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擬缺香茶菜酮在制備細胞凍存液的應用和方法.pdf

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擬缺香茶菜酮 制備 細胞 凍存液 應用 方法
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摘要
申請專利號:

CN201710001138.7

申請日:

20170103

公開號:

CN106689117A

公開日:

20170524

當前法律狀態:

有效性:

審查中

法律詳情:
IPC分類號: A01N1/02 主分類號: A01N1/02
申請人: 鄭州漢東科技有限公司
發明人: 劉文友
地址: 450000 河南省鄭州市金水區文博西路25號院2號樓30層3008號
優先權: CN201710001138A
專利代理機構: 代理人:
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法律狀態
申請(專利)號:

CN201710001138.7

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法律狀態公告日:

法律狀態類型:

摘要

本發明提出一種擬缺香茶菜酮在制備細胞凍存液的應用和方法,其可降低適用于免疫細胞長期保存,并能夠在復蘇后保持其細胞特性。本發明人驚奇的發現,擬缺香茶菜酮可以顯著減少DMSO的使用量,該凍存液能夠有效用于保存細胞,尤其是免疫細胞,并且凍存時間長(凍存時間可達幾年甚至更長),細胞復蘇后依然保持良好的細胞活力,活性好,細胞回收率高,尤其適用于大規模免疫細胞的冷凍保存。

權利要求書

1.一種免疫細胞凍存液,其特征在于,包括:0.5體積%的DMSO;0.005-0.008體積%的擬缺香茶菜酮;以及余量培養基。2.權利要求1所述的凍存液,其特征在于:其包括0.6體積%的DMSO;0.006體積%的擬缺香茶菜酮;以及余量培養基。3.權利要求1或2所述的凍存液用于凍存細胞的應用。4.權利要求3所述的應用,其特征在于:所述細胞是免疫細胞。5.權利要求4所述的應用,其特征在于:所述細胞是單核細胞。6.擬缺香茶菜酮在制備細胞凍存液上的應用。

說明書

技術領域

本發明涉及一種擬缺香茶菜酮在制備細胞凍存液的應用和方法,屬于生物領域,特別是細胞培養領域。

背景技術

擬缺香茶菜 Isodon excisoides (Sun ex C. H. Hu) C. Y. Wu et H. W. Li 別名野紫蘇,為唇形科(Labiatae)香茶菜屬 Rabdosia (Bl.) Hassk.植物,產于湖北、四川、云南。其味辛、苦,性平,具祛風活血、解毒消腫功效,主要用于治療感冒頭痛、風濕痹痛、跌打瘀腫、骨折、外傷出血、毒蛇咬傷。關于該植物化學成分研究報道較少。李火云等對擬缺香茶菜 Isodon excisoides 全草的化學成分進行研究,分離得到 24 個化合物,其中化合物1鑒定為:

(E)-5-hydroxy-1-(4-hydroxy-3-methoxyphenyl)-5-(4-hydroxyphenyl) pent-1-en-3-one,該化合物 為新化合物,命名為擬缺香茶菜酮。其分子結構為:

本發明發現擬缺香茶菜酮在制備細胞凍存液的應用和方法,其適用于免疫細胞長期保存,并能夠在復蘇后保持其細胞特性。

發明內容

本發明旨在至少解決現有技術中存在的技術問題之一。為此,本發明的一個目的在于提出一種擬缺香茶菜酮在制備細胞凍存液的應用和方法,其可降低適用于免疫細胞長期保存,并能夠在復蘇后保持其細胞特性。

擬缺香茶菜酮為:

(E)-5-hydroxy-1-(4-hydroxy-3-methoxyphenyl)-5-(4-hydroxyphenyl) pent-1-en-3-one,其分子結構為:

根據本發明的一個方面,本發明提供了一種細胞凍存液。根據本發明實施例,該細胞凍存液凍存的細胞種類不受特別的限制,只要凍存液能用于長期保存細胞即可。

作為本發明的一個技術方案,該凍存液包括0.5體積%的DMSO,0.005-0.008體積%的擬缺香茶菜酮;DMSO是二甲基亞砜, 用途廣泛。用作乙炔、芳烴、二氧化硫及其他氣體的溶劑以及腈綸纖維紡絲溶劑。是一種即溶于水又溶于有機溶劑的極為重要的非質子極性溶劑。對皮膚有極強的滲透性,有助于藥物向人體滲透。也可作為農藥的添加劑。也是一種十分重要的化學試劑。

DMSO也是一種滲透性保護劑,能夠降低細胞冰點,減少冰晶的形成,減輕自由基對細胞損害,改變生物膜對電解質、藥物、毒物和代謝產物的通透性。

但研究表明,DMSO存在一定的毒性作用,與蛋白質疏水基團發生作用,導致蛋白質變性,具有血管毒性和肝腎毒性。及余量培養基。因此,從安全角度考慮,應該盡量降低其使用量。

本發明人驚奇的發現,擬缺香茶菜酮可以顯著減少DMSO的使用量,該凍存液能夠有效用于保存細胞,尤其是免疫細胞,并且凍存時間長(凍存時間可達幾年甚至更長),細胞復蘇后依然保持良好的細胞活力,活性好,細胞回收率高,尤其適用于大規模免疫細胞的冷凍保存。

本發明的有益之處在于:

本發明公開了一種擬缺香茶菜酮在制備細胞凍存液的應用和方法,其可降低DMSO的用量,降低毒性,增加安全性,而且不需要使用血漿,無傳染源,適用于免疫細胞長期保存,并能夠在復蘇后保持其細胞特性。

具體實施方式

下面將結合實施例對本發明的方案進行解釋。本領域技術人員將會理解,下面的實施例僅用于說明本發明,而不應視為限定本發明的范圍。實施例中未注明具體技術或條件的,按照本領域內的文獻所描述的技術或條件或者按照產品說明書進行。所用試劑或儀器未注明生產廠商者,均為可以通過市購獲得的常規產品。

實施例1:

分離獲得臍帶血單個核細胞,將單個核細胞細胞接種到加有20ml培養基的培養瓶中,培養基配比為:18ml OpTmizer? CTS? T-cell expansion SFM培養基+2ml自體血漿(Autologous plasma)+終濃度1000IU/ml Pepro Tech IL-2+終濃度0.01KE/ml沙培林(OK432),37℃,5%CO2無菌培養,記為第0天。每日觀察細胞,并進行適當傳代擴增,培養基配比為培養基配比為:OpTmizer? CTS? T-cell expansion SFM培養基+10%自體血漿(Autologous plasma)+終濃度1000IU/ml Pepro Tech IL-2,誘導擴增得到免疫細胞。

免疫細胞的凍存和復蘇方法:

將上述體外誘導擴增第10天獲得的免疫細胞分別采用凍存液進行凍存,凍存液的成份如下:

該凍存液包括0.5體積%的DMSO, 0.008體積%的擬缺香茶菜酮;以及余量培養基。

凍存液剩余體積的均為1640培養基。

按照以下步驟凍存免疫細胞:將冷凍保存液與細胞混勻后,速移入凍存管,并放入凍存盒中,-80℃程序降溫過夜,次日轉入液氮內。其中,每107個免疫細胞采用1.5ml凍存液。

冷凍保存免疫細胞30d,然后進行復蘇。

檢測凍存前后細胞的存活率,以及復蘇后細胞回收率。具體地,凍存前以及凍存并復蘇后的細胞存活率計算方法為:【活細胞數/(活細胞數+死細胞數)】×100%。復蘇后細胞回收率的計算方法為:(復蘇后活細胞數/凍存時活細胞數)×100%。

利用流式細胞儀檢測免疫細胞細胞表面標志CD3-CD56+和CD3+CD4+的表達情況。

實施例2:

其他條件如實施例1,但是凍存液的成份如下:

該凍存液包括0.8體積%的DMSO,0.005體積%的擬缺香茶菜酮;以及余量培養基。

實施例3:

其他條件如實施例1,但是凍存液的成份如下:

該凍存液包括0.6體積%的DMSO,0.006體積%的擬缺香茶菜酮;以及余量培養基。

實施例4:

其他條件如實施例1,但是凍存液的成份如下:

該凍存液包括0.7體積%的DMSO,0.008體積%的擬缺香茶菜酮;以及余量培養基。

實施例5:

其他條件如實施例1,但是凍存液的成份如下:

該凍存液包括0.9體積%的DMSO, 0.008體積%的擬缺香茶菜酮;以及余量培養基。

實施例6:

各組凍存液的細胞回收率為:

細胞回收率(%) 實施例1 63.8 實施例2 65.1 實施例3 95.6 實施例4 61.8 實施例5 62.3

實施例1-5凍存后,細胞表面標志表達情況與凍存前相比均無顯著差別。

實施例7:

對比實驗:

D1:5體積% DMSO;

D2:10體積%DMSO;

D3:1積% DMSO;

對比實驗各組凍存液的細胞回收率為:

細胞回收率(%) D1 62.9 D2 77.0 D3 35.6

可見,DMSO對免疫細胞具有較好的保護作用,如想達到較好的回收率,DMSO的濃度必須為10體積%或者更高。

實施例8:

本發明人發現,實施例3的配比相對于其他實施例具有顯著的更高的細胞回收率,為了驗證其可重復性,進行了5次重復實驗,結果如下:

細胞回收率(%) 1 95.3 2 96.1 3 95.5 4 95.1 5 96.2

結果表明,實施例3的配比確實具有顯著的更好的凍存效果,具有很好的重復性。

在本說明書的描述中,參考術語“一個實施例”、“一些實施例”、“示例”、“具體示例”、或“一些示例”等的描述意指結合該實施例或示例描述的具體特征、結構、材料或者特點包括于本發明的至少一個實施例或示例中。在本說明書中,對上述術語的示意性表述不一定指的是相同的實施例或示例。而且,描述的具體特征、結構、材料或者特點可以在任何的一個或多個實施例或示例中以合適的方式結合。

盡管已經示出和描述了本發明的實施例,本領域的普通技術人員可以理解:在不脫離本發明的原理和宗旨的情況下可以對這些實施例進行多種變化、修改、替換和變型,本發明的范圍由權利要求及其等同物限定。

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