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一種梭子蟹蟹黃唾液酸糖蛋白的制備方法及其應用.pdf

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一種 梭子蟹 蟹黃 唾液酸 糖蛋白 制備 方法 及其 應用
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摘要
申請專利號:

CN201811260168.0

申請日:

20181026

公開號:

CN109170119A

公開日:

20190111

當前法律狀態:

有效性:

審查中

法律詳情:
IPC分類號: A23J1/04,A23J3/04,A61K38/02,A61P19/10 主分類號: A23J1/04,A23J3/04,A61K38/02,A61P19/10
申請人: 浙江海洋大學
發明人: 胡世偉,李世杰,姜維,劉宇
地址: 316100 浙江省舟山市普陀海洋科技產業園普陀展茅曉輝工業區c2—10地塊
優先權: CN201811260168A
專利代理機構: 杭州千克知識產權代理有限公司 代理人: 賈森君
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法律狀態
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CN201811260168.0

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法律狀態類型:

摘要

本發明公開了一種梭子蟹蟹黃唾液酸糖蛋白的制備方法及其應用,將梭子蟹蟹黃經勻漿后冷凍干燥;凍干的蟹黃經無水乙醇脫脂后晾干;經去KCl溶液于超聲波輔助下提取唾液酸糖蛋白,獲得的唾液酸糖蛋白,獲得的唾液酸糖蛋白的提取率高,而且經動物活性試驗證明能夠顯著地抑制骨質疏癥。

權利要求書

1.一種梭子蟹蟹黃唾液酸糖蛋白的制備方法,其特征在于,該方法包括如下步驟:(1)將冷凍的成熟梭子蟹蟹黃取出,置于溫度為4℃的條件下解凍,利用勻漿機勻漿、冷凍,再用冷凍干燥機冷凍干燥,得到凍干的蟹黃粉;(2)將所述凍干的蟹黃粉加入至無水乙醇中,攪拌10h進行脫脂,期間每3h更換一次無水乙醇,獲得蟹黃粉混合液;(3)將所述蟹黃粉混合液雙層濾脂過濾除去乙醇,留取濾渣,將所述濾渣于冷風干燥機中風干得到脫脂蟹黃粉;(4)取所述脫脂蟹黃粉加入KCl溶液中進行唾液酸糖蛋白的提取,在提取期間每小時進行超聲波處理以輔助提取唾液酸糖蛋白,在提取結束后進行離心,獲得上清液;(5)取所述上清液在40-45℃下進行減壓濃縮,濃縮液經冷凍干燥后,可得梭子蟹蟹黃唾液酸糖蛋白。2.根據權利要求1所述的一種梭子蟹蟹黃唾液酸糖蛋白的制備方法,其特征在于:步驟(1)中所述勻漿的溫度為25℃,時間為20min,所述冷凍的溫度為-20℃,冷凍時間12h。3.根據權利要求1所述的一種梭子蟹蟹黃唾液酸糖蛋白的制備方法,其特征在于:步驟(2)中所述凍干的蟹黃粉的重量與所述無水乙醇的體積之比為1:10-15。4.根據權利要求1所述的一種梭子蟹蟹黃唾液酸糖蛋白的制備方法,其特征在于:步驟(3)中所述風干時間為6-10h。5.根據權利要求1所述的一種梭子蟹蟹黃唾液酸糖蛋白的制備方法,其特征在于:步驟(4)中所述脫脂蟹黃粉的重量與所述KCl溶液的體積之比為1:20-30。6.根據權利要求1所述的一種梭子蟹蟹黃唾液酸糖蛋白的制備方法,其特征在于:步驟(4)中所述KCl溶液的濃度為0.1-1mol/L。7.根據權利要求1所述的一種梭子蟹蟹黃唾液酸糖蛋白的制備方法,其特征在于:步驟(4)中所述提取溫度為4-10℃,提取時間為3-5h。8.根據權利要求1所述的一種梭子蟹蟹黃唾液酸糖蛋白的制備方法,其特征在于:步驟(4)中所述超聲波處理時間為10-20min,超聲聲場強度為30~60W/cm,超聲頻率為30kHz。9.根據權利要求1所述的一種梭子蟹蟹黃唾液酸糖蛋白的制備方法,其特征在于:步驟(4)中所述離心的速度為8000r/min,離心時間為10-15min。10.一種如權利要求1-9所制得的梭子蟹蟹黃唾液酸糖蛋白在制備抗骨質疏松癥藥物中的應用。

說明書

技術領域

本發明涉及食品、藥品加工技術領域,具體涉及一種梭子蟹蟹黃唾液酸糖蛋白的制備方法。

背景技術

梭子蟹是我國重要的海洋經濟生物,其肉質鮮美,一直深受國內消費者的喜愛,且其生長快,產量高,在1981年被列為我國海洋養殖重要對象之一。梭子蟹加工過程中產生大量的下腳料,如蟹黃、蟹腿等,每年單舟山可產生數十噸的梭子蟹蟹黃下腳料。雖然這些蟹黃副產物擁有較高的營養價值,但這些品相不高的蟹黃主要用來制作飼料,其深加工利用率相對很低、附加值不高。蟹黃中含有豐富的脂質和蛋白質,營養價值豐富。經測定,成熟的梭子蟹蟹黃唾液酸糖蛋白含量占干重的質量百分比為3.85%,在水產動物中含量較高。目前,對梭子蟹蟹黃唾液酸糖蛋白的研究尚未發現相關報道。

發明內容

本發明目的是:提供一種梭子蟹蟹黃唾液酸糖蛋白的制備方法及其應用,以解決上述問題。

本發明的技術方案是:

一種梭子蟹蟹黃唾液酸糖蛋白的制備方法,該方法包括如下步驟:

(1)將冷凍的成熟梭子蟹蟹黃取出,置于溫度為4℃的條件下解凍,利用勻漿機勻漿、冷凍,再用冷凍干燥機冷凍干燥,得到凍干的蟹黃粉;

(2)將所述凍干的蟹黃粉加入至無水乙醇中,攪拌10h進行脫脂,期間每3h更換一次無水乙醇,獲得蟹黃粉混合液;

(3)將所述蟹黃粉混合液雙層濾脂過濾除去乙醇,留取濾渣,將所述濾渣于冷風干燥機中風干得到脫脂蟹黃粉;

(4)取所述脫脂蟹黃粉加入KCl溶液中進行唾液酸糖蛋白的提取,在提取期間每小時進行超聲波處理以輔助提取唾液酸糖蛋白,在提取結束后進行離心,獲得上清液;

(5)取所述上清液在40-45℃下進行減壓濃縮,濃縮液經冷凍干燥后,可得梭子蟹蟹黃唾液酸糖蛋白。

進一步的,步驟(1)中所述勻漿的溫度為25℃,時間為20min,所述冷凍的溫度為-20℃,冷凍時間為12h。

進一步的,步驟(2)中所述凍干的蟹黃粉的重量與所述無水乙醇的體積之比為1:10-15。

進一步的,步驟(3)中所述風干時間為6-10h。

進一步的,步驟(4)中所述脫脂蟹黃粉的重量與所述KCl溶液的體積之比為1:20-30。

進一步的,步驟(4)中所述KCl溶液的濃度為0.1-1mol/L。

進一步的,步驟(4)中所述提取溫度為4-10℃,提取時間為3-5h。

進一步的,步驟(4)中所述超聲波處理時間為10-20min,超聲聲場強度為30~60W/cm2,超聲頻率為30kHz。

進一步的,步驟(4)中所述離心的速度為8000r/min,離心時間為10-15min。

本發明的另一技術方案為梭子蟹蟹黃唾液酸糖蛋白在制備抗骨質疏松癥藥物中的應用。

本發明提供的一種梭子蟹蟹黃唾液酸糖蛋白的制備方法,從性成熟的梭子蟹蟹黃中制備唾液酸糖蛋白,獲得的唾液酸糖蛋白經動物活性試驗證明能夠顯著地抑制骨質疏癥,彌補了我國梭子蟹加工產業在唾液酸糖蛋白方面的空白。

具體實施方式

本發明提供一種梭子蟹蟹黃唾液酸糖蛋白的制備方法,包括步驟:

將梭子蟹蟹黃經勻漿后冷凍干燥;

凍干的蟹黃經無水乙醇脫脂后晾干;

經去KCl溶液于超聲波輔助下提取唾液酸糖蛋白,獲得的唾液酸糖蛋白。

為使本發明的上述目的、特征和優點能夠更加明顯易懂,下面結合具體實施方式對本發明作進一步詳細的說明。

一種梭子蟹蟹黃唾液酸糖蛋白的制備方法,包括:

步驟一:將冷凍的成熟梭子蟹蟹黃取出,置于溫度為4℃的條件下解凍,利用勻漿機勻漿、冷凍、再用冷凍干燥機冷凍干燥,得到凍干的蟹黃粉;

該步驟可以具體如下執行:將冷凍的成熟梭子蟹蟹黃取出,置于溫度為4℃的條件下解凍,利用勻漿機勻漿、在溫度為-20℃的條件下冷凍12h,再用冷凍干燥機冷凍干燥得到凍干的蟹黃粉。

步驟二:將所述凍干的蟹黃粉加入至無水乙醇中,攪拌10h進行脫脂,期間每3h更換一次無水乙醇,獲得蟹黃粉混合液;

該步驟可以具體如下執行:將所述凍干的蟹黃粉加入至無水乙醇中,所述凍干的蟹黃粉的重量與所述無水乙醇的體積之比為1:10-15,攪拌10h進行脫脂,期間每3h更換一次無水乙醇,獲得蟹黃粉混合液。

步驟三:將所述蟹黃粉混合液雙層濾脂過濾除去乙醇,留取濾渣,將所述濾渣于冷風干燥機中風干得到脫脂蟹黃粉;

該步驟可以具體如下執行:將所述蟹黃粉混合液雙層濾脂過濾除去乙醇,留取濾渣,將所述濾渣于冷風干燥機中風干6-10h得到脫脂蟹黃粉。

步驟四:取所述脫脂蟹黃粉加入KCl溶液中進行唾液酸糖蛋白的提取,在提取期間每小時進行超聲波處理以輔助提取唾液酸糖蛋白,在提取結束后進行離心,獲得上清液;

該步驟可以具體如下執行:取所述脫脂蟹黃粉加入濃度為0.1-1mol/L的KCl溶液中,以脫脂蟹黃粉的重量與KCl溶液的體積之比為1:20-30進行唾液酸糖蛋白的提取,提取溫度為4-10℃,提取時間為3-5h,在提取期間每小時進行超聲波處理以輔助提取唾液酸糖蛋白,超聲波處理時間為10-20min,超聲聲場強度為30~60W/cm2,超聲頻率為30kHz,在提取結束后進行離心,離心的速度為8000r/min,離心時間為10-15min,獲得上清液。

步驟五:取所述上清液在40-45℃下進行減壓濃縮,濃縮液經冷凍干燥后,可得梭子蟹蟹黃唾液酸糖蛋白。

上述方法制得的梭子蟹蟹黃唾液酸糖蛋白可用于制備抗骨質疏松癥藥物。

為使本發明的上述目的、特征和優點能夠更加明顯易懂,下面結合實施例進一步說明本發明的技術方案。但是本發明不限于所列出的實施例,還應包括在本發明所要求的權利范圍內其他任何公知的改變。

此處所稱的“一個實施例”或“實施例”是指可包含于本發明至少一個實現方式中的特定特征、結構或特性。在本說明書中不同地方出現的“在一個實施例中”并非均指同一個實施例,也不是單獨的或選擇性的與其他實施例互相排斥的實施例。

實施例1

本實施案例按如下步驟展示一種梭子蟹蟹黃唾液酸糖蛋白的制備方法:

冷凍的成熟的梭子蟹蟹黃取出后于4℃下解凍,利用勻漿機勻漿后,于-20℃下冷凍12h,利用冷凍干燥機凍干,得到梭子蟹蟹黃粉。凍干的蟹黃粉加入10倍體積的無水乙醇(1/10w/v)攪拌10h進行脫脂,期間每3h更換一次無水乙醇。脫脂后雙層濾脂過濾除去乙醇,濾渣于冷風干燥機中風干6h得到脫脂蟹黃粉。取脫脂蟹黃粉按其重量體積比的20倍加入0.3mol/L的KCl溶液進行唾液酸糖蛋白的提取(1/20,w/v),取取溫度4℃,提取時間3h。期間每小時進行超聲波處理以輔助提取唾液酸糖蛋白,處理時間為10min,超聲聲場強度為30W/cm2,超聲頻率為30kHz。提取結束后進行離心,8000r/min,離心10min。取上清液在40℃下進行減壓濃縮,濃縮液經冷凍干燥后,可得梭子蟹蟹黃唾液酸糖蛋白,得率為:2.87%,唾液酸含量為:5.89%。

實施例2

本實施案例按如下步驟展示一種梭子蟹蟹黃唾液酸糖蛋白的制備方法:

冷凍的成熟的梭子蟹蟹黃取出后于4℃下解凍,利用勻漿機勻漿后,于-20℃下冷凍12h,利用冷凍干燥機凍干,得到梭子蟹蟹黃粉。凍干的蟹黃粉加入13倍體積的無水乙醇(1/13,w/v)攪拌10h進行脫脂,期間每3h更換一次無水乙醇。脫脂后雙層濾脂過濾除去乙醇,濾渣于冷風干燥機中風干8h得到脫脂蟹黃粉。取脫脂蟹黃粉按其重量體積比的25倍加入0.8mol/L的KCl溶液進行唾液酸糖蛋白的提取(1/25,w/v),取取溫度8℃,提取時間5h。期間每小時進行超聲波處理以輔助提取唾液酸糖蛋白,處理時間為15min,超聲聲場強度為45W/cm2,超聲頻率為30kHz。提取結束后進行離心,8000r/min,離心13min。取上清液在43℃下進行減壓濃縮,濃縮液經冷凍干燥后,可得梭子蟹蟹黃唾液酸糖蛋白,得率為:3.54%,唾液酸含量為:6.04%。

實施例3

本實施案例按如下步驟展示一種梭子蟹蟹黃唾液酸糖蛋白的制備方法:

冷凍的成熟的梭子蟹蟹黃取出后于4℃下解凍,利用勻漿機勻漿后,于-20℃下冷凍12h,利用冷凍干燥機凍干,得到梭子蟹蟹黃粉。凍干的蟹黃粉加入15倍體積的無水乙醇(1/15,w/v)攪拌10h進行脫脂,期間每3h更換一次無水乙醇。脫脂后雙層濾脂過濾除去乙醇,濾渣于冷風干燥機中風干10h得到脫脂蟹黃粉。取脫脂蟹黃粉按其重量體積比的30倍加入1mol/L的KCl溶液進行唾液酸糖蛋白的提取(1/30,w/v),取取溫度10℃,提取時間4h。期間每小時進行超聲波處理以輔助提取唾液酸糖蛋白,處理時間為20min,超聲聲場強度為60W/cm2,超聲頻率為30kHz。提取結束后進行離心,8000r/min,離心10-15min。取上清液在40-45℃下進行減壓濃縮,濃縮液經冷凍干燥后,可得梭子蟹蟹黃唾液酸糖蛋白,得率為:3.20%,唾液酸含量為:6.0%。

下述表1為三個實施例與現在技術的對比,具體如下:

表1

實施例4

骨質疏松癥大鼠模型通過摘除雙側卵巢的手術建立。將雌性SD大鼠隨機分為假手術組和摘除卵巢組。摘除卵巢組大鼠經腹腔注射3.4mL/kg·bw的10%水合氯醛以麻醉后對雙側卵巢進行剪除手術,假手術組大鼠剪除相等量的脂肪。大鼠飼喂90d,尾靜脈取血,測定血清雌二醇、抗酒石酸酸性磷酸酶和堿性磷酸酶,以假手術組(SHAM)大鼠(10只)為參照組,摘除卵巢組大鼠血清雌二醇顯著下降(P<0.01),抗酒石酸酸性磷酸酶和堿性磷酸酶活性顯著提高(P<0.01)者可視作成功造模的大鼠。選擇造模成功的大鼠隨機分為模型對照組(OVX)、阿侖膦酸鈉陽性對照組(ALN)、蟹黃唾液酸糖蛋白低劑量組(L-SGP)、蟹黃唾液酸糖蛋白高劑量組(H-SGP),每組10只。SGP低、高劑量組分別灌胃400mg/kg和800mg/kg的SGP,陽性對照組灌胃1mg/kg的ALN,假手術組和模型對照組灌胃等體積量的生理鹽水,1次/d,持續灌胃90d。大鼠自由進食飲水,每3d稱量體重。末次給藥后,大鼠禁食不禁水10h,經乙醚麻醉后由腹主動脈處用注射器取血,4500r·min-1離心20min,吸取血清并保存于4℃備用。試劑盒方法檢測大鼠血清骨吸收指標(抗酒石酸酸性磷酸酶TRACP)和骨生成指標(骨源性堿性磷酸酶(BALP)和骨鈣素(OCN))的水平;X線骨密度儀檢測大鼠股骨骨密度水平;原子吸收法檢測脛骨骨鈣含量;利用骨骼強度儀檢測脛骨最大荷載量;以初步判定蟹黃唾液酸糖蛋白的抗骨質疏松生物活性。結果如表2所示。

表2

注:##P<0.01與SHAM組比較;*P<0.05,**P<0.01與OVX組比較。

結果表明,SGP能有效地抑制去卵巢大鼠骨吸收指標TRACP的增加,抑制骨生成指標BALP和OCN的增加,增加骨密度,增加骨鈣含量,提高脛骨的最大荷載量。實驗證明具有較強的抗骨質疏松癥生物活性。

與現有技術相比,本發明的有益效果是:唾液酸糖蛋白的提取方法簡單,提取率高,而且唾液酸糖蛋白能夠顯著地抑制骨質疏癥。

應說明的是,以上實施例僅用以說明本發明的技術方案而非限制,盡管參照較佳實施例對本發明進行了詳細說明,本領域的普通技術人員應當理解,可以對本發明的技術方案進行修改或者等同替換,而不脫離本發明技術方案的精神和范圍,其均應涵蓋在本發明的權利要求范圍當中。

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