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一種龍腦樟試管苗增殖及復壯方法.pdf

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一種 龍腦樟 試管 增殖 復壯 方法
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摘要
申請專利號:

CN201710202401.9

申請日:

20170330

公開號:

CN106942060A

公開日:

20170714

當前法律狀態:

有效性:

有效

法律詳情:
IPC分類號: A01H4/00 主分類號: A01H4/00
申請人: 湖南省林業科學院
發明人: 何洪城,李劉澤木,楊夕寬,何可丹
地址: 410004 湖南省長沙市天心區韶山南路658號
優先權: CN201710202401A
專利代理機構: 長沙永星專利商標事務所(普通合伙) 代理人: 周詠;林毓俊
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法律狀態
申請(專利)號:

CN201710202401.9

授權公告號:

法律狀態公告日:

法律狀態類型:

摘要

本發明涉及一種龍腦樟試管苗增殖及復壯方法,包括試管苗的增殖培養和復壯培養。龍腦樟試管苗增殖培養以改良MS為基本培養基,并附加分裂素6?BA?0.8~1.2mg/L、生長素NAA0.045~0.055mg/L、赤霉素GA3?0.1~0.3mg/L、防褐劑AgNO3?1.0~2.0mg/L,先黑暗培養1~3天后轉光照培養,培養周期為25~35天;連續增殖培養三代后進行復壯培養,以改良1/2MS為基本培養基,附加生長素NAA0.045~0.055mg/L、活性炭1.0~1.5g/L、椰汁50~100ml/L,光照培養15~20天,每增殖培養三代后進行一代復壯培養。本發明克服了龍腦樟試管苗長期離體培養下出現的增殖系數不高、玻璃化和褐化、葉片發黃萎蔫等問題,提供了一種增殖系數高,有效降低玻璃化和褐化,保證龍腦樟試管苗生長質量的增殖壯苗培養方法。

權利要求書

1.一種龍腦樟試管苗增殖及復壯方法,其特征在于包括下述的步驟:1)將龍腦樟不定芽接種于增殖培養基中,進行增殖培養;所述增殖培養基以改良MS培養基為基本培養基,并附加分裂素6-BA0.8~1.2mg/L、生長素NAA0.045~0.055mg/L、赤霉素GA0.1~0.3mg/L、防褐劑AgNO1.0~2.0mg/L、蔗糖25~35g/L以及卡拉膠5.0~6.0g/L;所述改良MS培養基:氯化鈣含量為MS培養基的2倍,硝酸銨含量為MS培養基的1/4,其他成分含量與MS培養基相同;所述增殖培養條件為:先置于黑暗環境下培養1~3天,之后轉光照培養,增殖培養周期為25~35天;2)將不定芽接種于復壯培養基中,每連續增殖培養三代后進行一次復壯培養;所述復壯培養基以改良1/2MS培養基為基本培養基,并附加生長素NAA0.045~0.055mg/L、活性炭1.0~1.5g/L、椰汁50~100ml/L、蔗糖25~35g/L以及卡拉膠5.0~6.0g/L;所述改良1/2MS培養基:大量元素含量為改良MS培養基的1/2,其他成分與改良MS培養基相同;所述復壯培養條件為:光照培養,培養周期為15~20天。2.根據權利要求1所述的龍腦樟試管苗增殖及復壯方法,其特征在于:切取龍腦樟叢生芽上莖段長度為1~2cm的不定芽,切去葉片,在距芽基部1/3處進行平切刻傷后接種于增殖培養基。3.根據權利要求1所述的龍腦樟試管苗增殖及復壯方法,其特征在于:增殖培養中的光照培養光照強度2000~3000lx,光照周期12h/d,培養溫度25±1℃。4.根據權利要求1所述的龍腦樟試管苗增殖及復壯方法,其特征在于:增殖培養末期獲得的叢生芽為材料,切取健壯的不定芽并保留2~3片葉,接種于復壯培養基。5.根據權利要求1所述的龍腦樟試管苗增殖及復壯方法,其特征在于:復壯培養中光照強度2000~3000lx,光照周期12h/d,培養溫度25±1℃。

說明書

技術領域

本發明屬于組織培養技術領域,具體涉及一種龍腦樟試管苗增殖及復壯的方法。

背景技術

龍腦樟系我國首次發現的一種樟樹(Cinnamomum camphora)特異化學型——龍腦型樟,其葉片精油富含右旋龍腦(天然冰片),是目前最適宜提取天然冰片的植物資源,龍腦樟的發現也填補了我國不產天然冰片的歷史空白。近年來龍腦樟的繁殖以扦插為主,也可播種和嫁接。然而傳統繁殖方法增殖系數低、周期長、占地面積大,遠遠不能滿足商品苗規模化、規范化生產的需要,是阻礙我國天然冰片產業發展的主要因素。植物組織培養技術具有繁殖周期短,增殖系數高等優點,已是公認的植物快速繁殖的有效途徑。

目前,關于龍腦樟組織培養技術的研究極少,有關龍腦樟試管苗在長期離體培養過程中出現的玻璃化、褐化及葉片萎蔫等問題的系統研究更未見報道。劉秀芳(2011)等人雖然對龍腦樟組織培養程序和步驟進行了初步探究,但該技術仍然難以應用于生產,其試管苗增殖系數低、玻璃化及褐化嚴重是主要原因。最新發表的龍腦樟增殖方法如下:

(1)切取龍腦樟不定芽接種至含細胞分裂素6-BA 2.0mg/L、ZT 0.1mg/L以及生長素IBA0.5mg/L的增殖培養基MS中,并添加卡拉膠3.0g/L,蔗糖30g/L,pH=7.0。接種后,組培苗置于25~26℃下光照培養40天以促進增殖。光照時間和光照強度未說明。(戴小英,2016)

(2)切取龍腦樟不定芽接種至含細胞分裂素6-BA 2.0mg/L、生長素NAA0.05mg/L的增殖培養基改良MS(硝酸銨減至原濃度的1/2)中,并添加卡拉膠6.5g/L,蔗糖30g/L,pH=5.8。置于25℃下光照培養30天以促進增殖,光照時間11h/d,光照強度3000lx。(劉秀芳,2011)

(3)將愈傷組織和不定芽接種于附加6-BA 0.3~2.0mg/L,生長素NAA0.05~0.2mg/L,Na2S2O3 100~300mg/L的增殖培養基改良MS(硝酸鉀和硝酸銨減至原濃度的1/2,氯化鈣成分增加20%,硫酸鹽成分加倍)中,并添加卡拉膠0.8%,蔗糖3%,pH=5.5。置于26~28℃下光照培養,光照強度1500lx~2000lx,光照周期為12h/d。(胡慶和彭建軍,2015)

上述技術(1)與(2)中,隨分裂素6-BA濃度增加,試管苗增殖系數可達2.0~6.4。但試管苗長期培養在含高濃度6-BA的培養基中會導致基部愈傷組織增多,葉片愈傷化,葉柄甚至全株玻璃化。玻璃化試管苗畸形生長,增殖系數及生根率極低,移栽后難以成活。Bornman等研究表明,6-BA的積累與不定芽分化和玻璃化是同步的,由此可見,6-BA是導致試管苗玻璃化的重要因素。技術(3)降低6-BA濃度雖然可以減輕玻璃化,但試管苗增殖系數極低(2.73),不能滿足生產需求。總之,現有的龍腦樟增殖技術均不能同時有效的解決試管苗增殖及玻璃化問題。

褐化是導致龍腦樟試管苗增殖系數不高的另一個重要因素,培養基中的酚類物質被氧化成褐色有毒的醌類物質,直接毒害試管苗,導致增殖系數及試管苗質量下降。現有龍腦樟增殖技術并未針對褐化問題進行相關研究,導致多代培養后龍腦樟試管苗褐化嚴重,葉片發黃枯萎,生根移栽困難。

發明內容

本發明是針對龍腦樟長期離體增殖培養過程中存在的增殖系數不高、玻璃化、褐化等問題,提供一種增殖系數高、有效降低玻璃化和褐化,提高試管苗質量的增殖復壯培養方法。

為實現上述目的,本發明提供如下技術方案:

a.增殖培養方式:切取龍腦樟叢生芽上莖段長度為1~2cm的不定芽,切去葉片,在距芽基部1/3處進行平切刻傷后接種于增殖培養基中。

b.增殖培養基:以改良MS(氯化鈣成分加倍,硝酸銨減至原濃度的1/4)為基本培養基(表1),并附加分裂素6-BA0.8~1.2mg/L、生長素NAA0.045~0.055mg/L、赤霉素GA3 0.1~0.3mg/L、防褐劑AgNO3 1.0~2.0mg/L、蔗糖25~35g/L以及卡拉膠5.0~6.0g/L,pH=6.0。

c.增殖培養條件:將不定芽接種于增殖培養基后,先置于黑暗環境下培養1~3天(AgNO3見光分解),之后轉光照培養,光照強度2000~3000lx,光照周期12h/d,培養溫度25±1℃,培養周期為25~35天。

d.復壯培養方式:連續增殖培養三代后轉復壯培養。以增殖培養末期獲得的叢生芽為材料,切取健壯的不定芽并保留2~3片葉,接種于復壯培養基中。

e.復壯培養基:以改良1/2MS(大量元素成分為改良MS的1/2,其他成分不變)為基本培養基,附加生長素NAA0.045~0.055mg/L、活性炭1.0~1.5g/L、椰汁50~100ml/L、蔗糖25~35g/L以及卡拉膠5.0~6.0g/L,pH=6.0。

f.復壯培養條件:將不定芽接種于復壯培養基后進行光照培養,光照強度2000~3000lx,光照周期12h/d,培養溫度25±1℃,培養周期為15~20天。

龍腦樟增殖培養過程中發生玻璃化和褐化問題是導致試管苗增殖系數及生長質量下降的主要原因。連續多代使用高濃度細胞分裂素6-BA雖然有助于提高試管苗增殖系數,但增殖的芽往往生長勢減弱,不定芽短小,發生玻璃化現象,導致無法進行生根培養;即使能夠生根,移栽成活率也不高。本發明通過調節培養基中生長調節劑種類和濃度,降低培養基中分裂素6-BA濃度,結合低濃度GA3、NAA配合使用,在提高試管苗增殖系數的同時顯著減輕玻璃化現象。

通過將MS培養基中氯化鈣含量加倍,硝酸銨含量降至原濃度1/4,從而提高培養基中Ca2+濃度,降低NH4+濃度,有利于組培苗的生長,同時能減輕組培苗葉片發黃萎蔫現象。

試管苗在離體培養過程中會產生影響植物生長和分化的乙烯,硝酸銀中的Ag+可以抑制乙烯活性,從而促進植物的生長增殖。本發明在增殖培養階段添加防褐劑AgNO3 1.0~2.0mg/L,并結合1~3天短期暗培養可顯著減輕龍腦樟試管苗褐化問題,同時提高增殖系數。

本發明在每增殖三代后交替進行復壯培養,可以改變試管苗內源激素水平平衡,減輕玻璃化,提高試管苗質量,從而有利于后期的生根和移栽。

與現有技術相比,本發明的有益效果為:

⑴本發明的增殖方式使龍腦樟試管苗增殖系數達到9.0~11.0,遠遠超出背景技術中的三種增殖方法的增殖系數水平(2.0~6.4)。

⑵試管苗基部愈傷組織極少,葉片嫩綠,莖干充實,基本無玻璃化現象,試管苗生長健壯。

⑶增殖培養過程中組培苗褐化程度明顯減輕,培養基輕微或無褐化現象,試管苗生長后期葉片正常,無發黃萎蔫現象。

⑷復壯培養能夠減輕玻璃化現象,同時調節試管苗體內激素平衡,降低外源激素對其生長的影響,有利于試管苗后期生根移栽。

具體實施方式

實施例一、

A、增殖培養:切取莖段長度為1~2cm的龍腦樟不定芽,切去全部葉片,在距側芽基部1/3處進行平切刻傷后接種于改良MS(氯化鈣加倍,硝酸銨減至原濃度的1/4)培養基(表1)中,并附加分裂素6-BA1.0mg/L、生長素NAA 0.05mg/L、赤霉素GA3 0.3mg/L、防褐劑AgNO3(見光分解)1.0mg/L、蔗糖30g/L以及卡拉膠6.0g/L,pH=6.0。培養條件:接種后先置于暗環境下培養3天(避免硝酸銀分解),之后轉光照培養,光照強度3000lx,光照周期12h/d,培養溫度25±1℃,培養周期30天。

B、復壯培養:組培苗連續增殖三代后轉復壯培養,切取健壯不定芽并保留2~3片葉,接種于含生長素NAA0.05mg/L的改良1/2MS(大量元素成分為改良MS的1/2,其他成分不變,如表1’)培養基中,并添加活性炭1.5g/L、椰汁100ml/L、蔗糖30g/L以及卡拉膠6.0g/L,pH=6.0。培養條件:接種后進行光照培養,光照強度3000lx,光照周期12h/d,培養溫度25±1℃,培養周期為20天。復壯培養之后繼續轉入增殖培養基。

表1改良MS培養基成分表

表1’改良1/2MS培養基成分表

實施例二、

與實施例一相比,步驟A中培養周期更換為25天,步驟B培養周期更換為15天。培養末期,組培苗平均增殖系數達9.28,基本無玻璃化現象。

實施例三、

與實施例一相比,步驟A、B中光照強度均更換為2000lx。培養末期,組培苗平均增殖系數達9.07,基本無玻璃化現象。

以下為本發明中各種因素對龍腦樟增殖壯苗的影響:

試驗1復壯時間對試管苗增殖及生長的影響

①材料:龍腦樟繼代培養試管苗。

②方法:試管苗連續增殖培養三代后,培養末期切取健壯不定芽并保留2~3片葉,接種于復壯培養基中進行不同時間復壯處理(0,5,10,15,20,25,30天)。以改良1/2MS附加生長素NAA 0.05mg/L,活性炭1.5g/L,椰汁100ml/L,蔗糖30g/L,卡拉膠6.0g/L,pH=6.0為復壯培養基。完成復壯培養后再將試管苗分別接種于增殖培養基。每個處理接種20個單芽,重復3次。

③培養條件與數據處理:復壯培養光照強度為3000lx,光照周期12h/d,培養溫度25±1℃。增殖培養30天后統計試管苗增殖系數、芽的質量、玻璃化率及葉片情況。

④結果:連續多代增殖培養后進行一代復壯培養可以在一定程度上減輕龍腦樟試管苗玻璃化現象,但復壯時間過長(30天)會導致試管苗分化能力下降,組織衰老,再轉入增殖培養基后表現出增殖率下降,葉片萎蔫的現象。綜合考慮,以復壯時間15~20天為最佳處理,組培苗生長健壯,且玻璃化情況明顯低于對照(表2)。

表2復壯時間對試管苗增殖及生長的影響

表注:表中數據為平均數±標準差,不同小寫字母表示在P≤0.05差異顯著。芽的質量等級:+++粗壯;++健壯;+細弱。

試驗2 6-BA和GA3濃度對試管苗增殖及生長的影響

①材料:龍腦樟繼代培養試管苗。

②方法:切取龍腦樟單芽接種于改良MS培養基中,附加生長素NAA 0.05mg/L,蔗糖30g/L,卡拉膠6.0g/L,pH=6.0,設置不同濃度的細胞分裂素6-BA(0.5,1.0,1.5,2.0mg/L)和赤霉素GA3(0,0.1,0.3,0.5mg/L)處理。每個處理接種20個單芽,重復3次。

③培養條件與數據處理:試管苗接種后進行光照培養,光照強度3000lx,光照周期12h/d,培養溫度25±1℃,培養周期為30天。連續增殖培養三代后進行復壯培養,即將不定芽接種于含NAA 0.05mg/L的改良1/2MS培養基中,并添加活性炭1.5g/L、椰汁100ml/L,光照培養20天,其余培養條件同增殖培養。增殖培養六代后統計試管苗增殖系數、葉片數、芽的質量以及玻璃化情況。

④結果:結果顯示,6-BA和GA3配合使用能夠顯著提高龍腦樟試管苗增殖系數,當6-BA濃度為1.0~2.0mg/L,GA3濃度0.1~0.3mg/L時,試管苗增殖系數顯著提高,可達6.07~9.43(表3),但試管苗玻璃化程度與生長調節劑濃度成正比。僅當6-BA濃度為1.0mg/L,GA3濃度為0.1~0.3mg/L時,試管苗增殖率高,莖干充實,葉片嫩綠,無玻璃化現象。因此,龍腦樟試管苗增殖的最佳處理為6-BA 1.0mg/L和GA3 0.1~0.3mg/L,增殖系數可達7.78~9.22,試管苗生長健壯。

表3 6-BA和GA3濃度對試管苗增殖及生長的影響

表注:表中數據為平均數±標準差,不同小寫字母表示在P≤0.05差異顯著。芽的質量等級:+++粗壯;++健壯;+細弱。

試驗3防褐劑AgNO3濃度對試管苗褐化的影響

①材料:龍腦樟繼代培養試管苗。

②方法:切取龍腦樟單芽接種于改良MS培養基,附加分裂素6-BA 1.0mg/L,赤霉素GA30.3mg/L,生長素NAA 0.05mg/L,蔗糖30g/L,卡拉膠6.0g/L,pH=6.0。設置不同濃度的防褐劑AgNO3(0,1.0,2.0,3.0mg/L)處理。每個處理接種20個單芽,重復3次。

③培養條件與數據處理:試管苗接種后先置于黑暗環境下培養3天(AgNO3見光分解),之后轉光照培養,光照強度3000lx,光照周期12h/d,培養溫度25±1℃,培養周期為30天。統計試管苗增殖系數、葉片數、芽的質量以及玻璃化情況。

④結果:添加防褐劑是目前防止褐化效果最好的方法,結果顯示,AgNO3能夠有效減輕龍腦樟試管苗褐化,但不同濃度間防治褐化效果差別不顯著。低濃度AgNO3能促進試管苗增殖,當AgNO3濃度為1.0~2.0mg/L時,試管苗增殖系數可達10.17~10.50,顯著高于對照(表4),且組培苗葉片嫩綠,生長健壯。但濃度達到3.0mg/L后試管苗增殖則受到抑制,增殖效果不如對照。因此,AgNO3濃度為1.0~2.0mg/L是龍腦樟最佳增殖處理方式。

表4防褐劑AgNO3濃度對試管苗褐化的影響

表注:表中數據為平均數±標準差,不同小寫字母表示在P≤0.05差異顯著。芽的質量等級:+++粗壯;++健壯;+細弱。褐化程度:A褐化嚴重;B褐化中等;C輕微或無褐化。

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