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一種復合微生物菌液的制備及其應用方法.pdf

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一種 復合 微生物 制備 及其 應用 方法
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摘要
申請專利號:

CN201610012398.X

申請日:

20160108

公開號:

CN106954639A

公開日:

20170718

當前法律狀態:

有效性:

審查中

法律詳情:
IPC分類號: A01N63/00,A01N63/04,A01P1/00,A01P3/00,A01G13/00 主分類號: A01N63/00,A01N63/04,A01P1/00,A01P3/00,A01G13/00
申請人: 康源綠洲生物科技(北京)有限公司,康源綠洲微生物技術(北京)有限公司
發明人: 張進,宋玉莊
地址: 100096 北京市海淀區清河西小口路27號南樓無憂港商務樓2301室
優先權: CN201610012398A
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法律狀態
申請(專利)號:

CN201610012398.X

授權公告號:

法律狀態公告日:

法律狀態類型:

摘要

本發明公開了一種復合微生物菌液的制備及其應用方法,首先將休眠狀態的沼澤紅假單胞菌、植物乳桿菌、釀酒酵母菌采用不同的培養基分別活化,然后進行液體試管培養以及一級、二級、三級種子液分別培養,培養完成后按1∶1∶1的比例提取并接入發酵罐中混合培養,混合培養產生穩定狀態的菌液與無菌水稀釋,最后得到復合微生物菌液。通過該方法制備的復合微生物菌液可以快速到達病原菌侵染位置,對其抑制殺滅迅速且沒有任何副作用,同時可有效刺激病變處愈合,促進林木生長。

權利要求書

1.一種復合微生物菌液的制備方法,其特征在于制備步驟如下:第一步:休眠菌種活化將休眠狀態的沼澤紅假單胞菌、植物乳桿菌、釀酒酵母菌分別接入試管斜面活化;其中沼澤紅假單胞菌采用光合培養基培養,置于恒溫培養箱厭氧培養3-5天,溫度控制在28-30度;植物乳桿菌采用MRS培養基培養,培養溫度30度,連續培養48-72小時;釀酒酵母采用麥芽汁瓊脂I培養基培養,培養溫度30度,連續培養48-72小時;第二步:液體試管培養;將第一步活化后的沼澤紅假單胞菌、植物乳桿菌、釀酒酵母菌分別接入裝有培養液的試管,混合搖勻后置培養箱培養3-5小時,待菌液狀態均一培養成熟后,再接入三角搖瓶培養8-12小時;培養液的組份為3%食鹽水、10%胃液素、0.5%的甘油和86.5%純凈水;第三步:一級種子液分別培養將第二步三角搖瓶中的菌液分別接入體積1立方米的種子罐中,30度條件下經培養后稱為一級種子;第四步:二級、三級種子液分別培養將一級種子接入體積2立方米的種子罐內,30度條件下經培養后稱為二級種子;將二級種子轉入發酵罐內發酵,30度條件下經培養后稱為三級種子;其中每級種子液培養時間均為48-72小時;第四步:種子液混合培養三級種子液培養完畢后,按1∶1∶1的比例提取并接入發酵罐中混合培養,培養溫度為30度,培養時間為48-72小時;第五步:菌液達到穩定的狀態發酵罐中的菌液混合培養48-72小時后,菌液達到穩定狀態,氣味酸香,顏色為紅褐色且均一,細致不粘稠;第六步:菌液稀釋向第五步中得到的穩定狀態的菌液中通入無菌水,其中菌液與無菌水比例為2∶8,稀釋后的菌液即為復合微生物菌液。2.如權利要求1所述的一種復合微生物菌液的制備方法,其特征在于,所述第一步中沼澤紅假單胞菌采用光合培養基為:KHPO1.0g、CaCl0.1g、NaHCO3.0g、乙酸鈉1.0g、MgCl0.5g、NHCl1.0g、NaCl1.0g、微量元素溶液1.0ml、維生素溶液1.0ml、琥珀酸鈉1.0g、酵母提取物0.5g、蛋白胨0.5g、蒸餾水1.0L,接種量為1.5-5%,培養PH值為6.8,培養溫度為30℃,光照強度為3500-4500勒克斯,培養時間為5-8天;植物乳桿菌采用的MRS培養基為:葡萄糖10.0g、蛋白胨10.0g、酵母提取物5g、瓊脂20g、蒸餾水1.0L,接種量為1.5-5%,培養PH值為5-7,培養溫度為25-28℃,培養時間為1-2天;麥芽汁瓊脂I培養基為:12Brix麥芽汁1.0L、瓊脂15.0g、ph值為6-7,培養溫度為25-28℃,培養時間為1-2天。3.一種復合微生物菌的使用方法:其特征在于:針對患病的樹木,稀釋權利要求1所述的復合微生物菌液50-100倍后噴灑于林木患病處;針對生長過程中的樹木,稀釋復合微生物菌液100-150倍枝葉噴灑及灌根,達到預防病害的目的。

說明書

技術領域

本發明涉及一種微生物菌液的制備方法,該微生物菌液應用于果樹的真菌性及細菌性病害防治。

背景技術

目前,綠化樹木、果樹及核果類樹木的輪紋病、炭疽、黑星病、流膠病等真菌性病害較為普遍,核果類樹木的細菌性根癌癥也會危害樹木的健康,影響水果的產量,對于這些情況,果農一般會使用堿式硫酸銅或氯溴異氰脲酸等進行預防,上述物質的使用會使有害重金屬以及氯離子在果樹上產生積累后進入果實中,人們食用后必然會對人體產生危害;而病蟲害發生后,則使用波爾多液進行噴灑,這些殘留物很難徹底的去除,同樣對人體造成極大危害。

此外,人們在對果樹及綠化樹木修剪,環剝后會留下傷口,病源菌同樣容易通過傷口侵入樹木的內部,阻礙傷口的愈合,甚至會造成林木的死亡。

發明內容

有鑒于此,本發明提供了一種復合微生物菌液的制備及其應用方法,通過該方法制備的復合微生物菌液可以快速到達病原菌侵染位置,對其抑制殺滅迅速且沒有任何副作用,同時可有效刺激病變處愈合,促進林木生長。

一種復合微生物菌液的制備方法,其制備步驟如下:

第一步:休眠菌種活化

將休眠狀態的沼澤紅假單胞菌、植物乳桿菌、釀酒酵母菌分別接入試管斜面活化;其中沼澤紅假單胞菌采用光合培養基培養,置于恒溫培養箱厭氧培養3-5天,溫度控制在28-30度;植物乳桿菌采用MRS培養基培養,培養溫度30度,連續培養48-72小時;釀酒酵母采用麥芽汁瓊脂I培養基培養,培養溫度30度,連續培養48-72小時;

第二步:液體試管培養;

將第一步活化后的沼澤紅假單胞菌、植物乳桿菌、釀酒酵母菌分別接入裝有培養液的試管,混合搖勻后置培養箱培養3-5小時,待菌液狀態均一培養成熟后,再接入三角搖瓶培養8-12小時;培養液的組份為3%食鹽水、10%胃液素、0.5%的甘油和86.5%純凈水;

第三步:一級種子液分別培養

將第二步三角搖瓶中的菌液分別接入體積1立方米的種子罐中,30度條件下經培養后稱為一級種子;

第四步:二級、三級種子液分別培養

將一級種子接入體積2立方米的種子罐內,30度條件下經培養后稱為二級種子;將二級種子轉入發酵罐內發酵,30度條件下經培養后稱為三級種子;其中每級種子液培養時間均為48-72小時;

第四步:種子液混合培養

三級種子液培養完畢后,按1∶1∶1的比例提取并接入發酵罐中混合培養,培養溫度為30度,培養時間為48-72小時;

第五步:菌液達到穩定的狀態

發酵罐中的菌液混合培養48-72小時后,菌液達到穩定狀態,氣味酸香,顏色為紅褐色且均一,細致不粘稠;

第六步:菌液稀釋

向第五步中得到的穩定狀態的菌液中通入無菌水,其中菌液與無菌水比例為2∶8,稀釋后的菌液即為復合微生物菌液。

進一步地,所述第一步中沼澤紅假單胞菌采用光合培養基為:KH2PO41.0g、CaCl 0.1g、NaHCO33.0g、乙酸鈉1.0g、MgCl20.5g、NH4Cl 1.0g、NaCl 1.0g、微量元素溶液1.0ml、維生素溶液1.0ml、琥珀酸鈉1.0g、酵母提取物0.5g、蛋白胨0.5g、蒸餾水1.0L,接種量為1.5-5%,培養PH值為6.8,培養溫度為30℃,光照強度為3500-4500勒克斯,培養時間為5-8天;

植物乳桿菌采用的MRS培養基為:葡萄糖10.0g、蛋白胨10.0g、酵母提取物5g、瓊脂20g、蒸餾水1.0L,接種量為1.5-5%,培養PH值為5-7,培養溫度為25-28℃,培養時間為1-2天;

麥芽汁瓊脂I培養基為:12Brix麥芽汁1.0L、瓊脂15.0g、ph值為6-7,培養溫度為25-28℃,培養時間為1-2天。

一種復合微生物菌的使用方法:

針對患病的樹木,稀釋復合微生物菌液50-100倍后噴灑于林木患病處;

針對生長過程中的樹木,稀釋復合微生物菌液100-150倍枝葉噴灑及灌根,達到預防病害的目的。

有益效果:

本發明通過純生物手段制備出微生物菌液,通過微生物菌液來對樹木中存在的病原菌進行防治,能夠有效的避免化學農藥對樹木產生的副作用以及對環境造成的危害,同時也杜絕了果樹上的果實的農藥殘留對人們身體健康帶來的危害。

附圖說明

圖1為本發明的制備工藝流程圖。

具體實施方式

下面結合附圖并舉實施例,對本發明進行詳細描述。

如附圖1所示,本發明提供了一種復合微生物菌液的制備方法,其制備步驟如下:

第一步:休眠菌種活化

將休眠狀態的沼澤紅假單胞菌、植物乳桿菌、釀酒酵母菌分別接入試管斜面活化;其中沼澤紅假單胞菌采用光合培養基培養,置于恒溫培養箱厭氧培養4天,溫度控制在29度;植物乳桿菌采用MRS培養基培養,培養溫度30度,連續培養48小時;釀酒酵母采用麥芽汁瓊脂I培養基培養,培養溫度30度,連續培養50小時;

第二步:液體試管培養

將第一步活化后的沼澤紅假單胞菌、植物乳桿菌、釀酒酵母菌分別接入裝有培養液的試管,混合搖勻后置培養箱培養3小時,待菌液狀態均一培養成熟后,再接入三角搖瓶培養8小時;培養液的組份為3%食鹽水、10%胃液素、0.5%的甘油和86.5%純凈水;

第三步:一級種子液分別培養

將第二步三角搖瓶中的菌液分別接入體積1立方米的種子罐中,30度條件下經培養后稱為一級種子;

第四步:二級、三級種子液分別培養

將一級種子接入體積2立方米的種子罐內,30度條件下經培養后稱為二級種子;將二級種子轉入發酵罐內發酵,30度條件下經培養后稱為三級種子;其中每級種子液培養時間均為48-72小時;

第四步:種子液混合培養

三級種子液培養完畢后,按1∶1∶1的比例提取并接入發酵罐中混合培養,培養溫度為30度,培養時間為50小時;

第五步:菌液達到穩定的狀態

發酵罐中的菌液混合培養60小時后,菌液達到穩定狀態,氣味酸香,顏色為紅褐色且均一,細致不粘稠;

第六步:菌液稀釋

向第五步中得到的穩定狀態的菌液中通入無菌水,其中菌液與無菌水比例為2∶8,稀釋后的菌液即為復合微生物菌液。

所述第一步中沼澤紅假單胞菌采用光合培養基為:KH2PO41.0g、CaCl 0.1g、NaHCO33.0g、乙酸鈉1.0g、MgCl20.5g、NH4Cl 1.0g、NaCl 1.0g、微量元素溶液1.0ml、維生素溶液1.0ml、琥珀酸鈉1.0g、酵母提取物0.5g、蛋白胨0.5g、蒸餾水1.0L,接種量為1.5%,培養PH值為6.8,培養溫度為30℃,光照強度為3500勒克斯,培養時間為5天;

植物乳桿菌采用的MRS培養基為:葡萄糖10.0g、蛋白胨10.0g、酵母提取物5g、瓊脂20g、蒸餾水1.0L,接種量為1.5%,培養PH值為6,培養溫度為25℃,培養時間為1天。

麥芽汁瓊脂I培養基為:12Brix麥芽汁1.0L、瓊脂15.0g、ph值為6,培養溫度為25℃,培養時間為2天。

實施例1:桃樹炭疽病的預防與治療

山西運城劉先生經營一個桃樹園區,每年桃樹都會受到炭疽病不同程度的侵襲,使用我公司菌液進行對照處理,即20棵不使用菌液處理其他預防措施正常使用,另20棵使用菌液預防處理同時其他預防措施正常使用(如其他預防措施使用農藥或殺蟲劑類,應等到其失去藥效再使用菌液)。2個月后,未使用菌液處理的20棵桃樹有2棵患病,提取患處成分化驗分析為植物性真菌炭疽病,另20棵使用菌液預防處理沒有患此病現象。對于兩棵患病樹木的患病處噴施50-100倍菌液,間隔7天噴施一次,噴施3次后提取患處成分分析,炭疽真菌數量減少,5次后恢復正常。

實施例2:山東濰坊杏樹根癌癥的預防與治療山東濰坊種植園區,每年杏樹都會受到根癌癥不同程度的侵襲,園區負責人使用我公司菌液進行預防與治療對照處理,即20棵不使用菌液處理其他預防措施正常使用,另20棵使用菌液預防處理同時其他預防措施正常使用(如其他預防措施使用農藥或殺蟲劑類,應等到其失去藥效再使用菌液)。2個月后,未使用菌液處理的20棵杏樹有2棵患病,提取患處成分化驗分析為由致瘤農桿菌引起的細菌性根癌癥,另20棵使用菌液預防處理沒有患此病現象。對于兩棵患病樹木的患病處噴施50-100倍菌液,間隔7天噴施一次,噴施3次后提取患處成分分析,致瘤農桿菌數量減少,5次后恢復正常。

綜上所述,以上僅為本發明的較佳實施例而已,并非用于限定本發明的保護范圍。凡在本發明的精神和原則之內,所作的任何修改、等同替換、改進等,均應包含在本發明的保護范圍之內。

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