學損傷和輻射損傷所造成的骨髓抑制,以及由此引起的白細胞、紅細胞、血小板減少,可以預見因其對骨髓的保護作用使得其與抗腫瘤藥物聯合使用時,具有極樂觀的臨床應用前景。

由于現有技術均認為地榆皂苷為升高白細胞的活性物質,發明人謹慎地進行了一系列實驗,對地榆升白作用的物質基礎作了進一步研究。

試驗例3?本發明地榆鞣質升白作用的物質基礎研究

1、實驗材料

KM小鼠(♀各半,18~22g,清潔級,合格證號:SCXK(川)2004-15,購自于四川省醫學科學院實驗動物研究所);全自動血球計數儀(MEK-6318,購自于日本光電工業株式會社);電子分析天平(BP211D,購自于德國賽多利斯公司);酶標儀;高純度地榆鞣質(鞣質含量98%以上,實施例9制備);注射用環磷酰胺;重組人粒細胞集落刺激因子(rhG-CSF,75μg);生理鹽水。

2、實驗方法

2.1分組與給藥

本實驗動物飼養于成都中醫藥大學藥理實驗動物觀察室,于實驗開始前適應環境3天,正常給予飲食和水。將70只小鼠按性別分層完全隨機分為7組(具體分組與給藥情況見表15),于造模前預防ig給藥3d。第4d除空白組ip給予等體積生理鹽水外,其余各組按小鼠當日體重ip環磷酰胺100mg/kg·d,連續3d。除西藥陽性組外,從造模當日起繼續ig給藥6d。第7~9天皮下注射rhG-CSF。

表15?動物分組與給藥劑量

2.3評價指標與數據處理

本實驗采用白細胞WBC數為觀察指標。

實驗數據以mean±S.D.表示,采用SPSS軟件,統計檢驗用成組t檢驗和單因素F檢驗,檢驗水平α=0.05。

3、結果分析

通過表16白細胞數WBC實驗結果分析可知,①空白組與模型組之間有顯著性差異(P<0.05),說明環磷酰胺致小鼠白細胞減少癥的動物模型造模成功。②地榆鞣質高、低劑量組、陽性組與模型組之間有顯著性差異(P<0.05),說明地榆鞣質對環磷酰胺致小鼠白細胞減少癥有良好治療作用;其余給藥組與模型組之間無顯著性差異(P>0.05),其余給藥組對環磷酰胺致小鼠白細胞減少癥無治療作用③地榆鞣質的藥效強度呈現明顯量效關系:高劑量>低劑量(P<0.05)。

表16?白細胞數WBC實驗結果(mean±S.D.,n=10)

Δ:與模型組比P<0.05

:與除鞣質組比P<0.05

試驗例4?本發明地榆鞣質提取物升白作用的物質基礎研究

1、實驗材料

KM小鼠(♀各半,18~22g,清潔級,合格證號:SCXK(川)2004-15,購自于四川省醫學科學院實驗動物研究所);全自動血球計數儀(MEK-6318,購自于日本光電工業株式會社);電子分析天平(BP211D,購自于德國賽多利斯公司);酶標儀;地榆鞣質提取物(實施例8所制,提取物中含有鞣質55%,地榆素、兒茶素、原花青素B2的含量分別為:1.61%、3.02%、0.12%,均為重量百分含量。地榆皂苷的百分含量為7.2%、地榆皂苷Ⅰ為4.9%);注射用環磷酰胺;重組人粒細胞集落刺激因子(rhG-CSF,75μg);生理鹽水。

2、實驗方法

2.1分組與給藥

本實驗動物飼養于成都中醫藥大學藥理實驗動物觀察室,于實驗開始前適應環境3天,正常給予飲食和水。將70只小鼠按性別分層完全隨機分為7組(具體分組與給藥情況見表17),于造模前預防ig給藥3d。第4d除空白組ip給予等體積生理鹽水外,其余各組按小鼠當日體重ip環磷酰胺100mg/kg·d,連續3d。除西藥陽性組外,從造模當日起繼續ig給藥6d。第7~9天皮下注射rhG-CSF。

表17?動物分組與給藥劑量

2.3評價指標與數據處理

本實驗采用白細胞WBC數為觀察指標。

實驗數據以mean±S.D.表示,采用SPSS軟件,統計檢驗用成組t檢驗和單因素F檢驗,檢驗水平α=0.05。

3、結果分析

通過表18白細胞數WBC實驗結果分析可知,①空白組與模型組之間有顯著性差異(P<0.05),說明環磷酰胺致小鼠白細胞減少癥的動物模型造模成功。②地榆鞣質高、低劑量組、陽性組與模型組之間有顯著性差異(P<0.05),說明地榆鞣質對環磷酰胺致小鼠白細胞減少癥有良好治療作用;其余給藥組與模型組之間無顯著性差異(P>0.05),其余給藥組對環磷酰胺致小鼠白細胞減少癥無治療作用③地榆鞣質的藥效強度呈現明顯量效關系:高劑量>低劑量(P<0.05)。

表18?白細胞數WBC實驗結果(mean±S.D.,n=10)

Δ:與模型組比P<0.05

:與除鞣質組比P<0.05

4、結論

試驗例3和試驗例4的試驗表明,本發明地榆鞣質提取物對環磷酰胺致小鼠白細胞減少癥有顯著的治療作用(P<0.05),與此同時,采用明膠除去地榆鞣質提取物中的鞣質成分后,無治療效果,進一步證明地榆鞣質是治療白細胞減少癥的有效成分。

試驗例5地榆皂苷升白以及骨髓保護作用研究

1實驗材料

KM小鼠(♀各半,18~22g,清潔級,合格證號:SCXK(川)2004-15,購自于四川省醫學科學院實驗動物研究所);全自動血球計數儀(MEK-6318,購自于日本光電工業株式會社);電子分析天平(BP211D,購自于德國賽多利斯公司);酶標儀;地榆皂苷提取物(98.18%);注射用環磷酰胺;重組人粒細胞集落刺激因子(rhG-CSF,75μg);生理鹽水。

地榆皂苷的制備:取地榆藥材粉碎成粗粉,70%乙醇回流提取3次,每次1.5h,70℃減壓濃縮藥液至適量(無乙醇味),轉移至分液漏斗,先用水飽和的乙醚脫脂2次,母液70℃減壓回收混入的乙醚,然后加水定溶至,再用水飽和的正丁醇萃取2次,萃取液80℃減壓濃縮,加一定濃度的乙醇將固形物溶解,轉移至燒杯中,加水適量,調pH至10-14,放置,離心,取出沉淀,70℃真空干燥2h,轉移至具塞三角瓶中,加無水乙醇超聲提取,濾過,濾液70℃減壓回收乙醇至剛有固形物析出,轉移至蒸發皿中,80℃水浴揮干乙醇,70℃真空干燥12h,取出,研磨,即得。地榆皂苷含量98.18%。

2實驗方法

2.1分組與給藥

本實驗動物飼養于成都中醫藥大學藥理實驗動物觀察室,于實驗開始前適應環境3天,正常給予飲食和水。將60只小鼠按性別分層完全隨機分為6組(具體分組與給藥情況見表19),于造模前預防ig給藥3d。第4d除空白組ip給予等體積生理鹽水外,其余各組按小鼠當日體重ip環磷酰胺100mg/kg·d,連續3d。除西藥陽性組外,從造模當日起繼續ig給藥6d。第7~9天皮下注射rhG-CSF。

表19?動物分組與給藥劑量

2.2評價指標與數據處理

在造模后第7d眼眶采血,采用全自動血球計數儀檢測外周血常規參數,包括白細胞WBC數,紅細胞RBC,血紅蛋白HGB,血小板PLT,同時取脾臟稱重,計算脾臟系數。處死上述小鼠,取左側完整股骨,除凈軟組織,用0.005mol/L?CaCl2?10mL將全部骨髓沖入試管中,置4℃冰箱30min,2500r/min離心15min,棄去上清,將沉淀物加0.2mol/L?HClO4?5mL充分混勻,90℃加熱15min,放冷后3500r/min離心10min,取上清液,用酶標儀于260nm波長處測定OD值。

實驗數據以mean±S.D.表示,采用SPSS軟件,統計檢驗用成組t檢驗和單因素F檢驗,檢驗水平α=0.05。

2.3結果分析

地榆皂苷提取物對環磷酰胺所致小鼠外周血象的白細胞、紅細胞、血小板減少及脾臟系數的影響見表20。與模型組比較,地榆皂苷提取物高、中、低劑量組均無明顯升高白細胞數(P>0.05),對環磷酰胺所致的小鼠骨髓抑制無明顯治療作用(P>0.05)。

表20?地榆皂苷提取物的藥效研究(mean±S.D.,n=10)

Δ:與模型組比P>0.05

目前普遍認為“地榆升高白細胞作用以及骨髓保護作用的有效成分為地榆皂苷,地榆皂苷能升高骨髓抑制小鼠的白細胞、紅細胞以及血小板數量,而地榆鞣質和地榆黃酮不能促進骨髓細胞增殖,反而在高濃度下會產生骨髓抑制作用”,在生產制備地榆提取物時,當然以獲得地榆皂苷為目標,然而,發明人通過上述實驗,卻意外地發現,地榆中升高白細胞的活性成分,并不是地榆皂苷,而是地榆鞣質。

試驗例6地榆鞣質以及地榆皂苷對腫瘤影響試驗

1實驗材料

C57小鼠(♀各半,18~22g,購自于四川省醫學科學院實驗動物研究所);全自動血球計數儀(MEK-6318,購自于日本光電工業株式會社);電子分析天平(BP211D,購自于德國賽多利斯公司);注射用環磷酰胺;地榆鞣質提取物(實施例9制得,鞣質含量98%以上);生理鹽水。

路易斯肺癌瘤株混懸液:選擇接種瘤細胞后7天的小鼠脫頸處死,無菌抽取腹水,離心,去除上清液,取下層瘤細胞用生理鹽水稀釋成250mg/ml的瘤細胞液。

地榆皂苷的制備:取地榆藥材粉碎成粗粉,70%乙醇回流提取3次,每次1.5h,70℃減壓濃縮藥液至適量(無乙醇味),轉移至分液漏斗,先用水飽和的乙醚脫脂2次,母液70℃減壓回收混入的乙醚,然后加水定溶,再用水飽和的正丁醇萃取2次,萃取液80℃減壓濃縮,加一定濃度的乙醇將固形物溶解,轉移至燒杯中,加水適量,調pH至10-14,放置,離心,取出沉淀,70℃真空干燥2h,轉移至具塞三角瓶中,加無水乙醇超聲提取,濾過,濾液70℃減壓回收乙醇至剛有固形物析出,轉移至蒸發皿中,80℃水浴揮干乙醇,70℃真空干燥12h,取出,研磨,即得。地榆皂苷含量98.18%。

2分組與給藥

本實驗動物飼養于成都中醫藥大學藥理實驗動物觀察室,于實驗開始前適應環境3天,正常給予飲食和水。取C57小鼠60只,按體重隨機分成模型組、環磷酰胺組、地榆鞣質組、地榆鞣質+環磷酰胺組、地榆皂苷組、地榆皂苷+環磷酰胺組共6組(具體分組與給藥情況見表21)。各組動物通過腋下皮下注射的方式接種0.2ml路易斯腫瘤株混懸液,造模1次。除給予環磷酰胺通過ip.的方式給藥外,各組動物按照每10g體重給予0.2ml藥液的方式灌胃給藥,模型組給予相應的生理鹽水,連續給藥14天。

表21?動物分組與給藥劑量

3評價指標與數據處理

各組動物于第15天處死,切取動物腋下腫瘤,稱重,記錄腫瘤抑制率。實驗數據以mean±S.D.表示,采用SPSS軟件,統計檢驗用成組t檢驗和單因素F檢驗,檢驗水平α=0.05。

抑瘤率(%)=[模型組平均(瘤重/體重)-實驗組平均(瘤重/體重)]/模型組平均(瘤重/體重)×100%

4結果分析

表22?地榆鞣質以及地榆皂苷對腫瘤影響試驗

Δ:與模型組比P<0.05

雖然文獻報道了地榆皂苷具有抗腫瘤的作用,但從上述實驗結果可以看出,地榆皂苷組對腫瘤沒有抑制作用,反而有刺激腫瘤生長的副作用,而且,地榆皂苷與環磷酰胺聯合使用后,其腫瘤抑制率低于環磷酰胺,這表明,地榆皂苷拮抗了化療藥物對腫瘤的治療作用;而在使用地榆鞣質后,不但增強了對腫瘤的療效,同時,還可以保護骨髓細胞和全血細胞,降低或避免化療藥物對骨髓細胞和全血細胞的損傷。因此,需控制本發明地榆鞣質提取物中地榆皂苷的含量,以防止地榆皂苷產生的副作用。根據實施例和試驗例結果,地榆鞣質提取物中地榆總皂苷的重量百分含量<10%w/w、地榆皂苷Ⅰ重量百分含量<5%w/w,優選地,提取物中地榆總皂苷含量<0.001%w/w、地榆皂苷Ⅰ的含量<0.0001%w/w。

試驗例7?本發明地榆鞣質提取物對骨髓保護的藥效實驗

1實驗材料

KM小鼠(♀各半,18~22g,清潔級,合格證號:SCXK(川)2004-15,購自于四川省醫學科學院實驗動物研究所);全自動血球計數儀(MEK-6318,購自于日本光電工業株式會社);電子分析天平(BP211D,購自于德國賽多利斯公司);酶標儀;鈷60射線外照機;重組人粒細胞集落刺激因子(rhG-CSF,75μg);生理鹽水;實施例1-8所得地榆鞣質提取物(其中,鞣質的重量百分含量在55%~79%之間,皂苷重量百分含量<10%w/w)。

2實驗方法

2.1分組與給藥

本實驗動物飼養于成都中醫藥大學藥理實驗動物觀察室,于實驗開始前適應環境3天,正常給予飲食和水。將110只小鼠按性別分層完全隨機分為11組(具體分組與給藥情況見表23),于造模前預防ig給藥3d。第4d除了正常組,其余各組均置于分隔好的圓形塑料盒中,以盒蓋為中心定距離,用鈷60射線一次性全身照射7.5Gy,劑量率為82.6cGy/min,照射距離80cm。除西藥陽性組外,從造模當日起繼續ig給藥6d。第7~9天皮下注射rhG-CSF。

表23?分組與給藥

2.2評價指標與數據處理

在造模后第7d眼眶采血,采用全自動血球計數儀檢測外周血常規參數,包括白細胞WBC數,紅細胞RBC,血紅蛋白HGB,血小板PLT,同時取脾臟稱重,計算脾臟系數。處死上述小鼠,取左側完整股骨,除凈軟組織,用0.005mol/L?CaCl210mL將全部骨髓沖入試管中,置4℃冰箱30min,2500r/min離心15min,棄去上清,將沉淀物加0.2mol/L?HClO45mL充分混勻,90℃加熱15min,放冷后3500r/min離心10min,取上清,用酶標儀于260nm波長處測定OD值。

實驗數據以mean±S.D.表示,采用SPSS軟件,統計檢驗用成組t檢驗和單因素F檢驗,檢驗水平α=0.05。

2.3結果分析

地榆鞣質對鈷射線所致小鼠骨髓抑制的影響見表24。

表24?不同制備方法的地榆鞣質的藥效對比研究(mean±S.D.,n=10)

Δ:與模型組比P<0.05

由結果可知,本發明地榆鞣質提取物對化學物質所致小鼠骨髓DNA含量減少以及白細胞降低均有顯著保護作用(P<0.05),且隨著地榆鞣質含量越高,地榆素、兒茶素、原花青素B2等組分的含量越高,則藥效呈上升趨勢。

試驗例8?地榆鞣質提取物的副作用研究

1急性毒性實驗

KM小鼠隨機分為空白組和給藥組,每組20只動物,空白組灌胃給予生理鹽水,給藥組以動物能耐受的最大濃度、最大體積的藥量一次灌胃給予動物,折算為提取物2g/ml,連續觀察兩周。結果,無明顯毒副作用。經計算得小鼠對地榆鞣質提取物(實施例9制備)的最大耐受量為80g/kg。

2不同給藥途徑試驗

KM小鼠隨機分為肌肉注射組、灌胃組、腹腔注射組、皮下注射、靜脈注射組,每組10只動物,除空白組外分別給以等同劑量的地榆鞣質提取物(實施例9制備)10mg/kg,連續14天,處死動物,解剖觀測動物組織形態學變化,拍照。

結果,鞣質的其他給藥途徑具有很強的副作用,表現為:

腹腔注射:組織、肌肉的粘連病變

肌肉注射:肌肉有諸多瘀血

皮下注射:皮下組織充血

靜脈注射:小鼠立即死亡

但是,灌胃無明顯不良反應,說明地榆鞣質適宜于灌胃給藥。

通過上述藥效實驗可以證明,本發明地榆鞣質提取物中含有鞣質的重量百分含量為35%-98.5%w/w;地榆總皂苷的重量百分含量<10%w/w、地榆皂苷Ⅰ重量百分含量<5%w/w,其中的活性成分為地榆鞣質,且隨著地榆鞣質含量越高,藥效呈上升趨勢,且高純度地榆鞣質在同等劑量下,優于其中含有的化合物地榆素、兒茶素等,具有保護骨髓造血干細胞的作用,其對化學物質和輻射引起的小鼠骨髓DNA抑制有顯著保護作用,能夠升高白細胞,與化療藥物聯合使用時,不但增強了對腫瘤的療效,還可以保護骨髓細胞和全血細胞,降低或避免化療藥物對骨髓細胞和全血細胞的損傷,且制備工藝簡單,得率高,為臨床治療和預防因放療、化療引起的正常骨髓細胞的抑制提供一種新的用藥選擇。

工業應用性

本發明地榆鞣質具有保護骨髓造血干細胞的作用,其對化學物質和輻射引起的小鼠骨髓DNA抑制有顯著保護作用。同時,地榆鞣質還能夠升高白細胞,具有明顯的升白作用。該產品為臨床緩解因放療、化療引起的正常骨髓細胞的抑制提供一種新的用藥選擇,具有極好的臨床應用和工業化前景。

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