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一種護肝組合物、保健食品、制備方法及其應用.pdf

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一種 組合 保健食品 制備 方法 及其 應用
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申請專利號:

CN201810369469.0

申請日:

20180424

公開號:

CN108576819A

公開日:

20180928

當前法律狀態:

有效性:

審查中

法律詳情:
IPC分類號: A23L33/105,A23L33/15,A23L31/00,A61K36/9066,A61P1/16,A61K31/375 主分類號: A23L33/105,A23L33/15,A23L31/00,A61K36/9066,A61P1/16,A61K31/375
申請人: 北京中和鴻業醫藥科技有限公司
發明人: 洪玉梅
地址: 100031 北京市西城區太平街6號8層E-909
優先權: CN201810369469A
專利代理機構: 北京維正專利代理有限公司 代理人: 俞光明
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法律狀態
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CN201810369469.0

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摘要

本發明公開了一種護肝組合物、保健食品、制備方法及其應用,其技術方案要點是,護肝組合物包括靈芝提取物50?300份、葡萄籽提取物30?240份、姜黃提取物20?230份、維生素C?10?150份,護肝保健食品包括上述護肝組合物和輔料,本發明制得的護肝保健食品對保護肝損傷,尤其是酒精性肝損傷效果顯著,且采用科學合理的生產工藝加工而成,功能明確,質量可控,服用安全。

權利要求書

1.一種護肝組合物,其特征在于,按重量份計,包括有以下組分:靈芝提取物50-300份、葡萄籽提取物30-240份、姜黃提取物20-230份、維生素C10-150份。2.根據權利要求1所述的護肝組合物,其特征在于,按重量份計,還包括有以下組分:靈芝提取物80-200份、葡萄籽提取物50-180份、姜黃提取物40-160份、維生素C30-100份。3.一種護肝保健食品,其特征在于:包括權利要求1-2任一項所述的護肝組合物,還包括藥學上可接受的輔料。4.根據權利要求3所述的護肝保健食品,其特征在于,按重量份計,包括有以下組分:靈芝提取物50-300份、葡萄籽提取物30-240份、姜黃提取物20-230份、維生素C10-150份、微晶纖維素25-180份、二氧化硅2-40份、硬脂酸鎂1-30份。5.根據權利要求3所述的護肝保健食品,其特征在于,按重量份計,包括有以下組分:靈芝提取物80-200份、葡萄籽提取物50-180份、姜黃提取物40-160份、維生素C30-100份、微晶纖維素35-130份、二氧化硅4-20份、硬脂酸鎂3-15份。6.一種如權利要求3-5任一項所述的護肝保健食品的制備方法,其特征在于,包括有以下步驟:S1靈芝提取物、葡萄籽提取物、姜黃提取物、微晶纖維素分別過40-200目篩,混合制得總混粉;S2向總混粉中噴灑70%食用乙醇,然后過10-40目篩制粒,干燥至顆粒含水量≤5%,制得干顆粒;S3干顆粒與維生素C、二氧化硅和硬脂酸鎂混合,制得護肝保健食品。7.根據權利要求6所述的護肝保健食品的制備方法,其特征在于:所述護肝保健食品為軟膠囊、片劑、粉劑或硬膠囊中的一種。8.一種如權利要求1-2任一項所述的護肝組合物或權利要求3-5任一項所述的護肝保健食品的應用,其特征在于:用于護肝。

說明書

技術領域

本發明涉及保健食品領域,特別涉及一種護肝組合物、保健食品、制備方法及其應用。

背景技術

肝臟是人體中的重要的消化器官和解毒器官,對來自體內和體外的非營養性物質,如各種藥物、毒物以及體內某些代謝產物,具有生物轉化作用,通過新陳代謝將它們徹底分解或以原形排出體外。

現有的可參考申請公布號CN105311204A的中國專利申請,其公開了一種護肝保健品,包括丹參2.5-3.6g,黃豆10-15g,五味子1.2-3.2g,柴胡2.2-3.5g,靈芝1.5-2.3g,大棗5.2-6.8g,茵陳2.3-4.6g,黃茂3.2-5.2g,人參2.7-3.5g,還包括藥學上可接受的輔料。

上述護肝保健品采用九種主要藥物以及輔料制成,成分較多,除含有提高人體免疫力、益氣和中、健脾護肝的成分以外,還含有多種滋補性成分。過多的藥物成分和滋補成分均需經過肝臟的消化吸收,無疑會加重肝臟的運作負擔。

發明內容

針對現有技術不足,本發明提供一種護肝組合物,采用原料少,對保護肝損傷,尤其是酒精性肝損傷效果顯著。

本發明的上述技術目的是通過以下技術方案得以實現的:

一種護肝組合物,按重量份計,包括有以下組分:靈芝提取物50-300份、葡萄籽提取物30-240份、姜黃提取物20-230份、維生素C 10-150份。

較佳的,按重量份計,還包括有以下組分:靈芝提取物80-200份、葡萄籽提取物50-180份、姜黃提取物40-160份、維生素C 30-100份。

靈芝的主要活性成分包括靈芝多糖、三萜類化合物、蛋白質、多肽、核苷類、呋喃類、甾醇、生物堿和氨基酸,其中的靈芝多糖能夠抑制自由基脂質過氧化、抑制炎性因子活化、抑制一氧化氮合酶活性,進而起到護肝的功效。

葡萄籽的主要活性成分包括各種礦物質、多種維生素、原花青素,其中,原花青素能夠清除自由基、抑制炎癥因子、保護維生素C和維生素E、抑制膠原合成、促進肝細胞增殖、抑制肝組織細胞凋亡和自噬,還可以通過增加細胞外鈣離子從鈣池內流來提高正常肝細胞的細胞內鈣離子濃度,提高肝細胞的增殖活性,同時抑制細胞內鈣離子濃度和乙醇損傷的肝細胞增殖活性的異常增加,從而保護肝臟。

姜黃的主要活性物質為姜黃素,姜黃素能夠調節血脂、降低脂肪在肝臟中的沉積、清除氧自由基、抑制脂質過氧化產物、抑制炎癥因子釋放、改善胰島素抵抗、調控過氧化物酶體增殖物、減少細胞外基質的沉積等。

維生素C是一種強力自由基清除劑,在細胞內外均具有重要的抗脂質過氧化作用,抑制急慢性肝炎、肝硬化、原發性肝癌、酒精性肝病及缺血性肝損傷時伴有的氧自由基增加、脂質過氧化反應增強等。

本發明的目的二:提供一種護肝保健食品,包括所述的護肝組合物,還包括藥學上可接受的輔料。

較佳的,按重量份計,包括有以下組分:靈芝提取物50-300份、葡萄籽提取物30-240份、姜黃提取物20-230份、維生素C 10-150份、微晶纖維素25-180份、二氧化硅2-40份、硬脂酸鎂1-30份。

較佳的,按重量份計,包括有以下組分:靈芝提取物80-200份、葡萄籽提取物50-180份、姜黃提取物40-160份、維生素C 30-100份、微晶纖維素35-130份、二氧化硅4-20份、硬脂酸鎂3-15份。

輔料的加入能夠提高護肝保健食品中的原料顆粒的分散均勻性、流動性、可壓性、便于后續的進一步加工處理,還能提升口感,此外,其中的微晶纖維素含有的膳食纖維還能夠促進消化和吸收。

本發明的目的三:一種所述的護肝保健食品的制備方法,包括有以下步驟:

S1靈芝提取物、葡萄籽提取物、姜黃提取物、微晶纖維素分別過40-200目篩,混合制得總混粉;

S2向總混粉中噴灑70%食用乙醇,然后過10-40目篩制粒,干燥至顆粒含水量≤5%,制得干顆粒;

S3干顆粒與維生素C、二氧化硅和硬脂酸鎂混合,制得護肝保健食品。

較佳的,所述護肝保健食品為軟膠囊、片劑、粉劑或硬膠囊中的一種。

混合前過篩便于產品的混合均勻性,噴灑食用乙醇便于質粒過程的進行,限定干燥顆粒的含水量,提高產品的質量均一性。通過控制抗氧化保健食品的生產過程,進一步提高產品的品質。

本發明的目的四:提供一種上述護肝組合物或護肝保健食品在護肝方面的應用。

綜上所述,本發明具有以下有益效果:

1、護肝組合物中含有多種抗氧化物質,能夠抑制自由基脂質過氧化、清除氧自由基,進而起到護肝功效;

2、護肝組合物中的原料種數較少,在達到護肝功效的前提下,減輕肝臟的負擔;

3、配方中的維生素C參與膽固醇代謝,能夠促進膽固醇轉化為膽汁酸,降低肝臟和血漿中膽固醇水平;

4、原花青素能夠保護維生素C,延長維生素C的存續期限;

5、各原料相互配伍,從整體上調節人體肝臟及相關臟腑功能;

6、輔料的加入能夠提高護肝保健食品中的原料顆粒的分散均勻性、流動性、可壓性、便于后續的進一步加工處理,還能提升口感;

7、輔料中的微晶纖維素含有的膳食纖維能夠促進消化和吸收,進一步提高人體對護肝成分的利用率;

8、嚴格控制生產工藝,進一步提高產品的品質。

具體實施方式

以下對本發明作進一步詳細說明。

實施例1

護肝保健食品的制備:

S1原料獲取:靈芝提取物經提取(10倍量水煎煮提取2次,每次2h,溫度95-100℃)、過濾、濃縮、噴霧干燥(進風溫度160-180℃,出風溫度80-90℃)、過篩、包裝制成,標準如表1所示;葡萄籽提取物經乙醇提取(提取2次,每次2小時,提取溫度不低于85℃)、過濾,食用乙醇分離洗脫、濃縮、噴霧干燥、過篩、包裝制成,標準如表2所示;姜黃提取物符合1886.76食品安全國家標準食品添加劑姜黃素的標準要求;維生素C應符合GB14754食品安全國家標準食品添加劑維生素C(抗壞血酸)的標準要求;微晶纖維素應符合GB 1886.103食品安全國家標準食品添加劑微晶纖維素的質量要求;二氧化硅應符合GB 25576食品安全國家標準食品添加劑二氧化硅的質量要求;硬脂酸鎂應符合GB 1886.91食品安全國家標準食品添加劑硬脂酸鎂的質量要求。

S2過篩、混合:在十萬級生產潔凈區內,取50g靈芝提取物、30g葡萄籽提取物、20g姜黃提取物、25g微晶纖維素,分別過40目篩,混合15min后獲得總混粉;

S3制粒、干燥、整粒:向上述混合粉中均勻噴灑70%食用乙醇,制得軟材,軟材以“手握成團,輕壓即散”為度,然后過10目篩制粒,50℃干燥至顆粒含水量≤5%,得到干顆粒,食用乙醇符合GB 10343的規定;

S4總混:干顆粒與過60目篩的10g維生素C、2g二氧化硅和1g硬脂酸鎂混合30mim,獲得總混顆粒;

S5裝膠囊:將總混顆粒置膠囊機中裝囊,調整規格為0.45g/粒,檢查,剔除不合格膠囊;

S6分裝:將S5中獲得的合格膠囊裝瓶,60粒/瓶,轉出潔凈區;

S7外包裝、成品檢驗入庫:將上述半成品貼簽,隨機抽取樣品檢驗,合格成品入庫。

表1靈芝提取物的質量標準。

表2葡萄籽提取物的質量標準。

實施例2與實施例1的區別在于原料配比不同,S2中的過篩目數為200目,S3中過篩目數為40目。實施例3與實施例1的區別在于原料配比不同,S2中的過篩目數為120目,S3中過篩目數為20目。實施例4-5與實施例1的區別在于原料配比不同。實施例1-5的原料配比列于表3。

表3抗氧化組合物的原料。

測試

包括樣品的功效成分檢測、衛生學檢測、穩定性試驗、毒理學安全性評價試驗、對化學性肝損傷有輔助保護作用實驗,具體如下所示。

1功效成分檢測、衛生學檢測、穩定性試驗

選取實施例2、3、4作為受檢樣品,樣品的功效成分、衛生學和三個月加速試驗的檢測方法列于表4,樣品的功效成分、衛生學的初始檢測結果列于表5,樣品的功效成分、衛生學的三個月加速試驗結果列于表6。

表4樣品的功效成分、衛生學和三個月加速試驗的檢測方法。

表5樣品的功效成分、衛生學的初始檢測結果。

表6樣品的功效成分、衛生學的三個月加速試驗結果。

2毒理學安全性評價試驗

2.1材料和方法

2.1.1樣品:選取實施例4,規格:0.45g/粒,置陰涼干燥處保存,人口服推薦用量為每人(成人)每日1次,每次2粒,成人體重按60Kg計算,折合劑量為5g/kg BW。取膠囊內容物進行試驗。

2.1.2實驗動物及環境:SPF級健康昆明種小鼠和SD種人鼠,由廣西醫科大學實驗動物中心繁殖,生產許可證號:SCXK(桂)2014-0002,質量合格證號:45000300000390、45000300000391、45000300000419。動物實驗室為屏障系統,使用許可證號:SYXK(桂)2011-0005。動物實驗室溫度:22-25℃,相對濕度:55-70%。

2.1.3小鼠急性毒性試驗:采用最大耐受劑量(MTD)試驗法,選體重18-22g的昆明種小鼠20只,雌雄各半。試驗前動物禁食16小時,不限飲水。稱取20.0g樣品,加純水至40mL,混勻,配成500mg/mL濃度混懸液,然后給動物灌胃2次(間隔6h),每次灌胃量為4mL/20g BW,合計劑量為20000mg/kg BW。灌胃后觀察、記錄動物的中毒表現。每周稱重一次,觀察兩周時間,試驗結束解剖動物進行大體觀察。按毒性分級標準評價受試物的急性毒性。

2.1.4 Ames試驗:采用經鑒定符合要求的鼠傷寒沙門氏菌組氨酸缺陷型TA97a、TA98、TA100、TA102四種菌株進行試驗。稱取5Og樣品,加純水至1OOmL混勻,配成50mg/mL濃度溶液,再依次5倍稀釋(取10mL加純水至50mL),分別配成I0、2、0.4、0.08mg/mL濃度溶液,受試溶液經高壓滅菌(0.103MPa 20min)處理后供試驗用。以多氯聯苯誘導的大鼠肝微粒體酶S_9作為體外代謝活化系統。采用平板摻入法,在保溫的頂層培養基中依次加入0.1mL試驗菌株增菌液、0.1mL受試物溶液和0.5mL S_9混合液(當需要代謝活化時),混勻后倒入底層培養基平板上。5個試驗劑量分別為5000、1000、200、40、8μg/皿,同時設自發回變對照、溶劑對照和陽性突變劑對照。自發回變對照除不加樣品外,其余條件與樣品組相同。溶劑對照用滅菌純水替代樣品,其余條件與樣品組相同。每個劑量組的各種菌株均做3個平行皿。在37℃下培養48小時,計數每皿的菌落數。整套試驗在相同條件下重復做兩次。如果受試物的回變菌落數增加超過自發回變菌落數的2倍以上,并具有劑量-反應關系者,即為誘變試驗陽性。

2.1.5小鼠骨髓細胞微核試驗:采用間隔24小時兩次經口灌胃法進行試驗。選體重為25-30g的昆明種小鼠50只,隨機分成5組,每組10只,雌雄各半。試驗組3個劑量分別設10000、5000、2500mg/kg BW,以純水為陰性對照,40mg/kg BW劑量的環磷酞胺(cp)作陽性對照。分別稱取20.0、10.0、5.0g樣品,各加純水至40mL,混勻,配成500、250、125mg/mL濃度混懸液,然后按4mL/20g BW的體積給動物灌胃,陰性對照組灌給等體積的純水,陽性對照組灌給等體積的2mg/mL環磷酞胺溶液。第二次給樣后6小時頸椎脫臼處死動物,取胸骨骨髓用小牛血清稀釋涂片,甲醇固定,Giemsa染色。在光學顯微鏡下,每只動物計數1000個嗜多染紅細胞(PCE),觀察含微核的PCE數,微核率以含微核的PCE千分率計,同時計數200個嗜多染紅細胞,計算嗜多染紅細胞與成熟紅細胞的比值(PCE/NCE)。應用Spss軟件中的泊松分布均數比較法統計處理。如試驗組的微核率比陰性對照組增高,并有明顯的劑量-反應關系和統計學意義,即為陽性結果。

2.1.6小鼠精子畸形試驗:選體重為25-35g的昆明種雄性小鼠50只,隨機分成5組,每組10只。試驗組3個劑量分別設10000、5000、2500mg/kg BW,以純水為陰性對照,40mg/kg BW劑量的環磷酞胺(cp)作陽性對照。分別稱取20.0、10.0、5.0g樣品,各加純水至40mL,混勻,配成500、250、125mg/mL濃度混懸液,然后按0.4mL/20g BW的體積給動物灌胃,陰性對照組灌給等體積的純水,陽性對照組灌給等體積的2mg/mL環磷酞胺溶液。每天灌胃一次,連續5天。末次給樣后第30天處死動物,取副睪的精子涂片,甲醇固定,伊紅染色。在光學顯微鏡下,每只動物計數完整精子1000個,計算精子畸形率。應用SPSS統計軟件中的Wilcoxon秩和檢驗統計處理。如試驗組的精子畸形率比陰性對照組增高,經統計有顯著意義,并有劑量反應關系,即為陽性結果。

2.1.7大鼠30天喂養試驗

2.1.7.1劑量選擇與受試物給予方式:選SD種大鼠80只,雌、雄性各半,體重60-80g。將動物隨機分為4組,即陰性對照組和3個試驗組,每組20只,雌、雄各半。3個試驗組劑量分別設為1500、750、375mg/kg BW,分別相當于人體推薦劑量的100、50、25倍。分別稱取15.00、7.50、3.75g樣品,各加純水至1OOmL混勻,配成150.0、75.0、37.5mg/mL濃度混懸液,按1.OmL/100g BW的體積給相應劑量組動物灌胃,陰性對照組灌給等體積的純水,每天灌胃一次,連續灌胃30天。

2.1.7.2實驗方法:實驗期間所有動物給予普通飼料,單籠飼養,自由攝食飲水。每天觀察動物的活動和生長情況,每周加食2次,記錄給食量和剩食量,每周稱一次體重,計算每周進食量和食物利用率。實驗結束動物隔夜禁食(禁食16h,不限飲水),然后稱動物空腹體重,處死大鼠,采2份血樣,一份血抗凝用血球計數儀檢測HB、RBC、WBC及其分類、PLT等;另一份血不抗凝分離血清,用試劑盒和全自動生化分析儀檢測血清AST、ALT、BUN、Cr、TC、TG、Glu、TP、Alb等項目。采血后解剖動物,進行大體觀察,取肝臟、腎臟、脾臟和睪丸等臟器進行稱重,計算臟/體比值,取肝臟、腎臟、脾臟、胃、十二指腸、睪丸和卵巢等臟器進行病理組織學檢查。在對各劑量組動物作大體檢查未發現明顯病變和生化指標改變時,只進行高劑量組和對照組動物的主要臟器的組織病理學檢查,如發現病變則對中、低劑量組相應器官及組織進行檢查。

2.1.7.3實驗數據統計:應用SPSS統計軟件進行單因素方差分析。在統計分析時,先對數據進行方差齊性檢驗,若方差齊,采用單因素方差分析進行總體比較,發現差異再用Dunnett檢驗進行多個劑量組與對照組均數間的兩兩比較。若方差不齊則對數據進行適當的變量轉換,滿足方差齊性檢驗后,用轉換后的數據進行統計;若轉換數據仍未達到方差齊要求,改用秩和檢驗進行統計分析。

2.2結果

2.2.1急性經口毒性試驗

表7樣品急性經口毒性試驗結果(均值±標準差)。

從表7可見,以20000mg/kg BW劑量的樣品給予小鼠灌胃后,動物生長良好,未見體重受到影響。受試小鼠均未見有中毒癥狀,觀察14天無動物死亡。試驗結束解剖動物、大體觀察,肝、腎、脾、心、肺、胃、腸等主要臟器均未見明顯異常改變。結果表明,該樣品對小鼠的急性經口毒性MTD大于20g/kg BW,急性經口毒性屬無毒級。

2.2.2 Ames試驗

表8樣品Ames試驗結果(均值±標準差)。

表8中的結果(菌落數)均為3個平皿的均值±標準差。陽性對照:TA97a+S-9、TA98+S-9、TA100+S-9采用2-氨基芴(劑量為10μg/皿);TA98-S-9采用柔毛霉素(劑量為6μg/皿);TA97a-S-9、TA102-S-9采用敵克松(劑量為50μg/皿);TA100-S-9采用疊氮鈉(劑量為1.5μg/皿);TA102+S-9采用1,8-二羥基蒽醌(劑量為50μg/皿)。

從表8可見,對TA97a、TA98、TA100、TA102四種試驗菌株,無論是否加入S-9,樣品各劑量組的回變菌落數均未超過自發回變菌落數的兩倍,亦無劑量-反應關系,表明該受試物誘變試驗結果為陰性。

2.2.3小鼠骨髓細胞微核試驗

表9樣品對小鼠的骨髓細胞微核發生率的影響(均值±標準差)。

從表9可見,樣品各劑量組小鼠的骨髓細胞微核率與陰性對照組比較,差異均無顯著性(P>0.05),各劑量組PCE/NCE值均不少于陰性對照組的20%,與陰性對照組比較也無明顯差異,而環磷酞胺陽性對照組的微核率與陰性對照組的差異有非常顯著性(P<0.01),提示未見該樣品對小鼠的骨髓細胞有損傷和抑制作用。

2.2.4小鼠精子畸形試驗:

表10樣品對小鼠精子畸形發生率的影響(均值±標準差)。

從表10可見,樣品對小鼠精子畸形發生率未產生明顯改變,樣品各劑量組的精了畸形率與陰性對照組比較,差異均無顯著性(P>0.05),而環磷酰胺陽性對照組與陰性對照組的差異有非常顯著性(P<0.01),提示未見該樣品對雄性小鼠的精子產生畸變作用。

2.2.5大鼠30天喂養試驗

2.2.5.1動物一般表現:實驗期間,各組動物生長發育良好,未見動物有異常行為和中毒表現,各組動物均無死亡。

2.2.5.2樣品對大鼠體重及食物利用率的影響

結果見表11-12,以I500、750、375mg/kg BW劑量的樣品給大鼠灌胃30天,實驗期間,樣品各劑量組雌雄鼠每周的體重、增重量、每周進食量及總進食量、每周食物利用率及總食物利用率與對照組比較,差異均無顯著性(P>0.05),表明該樣品對大鼠的體重增長和食物利用率無明顯影響。

表11樣品對大鼠體重的影響(均值±標準差)。

表12樣品對大鼠食物利用率的影響(均值±標準差)。

2.2.5.3樣品對大鼠血常規指標的影響

表13樣品30天喂養試驗結束大鼠血常規指標檢查結果(均值±標準差)。

表14樣品30天喂養試驗結束大鼠血常規指標檢查結果(均值±標準差)。

從表14可見,以1500、750、375mg/Kg BW劑量的樣品給大鼠灌胃30天,樣品各劑量組雌、雄性大鼠的血紅蛋白、紅細胞總數、自細胞總數及其分類、血小板數與對照組比較,差異均無顯著性(P>0.05),表明該樣品對大鼠的血常規指標無明顯影響。

2.2.5.4樣品對大鼠血液生化指標的影響

結果見表15-16,以1500、750、375mg/Kg BW劑量的樣品給大鼠灌胃30天,樣品各劑量組雌、雄性大鼠的血清谷草轉氨酶、谷丙轉氨酶、尿素氮、肌酐、膽固醇、甘油三脂、總蛋自、白蛋白、血糖與對照組比較,差異均無顯著性(P>0.05),表明該樣品對大鼠的血液生化指標無明顯影響。

表15樣品30天喂養試驗結束大鼠血液生化指標檢查結果(均值±標準差)。

表16樣品30天喂養試驗結束大鼠血液生化指標檢查結果(均值±標準差)。

2.2.5.5樣品對大鼠臟器重量及臟器/體重比值的影響

結果見表17-18,以1500、750、75mg/kg BW劑量的樣品給大鼠灌胃30天,樣品各劑量組大鼠的肝腎、脾、雄鼠睪丸重量和肝/體、腎/體、脾/體、雄鼠睪丸體比值與對照組比較,差異均無顯著性(P>0.05),表明該樣品對大鼠的臟器重量及臟器/體重比值無明顯影響。

表17樣品對大鼠臟器重量的影響(均值±標準差)。

表18樣品對大鼠臟器/體重的影響(均值±標準差)。

2.2.5.6解剖大體觀察及組織學檢查結果

實驗結束解剖動物,大體觀察各組動物均未發現明顯病變。故只選樣品的高劑量組和陰性對照組動物的主要臟器進行組織病理切片檢查,結果見表19。結果顯示,高劑量組和對照組各有1只雌性大鼠的肝小葉組織可見肝細胞輕度脂肪變性,高劑量組有1只雌性、對照組有1只雄性和1只雌性大鼠的肝小葉可見肝細胞點狀壞死,高劑量組和對照組均有2只雄性和1只雌性大鼠的肝臟匯管區可見少量炎細胞浸潤;兩組均有1只雄性和1只雌性大鼠的腎臟皮質部間質可見少量炎細胞浸潤。以上組織病變屬動物的自發輕型病變,且兩組動物的組織病變程度相似,故可以排除是樣品所致,其他臟器組織未見病理組織學改變,表明該樣品對大鼠的上述臟器組織無損害作用。

表19樣品30天喂養試驗大鼠組織病理學檢查結果。

2.3小結

以2000mg/kg BW劑量的樣品給予小鼠灌胃后,未見動物有中毒癥狀和死亡,該樣品對小鼠的急性經口毒性MTD大于20g/kg BW,急性經口毒性屬無毒級。三項遺傳毒性試驗(Ames試驗、小鼠骨髓細胞微核試驗、小鼠精子畸形試驗)結果均為陰性。30天喂養試驗,以1500、750、375mg/kg BW 3個劑量(分別相當于人體推薦用量100、50、25倍)的樣品連續給大鼠灌胃30天,實驗期間動物生長發育良好,各劑量組大鼠的體重、增重量、進食量、食物利用率、血常規指標、血液生化指標、臟器重策及臟器/體重比值等均未受明顯影響;大體解剖觀察和組織病理學檢查未見與樣品有關的異常改變。在受試劑量范圍內未見該樣品對大鼠各項觀察指標產生毒副作用。

3對化學性肝損傷有輔助保護作用實驗

3.1材料和方法

3.1.1樣品:實施例4,規格為0.45g/粒,置陰涼十燥處保存。人體推薦用量為每人(成人)每日1次,每次2粒,按60kg體重折算成15mg/kg BW。

3.1.2實驗動物及環境:選用廣西醫科大學實驗動物中心繁殖的SPF級SD種雄性大鼠50只,體重180-220g,實驗動物生產許可證號:SCXK(桂)2014-0002,實驗動物質量合格證號:45000300000521。動物實驗室為屏障系統,使用許可證號:SYXK(桂)2016-0002。動物實驗室溫度:22-25℃,相對濕度:55-70%。

3.1.3劑量選擇與受試物給予方式:根據樣品的人體推薦用量,設300、150、75mglkg BW 3個劑量組(分別相當于推薦量的20、10、5倍),另設一個酒精肝損傷模型組(模型對照組)和一個陰性對照組,每組10只動物。分別稱取樣品內容物6.0、3.0、1.5g,各加純水至200mL,混勻,配成30.0、15.0、7.5mg/mL濃度的混懸液,分別給予相應劑量組動物灌胃,灌胃量為1.0mL/100g BW,模型對照組和陰性對照組給予等體積的純水,每天灌胃一次,連續30天。

3.1.4主要儀器與試劑

儀器:半自動生化分析儀、冷凍切片機、電子分析天平、顯微鏡、離心機、組織勻漿器、旋渦混勻器、水浴鍋及微量加樣器等。

試劑:無水乙醇、還原型GSH、磺基水楊酸、5,5’-二硫對硝基甲酸、Na2HPO4、NaH2PO4、KH2PO4、NaN3、EDTA-Na2等;MDA、TG試劑盒。

3.1.5實驗方法:依據《保健食品檢驗與評價技術規范》(2003年版)中對化學性肝損傷有輔助保護作用試驗方法,采用酒精肝損傷模型方案。大鼠在SPF級動物實驗室內飼養觀察5天后,根據體重分層隨機分為5組,即3個劑量組和2個對照組,每組10只雄性大鼠。開始試驗后,各劑量組大鼠灌胃給予相應濃度的受試溶液,模型對照組和陰性對照組給予純水,灌胃量為1.0mL/100g BW。每天灌胃一次,每周稱重兩次,連續30天。試驗至第30天時,模型對照組及樣品各劑量組動物一次灌胃給予50%乙醇溶液1.2mL/100g BW,制造肝損傷模型:陰性對照組灌給等體積的純水。禁食16小時后處死大鼠,快速取出肝臟,其中一部分(左葉)用作冷凍切片,進行病理組織學檢查,觀察脂滴在肝臟中的分布、范圍和面積并進行評分;另一部分用于制成肝勻漿分別測定丙二醛(MDA)、還原型谷胱甘肽(GSH)及甘油三醋(TG)含量。

3.1.6試驗數據處理:采用SPSS統計軟件進行方差分析統計處理

3.1.7結果判定:滿足以下任一條件,可判定受試樣品具有對化學性肝損傷有輔助保護作用。

3.1.7.1肝臟MDA、還原性GSH和TG三項檢測指標陽性。

3.1.7.2肝臟MDA、還原型GSH和TG三項檢測指標中任兩項指標陽性和病理組織學檢查結果陽性。

3.2.試驗結果

3.2.1樣品對大鼠體重的影響

表20試驗前后各組大鼠體重變化(均值±標準差)。

從表20可見,試驗前各組大鼠體重一致,試驗過程各周各組大鼠的體重及試驗結束時的增重量相互比較,差異均沒有顯著性(P>0.05),表明該樣品對大鼠的體重增長沒有明顯影響作用。

3.2.2樣品對酒精性肝損傷大鼠的肝組織過氧化脂質降解產物丙二醛(MDA)含量的影響

表21各組大鼠肝組織勻漿丙二醛(MDA)含量(均值±標準差)。

從表21可見,肝損模型對照組大鼠肝組織的MDA含量明顯高于陰性對照組,且兩者的差異具有非常顯著性(P<0,01),說明肝損模型成立。樣品各劑量組大鼠的肝組織MDA含量均低于肝損模型對照組,其中的高劑量組與模型對照組的差異有非常顯著性(P<0.01),表明該樣品具有降低酒精性損傷的大鼠肝組織中過氧化脂質含量的作用。

3.2.3樣品對酒精性肝損傷大鼠的肝組織甘油三酯(TG)含量的影響

表22各組大鼠肝組織勻漿TG含量(均值±標準差)。

從表22可見,肝損模型對照組的肝組織TG含量明顯高于陰性對照組,兩者差異具有非常顯著性(P<0.01),說明肝損模型成立。樣品各劑量組人鼠的肝組織TG含量均低于肝損模型對照組,且高、中劑量組與肝損模型對照組的差異具有顯著性(分別P<0.01和P<0.05),表明該樣.昆具有降低酒精性損傷的大鼠肝組織中甘油三脂(TG)含量的作用。

3.2.4樣品對酒精性肝損傷大鼠的肝組織還原型谷胱甘肽(GSH)含量的影響

表23各組大鼠肝組織勻漿GSH含量(均值±標準差)。

從表23可見,肝損模型對照組的肝組織中GSH含量顯著低于陰性對照組,兩者差異有非常顯著性(P<0.01),表明肝損模型成立。樣品各劑量組大鼠的肝組織GSH含量高于模型對照組,且各劑量與肝損模型對照組的差異具有顯著性(P<0.01或P<0.05),表明該樣品具有提高酒精性肝損傷的大鼠肝組織中GSH含量的作用。

3.2.5樣品對酒精性肝損傷大鼠的肝組織脂肪變性的影響

表24各組大鼠肝組織脂肪變性檢查結果(均值±標準差)。

從表24可見,肝損模型對照組大鼠的肝組織脂肪變性評分值高護陰性對照組,兩者差異具有非常顯著性(P<0.01),表明肝損模型成立。樣品各劑量組大鼠的肝組織脂肪變性評分值均低于肝損模型對照組,但各劑量組與肝損模型對照組的差異均無顯著性(P>0.05)表明該樣品對酒精性肝損傷的大鼠肝組織脂肪變性無減輕作用。

3.3結果判定

分別以300、150、75mg/Kg BW(相當于人體推薦用量20、15、5倍)劑量的樣品給大鼠連續灌胃30天,能降低酒精性肝損模型大鼠的肝組織中的丙二醛(MDA)及甘油三脂(TG)含量,提高其肝組織中還原型谷胱甘肽(GSH)含量,對大鼠的體重增長及酒精性肝損模型大鼠的肝組織脂肪變性無明顯影響,提示該樣品對酒精性肝損傷有輔助保護作用。

上述具體實施例僅僅是對本發明的解釋,其并不是對本發明的限制,本領域技術人員在閱讀完本說明書后可以根據需要對本實施例做出沒有創造性貢獻的修改,但只要在本發明的權利要求范圍內都受到專利法的保護。

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