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一種刀孢輪枝菌可濕性粉劑及其應用.pdf

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一種 刀孢輪枝菌 可濕性粉劑 及其 應用
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摘要
申請專利號:

CN201710335384.6

申請日:

20170512

公開號:

CN106993631A

公開日:

20170801

當前法律狀態:

有效性:

審查中

法律詳情:
IPC分類號: A01N63/04,A01N25/14,A01P7/04 主分類號: A01N63/04,A01N25/14,A01P7/04
申請人: 浙江省柑桔研究所
發明人: 鹿連明,胡秀榮,杜丹超,陳國慶,王鵬,黃振東,蒲占湑
地址: 318020 浙江省臺州市黃巖區大橋路11號
優先權: CN201710335384A
專利代理機構: 福州元創專利商標代理有限公司 代理人: 蔡學俊
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法律狀態
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CN201710335384.6

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法律狀態公告日:

法律狀態類型:

摘要

本發明涉及害蟲生物防治技術領域,提供了一種刀孢輪枝菌可濕性粉劑,包括刀孢輪枝菌分生孢子純孢粉10%,潤濕劑1%;分散劑1%,紫外保護劑0.3%;孢子萌發促進劑0.1%;粘著劑0.05%;載體87.55%。本發明主要用于防治柑橘木虱和蚜蟲,在室內條件下,分生孢子濃度為108個/mL的可濕性粉劑用藥后5?d,對柑橘木虱的校正死亡率為92.50%,對蚜蟲的校正死亡率達100%。在溫室條件下,分生孢子濃度為108個/mL的可濕性粉劑用藥后7?d,對柑橘木虱的校正死亡率達100%。本發明可濕性粉劑克服了化學農藥所帶來的環境污染、農藥殘留和害蟲抗藥性等問題,是一種環境友好型防治柑橘木虱和蚜蟲的固體菌劑。

權利要求書

1.一種刀孢輪枝菌可濕性粉劑,其特征在于,包括以下質量百分數的組分:刀孢輪枝菌分生孢子純孢粉10%,潤濕劑1%,分散劑1%,紫外保護劑0.3%;孢子萌發促進劑0.1%;粘著劑0.05%;載體87.55%。2.根據權利要求1所述的刀孢輪枝菌可濕性粉劑,其特征在于,所述刀孢輪枝菌為刀孢輪枝菌()菌株ZJLP09,于2013年4月26日在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心登記保藏,保藏編號為CGMCCNo.7551。3.根據權利要求1所述的刀孢輪枝菌可濕性粉劑,其特征在于,所述的刀孢輪枝菌分生孢子純孢粉含孢量為4~4.5×10個/g,活孢率為98.12~98.88%,含水量為4~4.3%。4.根據權利要求1所述的刀孢輪枝菌可濕性粉劑,其特征在于,所述的潤濕劑為W-2002,所述的分散劑為DispwetWP-410,所述的紫外保護劑為抗壞血酸,所述的孢子萌發促進劑為氯化鈣,所述的粘著劑為黃原膠,所述的載體為凹凸棒土。5.權利要求1-4任一項所述的刀孢輪枝菌可濕性粉劑在柑橘木虱和蚜蟲防治中的應用。

說明書

技術領域

本發明涉及害蟲生物防治技術領域,更具體的,涉及一種刀孢輪枝菌可濕性粉劑及其應用。

背景技術

柑橘木虱、蚜蟲等是柑橘上的重要害蟲。這些害蟲通常聚集在柑橘的枝梢、葉片或果實上通過吸食汁液危害,造成柑橘枝梢枯死、落葉和落果,并可產生分泌物而誘發煤煙病。此外,蚜蟲還是柑橘衰退病毒、柑橘脈突病毒等病原物的自然傳播媒介。而柑橘木虱則是當前柑橘生產上防治最難、威脅最大的毀滅性病害—柑橘黃龍病的唯一自然傳播媒介。目前對于柑橘黃龍病、柑橘衰退病等病害缺乏理想的防治藥劑,“治蟲防病”通常是防控這些病害所采取的關鍵技術措施。目前對于這些害蟲的防治仍以吡蟲啉、毒死蜱等化學農藥為主,然而化學農藥的頻繁使用帶來的3R(抗性(Resistance)、再增猖獗(Resurgence)和殘留(Residue))問題日趨嚴重。隨著人們對生態環境、食品安全等問題的關注,研制安全高效的防治藥劑并建立新的病蟲害防控措施成為當前農業生產中一項緊迫的任務,也是涉及柑橘業可持續發展的重要課題。而生物農藥因具有無殘留、特異性強、不易產生抗藥性、環境相容性好、生產工藝簡單等特點越來越引起人們的重視。

在利用生防菌防治柑橘木虱、蚜蟲等害蟲的研究方面,國內外學者相繼開展了一些有益的探索。其中已報道的對柑橘木虱具致病力的真菌有玫煙色擬青霉、柑橘霉炱菌等。已報道的對橘蚜等柑橘蚜蟲有致病力的真菌有磚紅鐮孢菌等。但現有研究多集中在實驗室探索階段,市場上鮮見商品化的微生物農藥產品可供使用。而我國對柑橘害蟲生防菌的研究較少,特別是在柑橘木虱生防菌方面,我國除在上世紀80年代有零星報道外,近年來鮮有研究。

刀孢輪枝菌ZJLP09為本實驗室從浙江臺州地區的柑橘木虱蟲體上分離的一株真菌,經致病性測定,確定該菌株較蠟蚧輪枝菌等對柑橘木虱具有更強的致病力,且對柑橘蚜蟲具有強的侵染活性。通過對其生物學特性分析,確定該菌株對高溫、低溫、低濕和紫外線等具有更高的抗逆性,且其產孢量、孢子萌發率和產酶活性等均高于漸狹輪枝菌等菌株。以上研究結果表明,刀孢輪枝菌ZJLP09作為用于防治柑橘木虱、蚜蟲等害蟲的生防菌株,具有良好的開發和應用前景。

目前,國內外尚未有關于利用刀孢輪枝菌可濕性粉劑防治柑橘木虱和蚜蟲的報道。為此,通過劑型的比較、輔料的篩選等制備出一種質量穩定、應用方便的刀孢輪枝菌可濕性粉劑,可為柑橘木虱和蚜蟲等害蟲的生物防治提供一種新的材料。

發明內容

本發明所要解決的技術問題是彌補當前柑橘木虱和蚜蟲等害蟲防治中缺乏真菌生物制劑的不足,提供一種刀孢輪枝菌可濕性粉劑。

本發明的第二個目的是提供上述可濕性粉劑的制備方法。

本發明的第三個目的是提供上述可濕性粉劑在防治害蟲方面的應用,具體地,提供上述可濕性粉劑在防治柑橘木虱和蚜蟲中的應用。

本發明的目的是通過以下技術方案予以實現的:

一種刀孢輪枝菌可濕性粉劑,包括以下各質量百分數的組分:刀孢輪枝菌分生孢子純孢粉10%,潤濕劑1%;分散劑1%,紫外保護劑0.3%;孢子萌發促進劑0.1%;粘著劑0.05%;載體87.55%。

本發明所述的刀孢輪枝菌為刀孢輪枝菌(Lecanicillium psalliotae)菌株ZJLP09(201310167685.4中已公開),于2013年4月26日在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心登記保藏,保藏編號為CGMCC No. 7551。

優選地,本發明所述刀孢輪枝菌分生孢子純孢粉含孢量為4~4.5×1011個/g,活孢率為98.12~98.88%,含水量為4~4.3%。

優選地,本發明所述的潤濕劑為W-2002,所述的分散劑為Dispwet WP-410,所述的紫外保護劑為抗壞血酸,所述的孢子萌發促進劑為氯化鈣,所述的粘著劑為黃原膠,所述的載體為凹凸棒土。

所述可濕性粉劑的制備方法:上述優選的載體、潤濕劑、分散劑、紫外保護劑、孢子萌發促進劑和粘著劑等按比例混合,再加入10%刀孢輪枝菌分生孢子粉,攪拌均勻,過325目標準篩,充分攪拌混勻即制得刀孢輪枝菌可濕性粉劑。

提供所述刀孢輪枝菌可濕性粉劑在柑橘木虱和蚜蟲防治中的應用。

與現有技術相比,本發明的有益效果如下:

本發明的刀孢輪枝菌可濕性粉劑產品性能指標優良,含孢量為4.05×1010個/g,活孢率為93.65%,含水量為1.62%,潤濕時間為78.50s,孢子懸浮率為86.78%,細度為98.56%,pH為6.80。

本發明的刀孢輪枝菌可濕性粉劑可用于防治柑橘木虱和蚜蟲,在室內條件下,分生孢子濃度為108個/mL的可濕性粉劑在用藥后5 d,對柑橘木虱的校正死亡率為92.50%,對蚜蟲的校正死亡率可達100%。在溫室條件下,分生孢子濃度為108個/mL的可濕性粉劑在用藥后7 d,對柑橘木虱的校正死亡率可達100%。

本發明的刀孢輪枝菌可濕性粉劑克服了化學農藥產生的環境污染、農藥殘留和害蟲抗藥性等問題,是一種高效、安全、環境友好的生防菌制劑,為柑橘木虱和蚜蟲的生物防治提供了一種新的材料。

具體實施方式

下面通過實施例對本發明做進一步具體描述。下述所使用的實驗方法若無特殊說明,均為本技術領域現有的常規方法。所使用的的配料、試劑或材料,如無特殊說明,均為可通過商業途徑得到的配料、試劑或材料。本發明不應限制于實施例范圍。

實施例1:刀孢輪枝菌ZJLP09分生孢子純孢粉的制備與質量測定

1. 一級固體培養

在超凈工作臺中以無菌接種針挑取冰箱保存的刀孢輪枝菌ZJLP09菌塊,接種至馬鈴薯葡萄糖培養基(PDA,配方為:馬鈴薯200 g,葡萄糖20 g,瓊脂20 g,蒸餾水1000 mL,自然pH)平板中,之后置于微生物培養箱中28 ℃恒溫培養7 d。

2. 二級液體培養

以直徑5mm的無菌打孔器在上述培養的刀孢輪枝菌ZJLP09菌落周圍打取菌餅,接種到含沙氏葡萄糖酵母培養液(SDY,配方為:酵母浸出粉10 g,葡萄糖40 g,蛋白胨10 g,蒸餾水1000 mL,pH 6.0)的三角瓶中(SDY培養液裝液量為40%,每瓶接種3個菌餅),在28 ℃恒溫搖床下以轉速180 rpm/min震蕩培養3 d。吸取上述培養的分生孢子懸浮液,以5%的接種量分別加入到各含沙氏葡萄糖酵母培養液的三角瓶中(SDY培養液裝液量為40%),在28 ℃恒溫搖床下以轉速180 rpm/min震蕩培養5 d。

3. 分生孢子粉的干燥制備

收集上述各三角瓶中刀孢輪枝菌ZJLP09震蕩培養產物,以4層無菌紗布過濾除去菌絲體,將收集的濾液分裝于各無菌的 50 mL離心管中,置于冷凍離心機中以轉速12000 rpm/min 離心20 min,棄去上清液,收集分生孢子沉淀。以20%的脫脂奶粉溶液懸浮沉淀后,將分生孢子懸浮液置于超低溫冰箱中預冷過夜,然后取出置于冷凍干燥機中冷凍24 h。在超凈工作臺中,將冷凍干燥產物置于高壓滅菌后的研磨中,研磨粉碎,制備獲得菌株ZJLP09的凍干孢子粉,將其分裝于各無菌玻璃瓶中,置于冰箱保存備用。

4. 分生孢子粉質量指標測定

(1)含孢量測定:取 0.01 g 孢子粉于 1 mL 含 0.5% Tween-80 的無菌水試管中,渦旋振蕩 5 min使孢子分散成均勻的懸液,將孢子懸液稀釋后用血球計數板在顯微鏡下計數,重復 3 次,計算平均值。本實驗中所用血球計數板規格為25格×16格,計數時只需計算雙線計數區內四角的四個中格和中央一中格的孢子總數。含孢量計算方法見下列公式:含孢量(個/g)=5個中方格孢子總數/5×25×10×103×稀釋倍數×100。結果見表1。

(2)活孢率測定:吸取50 μL分生孢子懸浮液,與等量的孢子萌發液(配方為:20 g蔗糖,5 g蛋白胨,1mL吐溫80,蒸餾水1000 mL)混勻,滴加到無菌玻片中央,然后將玻片置于培養皿中的U型玻璃棒上,培養皿底部鋪有無菌濾紙,滴加2 mL無菌水至濾紙上保濕,然后將培養皿置于微生物培養箱中28 ℃恒溫培養,每處理做3個重復。培養一段時間后,取出玻片,置于顯微鏡下隨機計數200~300個孢子,以形成芽管或菌絲視為萌發,按照下列公式計算孢子萌發率:孢子萌發率(%)=計數區萌發的孢子數/計數區孢子總數×100。結果見表1。

(3)含水量測定:準確稱取 0.1 g 孢子粉于已恒重的 9 cm 培養皿中,于 100℃的數顯鼓風干燥箱中干燥至恒重,將孢子粉與器皿一起稱重,計算孢子含水量。試驗做 3 個平行,取平均值。含水量計算方法見公式:含水量(%)=(恒重前皿孢總質量-恒重后皿孢總質量)/孢子總質量×100。結果見表1。

表1 刀孢輪枝菌ZJLP09分生孢子粉的質量指標

實施例2:刀孢輪枝菌ZJLP09可濕性粉劑載體和助劑的篩選

1. 載體的篩選

用于篩選的載體有高嶺土、碳酸鈣、滑石粉、膨潤土、硅酸、硅藻土、白炭黑和凹凸棒土,均購自上海世澤生物科技有限公司。

(1)載體對孢子萌發的影響:將上述載體粉末按以5%(w/v)的比例與融化的PDA培養基混合,滅菌后制成平板。取0.1 mL 孢子濃度約為 103個/mL 的菌株ZJLP09分生孢子懸浮液,涂布在含不同載體的各平板上。以不含載體的 PDA 平板為對照。每處理設置 3 個重復。將所有處理的平板置于 28 ℃下培養2-3 d。觀察各平板長出的刀孢輪枝菌菌落形成單位數并計算孢子萌發率。

(2)載體對菌絲生長的影響:按上述方法制備含各種載體的平板。用直徑5mm打孔器取培養7 d的刀孢輪枝菌邊緣生長旺盛的菌絲塊,接種到各培養基上,每處理設置3個重復,然后置于28 ℃恒溫培養下培養,于培養不同時間測量各菌落的直徑。

刀孢輪枝菌ZJLP09與各載體的生物相容性測定結果如表2所示。由表2可知,其中硅酸和凹凸棒土可促進菌株ZJLP09孢子萌發,培養2 d后菌落數分別可達117.33個和108.67個。二氧化硅和凹凸棒土可明顯促進菌株ZJLP09的菌絲生長。綜合考慮,選用凹凸棒土作為載體用于刀孢輪枝菌ZJLP09的可濕性粉劑制備。

表2 各載體與刀孢輪枝菌ZJLP09的生物相容性

注:同列中數字后面標注不同小寫字母表示在P<0.05水平差異顯著

2. 潤濕劑篩選

用于篩選的潤濕劑有:十二烷基硫酸鈉SDS,為Amersco公司產品;十二烷基苯磺酸鈉SDBS,為天津博迪化工股份有限公司產品;Morwet EFW、Morwet I、Petro AA和Berol 790A購自南京捷潤科技有限公司;凈洗劑LS和拉開粉BX,購自青島優索化學科技有限公司;W-2001、W-2002和W-2005,為北京漢莫克化學技術有限公司產品。

(1)潤濕力測定:將各潤濕劑按1%、3%和 5% (w/w)的比例及刀孢輪枝菌分生孢子粉10%的比例加入凹凸棒土中,混合均勻,制成潤濕劑含量不同但孢子含量相同的樣品。準確稱取樣品0.1 g,從燒杯口齊平位置一次均勻倒進盛有100 mL 標準硬水的150 mL 燒杯液面上,加樣品時立即用秒表記時,直至樣品全部潤濕為止,記下潤濕時間,如此重復5 次,取平均值作為各樣品的潤濕時間。以不加潤濕劑的樣品作為對照。

(2)生物相容性測定:將各潤濕劑粉末按 125 μg/mL、500 μg/mL 和 2000 μg/mL四種濃度的比例與融化的PDA培養基混合,高壓滅菌后制成平板。取0.1 mL 濃度為103個/mL的刀孢輪枝菌孢子懸浮液,涂布在含不同載體的各平板上。以不含潤濕劑的 PDA 平板為對照。每處理設置 3個重復。將所有處理的平板置于 28 ℃下培養2-3 d。觀察各平板長出的刀孢輪枝菌菌落形成單位數并計算孢子萌發率。按上述方法制備含各種載體的平板。用直徑5 mm打孔器取培養7 d的刀孢輪枝菌邊緣生長旺盛的菌絲塊,接種到各培養基上,每處理設置3個重復,然后置于28 ℃恒溫培養下培養,于培養不同時間測量各菌落的直徑。

各潤濕劑對菌株ZJLP09分生孢子的潤濕效果如表3所示,與菌株ZJLP09的生物相容性如表4所示。由表3可知,在各潤濕劑含量為1%時, W2002潤濕力最強,潤濕時間僅為8.47 s。由表4可知,在濃度為125 μg/mL時,添加潤濕劑W-2002的平板上生長的菌落數可達135.67個,明顯高于對照123.67個。添加潤濕劑W-2002平板上的菌落直徑為3.76 cm,高于對照的3.68 cm。綜合考慮各潤濕劑的潤濕力及其生物相容性,選用在各方面表現都較為突出的W-2002作為潤濕劑用于刀孢輪枝菌ZJLP09的可濕性粉劑制備。

表3 各潤濕劑對刀孢輪枝菌ZJLP09分子孢子的潤濕效果

注:同行中數字后面標注不同大寫字母表示在P<0.05水平差異顯著,同列中數字后面標注不同小寫字母表示在P<0.05水平差異顯著

表4 各潤濕劑與刀孢輪枝菌ZJLP09的生物相容性

注:同行中數字后面標注不同大寫字母表示在P<0.05水平差異顯著,同列中數字后面標注不同小寫字母表示在P<0.05水平差異顯著

3. 分散劑篩選

用于篩選的分散劑為:萘磺酸鹽分散劑D-1002、聚羧酸鹽分散劑D-1003、可濕粉分散劑D-1005和改性烷基萘縮合物分散劑D-1006,購自北京漢莫克化學技術有限公司;甲基萘磺酸鹽甲醛縮合物MF和亞甲基二萘磺酸鈉NNO,購自青島優索化學科技有限公司;脂肪醇與環氧乙烷縮合物IW,購自江蘇省海安石油化工廠;木質素磺酸鈣CL和木質素磺酸鈉SL,購自上海世澤生物科技有限公司;Morwet D-425、Morwet D-500、Morwet D-110、Agrilan 700、Borresperse CA-SA、Borresperse NA、Ufoxane 3A、Ulerazine NA、Borresperse CA和Dispwet WP-410,均購自南京捷潤科技有限公司。

(1)分散力測定:分散劑粗篩:將載體、潤濕劑、孢子粉混合后,添加5%待選分散劑加工成樣品,然后稱0.05 g含1%的潤濕劑的樣品倒入盛有50 mL標準硬水的80 mL小燒杯中,目測樣品的分散情況。粗篩分散情況分三個等級:優:在水中呈云霧狀自動分散。無可見顆粒下沉。用“+”表示。良:在水中自動分散,有顆粒下沉。下沉顆粒可慢慢分散或輕搖后分散。用“+-”表示。劣:在水中不能自動分散,呈顆粒狀下沉或絮凝狀下沉,經強烈搖動后才能分散。用“-”表示。分散劑細篩:細篩以制劑有效成分的懸浮率為指標,操作步驟按 GB/T 14825-2006 進行。以上操作每處理設置3個重復,孢子懸浮率計算方法見公式:孢子懸浮率(%)=(母液中孢子含量-下懸液中孢子含量)/母液中孢子含量×10/9×100。

(2)生物相容性測定:將各分散劑粉末按125 μg/mL、500 μg/mL和2000 μg/mL濃度的比例與融化的PDA培養基混合,滅菌后制成平板。取0.1 mL 濃度為 103個/mL的刀孢輪枝菌孢子懸浮液,涂布在含不同載體的平板上。以不含分散劑的 PDA 平板為對照。每處理設3個重復。將處理的平板置于 28 ℃下培養2-3 d,觀察各平板長出的刀孢輪枝菌菌落形成單位數并計算孢子萌發率。按上述方法制備含各種載體的平板,用直徑5 mm的打孔器取培養7 d的刀孢輪枝菌邊緣生長旺盛的菌絲塊,接種到各培養基上,每處理設置3個重復,然后置于28 ℃恒溫培養下培養,于培養不同時間測量各菌落的直徑。

各分散劑粗篩時的分散效果如表5所示,細篩時的分散效果如表6所示,各分散劑與菌株ZJLP09的生物相容性如表7所示。由表5可知,不同分散劑對對菌株ZJLP09分生孢子的分散效果存在明顯差異。其中Dispwet WP-410的分散效果最好,樣品在水中呈云霧狀自動分散,無可見顆粒下沉。由表6可知,加入分散劑后可顯著提高菌株ZJLP09分生孢子懸浮率。其中Dispwet WP-410的效果最佳,其孢子懸浮率可達88.85%。由表7可知,在添加量為125 μg/mL時,分散劑Dispwet WP-410、改性烷基萘縮合物D-1006和木質素磺酸鈉SL對菌株的孢子萌發不產生影響。當濃度達到500 μg/mL時,Dispwet WP-410和改性烷基萘縮合物D-1006仍具有與對照相當的孢子萌發率。在濃度為125 μg/mL時,Dispwet WP-410、木質素磺酸鈉SL和Ufoxane 3A對菌絲生長不產生抑制,其中當濃度達到500 μg/mL時,添加Dispwet WP-410和Ufoxane 3A的平板上的菌落大小仍與對照相當。綜合考慮各分散劑的分散效果及其與菌株ZJLP09的生物相容性,選用在各方面表現都較為突出的Dispwet WP-410作為分散劑用于刀孢輪枝菌ZJLP09的可濕性粉劑制備。

表5 各分散劑粗篩時的分散效果

表6 各分散劑加入后的分生孢子懸浮率

注:同列中數字后面標注不同小寫字母表示在P<0.05水平差異顯著

表7 各分散劑與刀孢輪枝菌ZJLP09的生物相容性

注:同行中數字后面標注不同大寫字母表示在P<0.05水平差異顯著,同列中數字后面標注不同小寫字母表示在P<0.05水平差異顯著

4. 紫外保護劑篩選

用于篩選的紫外保護劑有:抗壞血酸,為Sigma公司產品;核黃素,為Amersco公司產品;腐殖酸和熒光素鈉,購自上海世澤生物科技有限公司;糊精、海藻酸鈉、羧甲基纖維素鈉和黃原膠,均購自青島優索化學科技有限公司。

(1)保護效能測定:以無菌水稀釋分生孢子懸浮液配制成濃度為104個/mL的孢子懸浮液,然后將各種供試的紫外保護劑按0.3%比例加入孢子懸浮液中,混合均勻。用移液器吸取 0.1mL上述孢子懸浮液于無菌玻片上。然后將各蓋玻片置于紫外燈(30 w,120 Lux)下20 cm處照射30 min 后,將玻片平放在培養皿中的U型玻璃棒上,培養皿中用濕潤的無菌濾紙保濕。之后置于28 ℃下培養,在顯微鏡下抽樣計數萌發孢子數并計算出萌發率。每處理設置3個重復,以不加紫外保護劑的刀孢輪枝菌孢子懸液作照射和不照射的對照處理。

(2)生物相容性測定:以無菌水稀釋配制成濃度為104個/mL的孢子懸浮液,將各供試紫外保護劑按0.3%比例加入孢子懸浮液中,混合均勻。用移液器吸取0.1mL上述孢子懸浮液于無菌蓋玻片上。將玻片平放在培養皿中的U型玻璃棒上,培養皿中用濕潤的無菌濾紙保濕。之后置于28 ℃下培養,在顯微鏡下計數萌發孢子數并計算萌發率。每處理設置3個重復,以不加紫外保護劑的刀孢輪枝菌孢子懸液不進行紫外照射作為對照。

各紫外保護劑對菌株ZJLP09的保護效能及生物相容性如表8所示。由表8可知,對菌株ZJLP09分生孢子的保護效能最佳的為抗壞血酸和核黃素,分別添加此兩種保護劑的情況下,菌株ZJLP09的分生孢子經紫外照射30 min后的萌發率仍可達90.6%和88.45%。從添加紫外保護劑不進行紫外照射測定的孢子萌發率結果可知,各紫外保護劑均不會對菌株ZJLP09的孢子萌發產生明顯影響,均具有較好的生物相容性。因此,綜合考慮各紫外保護劑的保護效能及其與菌株ZJLP09的生物相容性,選用各方面表現都較為突出的抗壞血酸作為紫外保護劑用于刀孢輪枝菌ZJLP09的可濕性粉劑制備。

表8 各紫外保護劑對刀孢輪枝菌ZJLP09的保護效能及生物相容性

注:同列中數字后面標注不同小寫字母表示在P<0.05水平差異顯著

5. 孢子萌發促進劑篩選

用于篩選的孢子萌發促進劑有:硼酸,購自上海世澤生物科技有限公司;硫酸鋅、氯化鈣和氯化鉀,均為Amersco公司產品。

將供試的孢子萌發促進劑分別按 0.1%、0.2%和 0.5%的比例加入到濃度為104個/mL 的菌株ZJLP09孢子懸浮液中。取0.1 mL的母液滴加到無菌玻片上,將玻片平放在培養皿中的U型玻璃棒上,培養皿中用濕潤的無菌濾紙保濕。之后將置于 28 ℃下培養,在顯微鏡下抽樣計數萌發孢子數并計算出萌發率。每處理設3個重復,設不加促進劑的處理為對照。

不同萌發促進劑對分生孢子萌發的影響如表9所示。由表9可知,氯化鈣和氯化鉀均可顯著提高菌株ZJLP09的分生孢子萌發率,在0.1%濃度下,其孢子萌發率分別可達94.33%和90.44%,均顯著高于未加促進劑的對照的萌發率86.25%。因此,選用氯化鈣作為孢子萌發促進劑用于刀孢輪枝菌ZJLP09的可濕性粉劑制備。

表9 各孢子萌發促進劑對菌株ZJLP09分生孢子萌發的影響

注:同行中數字后面標注不同大寫字母表示在P<0.05水平差異顯著,同列中數字后面標注不同小寫字母表示在P<0.05水平差異顯著

6. 粘著劑篩選

用于篩選的粘著劑有:黃原膠,購自青島優索化學科技有限公司;蔗糖,Amersco公司產品;可溶性淀粉,Sigma公司產品。

(1)粘著力測定:將供試粘著劑按0.05%比例分別加入到濃度為105個/mL 的孢子懸浮液中,用噴壺對柑橘葉片進行噴霧,直至滴水為止。4 h后取同一高度的葉子(用打孔器打成小圓片)在30 mL無菌水中研磨,取0.1 mL液體均勻涂布在PDA培養基上,置于28℃下培養2-3 d,觀察各平板長出的刀孢輪枝菌菌落形成單位數并計算孢子萌發率。設不加粘著劑的處理為對照,每處理重復4次。

(2)生物相容性測定:將供試粘著劑按0.05%比例分別加入到濃度為104個/mL 的孢子懸浮液中,取適量與孢子萌發液混合,用移液器吸取 0.1mL上述孢子懸浮液于無菌蓋玻片上。將玻片平放在培養皿中的U型玻璃棒上,培養皿中用濕潤的無菌濾紙保濕。之后將所有處理的平板置于 28 ℃下培養,在顯微鏡下抽樣計數萌發孢子數并計算出萌發率。每處理設置3個重復,以不加粘著劑的孢子懸浮液為對照。

各粘著劑的粘著力及其與菌株ZJLP09的生物相容性如表10所示。由表10可知, 添加黃原膠的菌株ZJLP09的分生孢子懸浮液噴灑于柑橘葉片上后,在PDA培養基上生成的菌落個數為124.67個,顯著高于不加粘著劑的對照,說明黃原膠可提高菌株ZJLP09分生孢子在柑橘葉片上的粘附能力。此3種粘著劑對菌株ZJLP09的分生孢子萌發均無顯著影響。因此,選用黃原膠作為粘著劑用于刀孢輪枝菌ZJLP09的可濕性粉劑制備。

表10 各粘著劑的粘著力及與菌株ZJLP09的生物相容性

注:同列中數字后面標注不同小寫字母表示在P<0.05水平差異顯著

實施例3:刀孢輪枝菌ZJLP09可濕性粉劑的配制及質量指標測定

1. 刀孢輪枝菌ZJLP09可濕性粉劑的配制:經以上試驗篩選出的載體、潤濕劑、分散劑、紫外保護劑等按比例混合,攪拌均勻,再加入10%刀孢輪枝菌分生孢子粉,過325目標準篩,充分攪拌混勻即成刀孢輪枝菌分生孢子可濕性粉劑。

所制得的刀孢輪枝菌ZJLP09的分生孢子可濕性粉劑的配方為:有效成分為刀孢輪枝菌ZJLP09分生孢子粉,含量10%;潤濕劑為W-2002,含量1%;分散劑為Dispwet WP-410,含量1%;紫外保護劑為抗壞血酸,含量0.3%;孢子萌發促進劑為氯化鈣,含量0.1%;粘著劑為黃原膠,含量0.05%;載體為凹凸棒土,含量87.55%。

2. 刀孢輪枝菌ZJLP09可濕性粉劑的質量指標測定:

(1)含孢量測定:方法同實施例1。

(2)活孢率測定:方法同實施例1。

(3)含水量測定:方法同實施例1。

(4)潤濕時間測定:按GB/T 5451-2001進行。

(5)懸浮率測定:按GB/T 14825-2006 進行。

(6)細度的測定:按GB/T 16150-1995 中“濕篩法”進行。

(7)pH值測定:按GB/T 1601-1993進行。

刀孢輪枝菌ZJLP09可濕性粉劑的質量指標測定結果如表11所示。由表11可知,所制得的分生孢子可濕性粉劑含孢量為4.05×1010個/g,活孢率為93.65%,含水量僅為1.62%,潤濕時間為78.50s,孢子懸浮率為86.78%,細度98.56%過325目篩。所配制的可濕性粉劑的性能指標符合農藥制劑產品要求。

表11刀孢輪枝菌ZJLP09分生孢子可濕性粉劑質量指標

實施例4:刀孢輪枝菌ZJLP09可濕性粉劑的防效測定

1. 室內毒力測定:將刀孢輪枝菌ZJLP09可濕性粉劑用蒸餾水稀釋,裝入小型噴壺中,采集柑橘木虱或蚜蟲置于培養皿中,對其均勻噴霧,將處理后的昆蟲放于玻璃容器中的九里香葉片上或蠶豆苗上,然后置于溫度為28℃、光照為L:D=14:10的人工氣候箱中培養,48 h后在觀察并計算死亡率。同時設立以10%吡蟲啉處理為陽性對照,以無菌水處理為陰性對照。校正死亡率(%)=(處理死亡率-對照死亡率)/(1-對照死亡率)ch×100。

2. 溫室防效測定:將刀孢輪枝菌ZJLP09可濕性粉劑用蒸餾水稀釋,裝入小型噴壺中,對飼養于溫室條件下九里香植株上的柑橘木虱進行噴霧處理,同時設立以10%吡蟲啉處理為陽性對照,以無菌水處理為陰性對照。處理3 d后觀察計數柑橘木虱死亡蟲數和總蟲數,計算死亡率。

刀孢輪枝菌ZJLP09可濕性粉劑的室內毒力和溫室防效結果如表12所示。由表12可知,刀孢輪枝菌ZJLP09分生孢子可濕性粉劑對柑橘木虱和蚜蟲均表現出強的致病性,且致死率高于分生孢子懸浮液。在人工氣候箱條件下,用藥后5 d,分生孢子濃度為108個/mL的可濕性粉劑對柑橘木虱的校正死亡率達90%以上,而對蚜蟲的校正死亡率可達100%。在溫室條件下的防效略低于人工氣候箱,但分生孢子濃度為108個/mL的制劑在用藥后7 d對柑橘木虱的校正死亡率也可達100%。由此可知,刀孢輪枝菌ZJLP09分生孢子的劑型化有助于分生孢子藥效的充分發揮,提高菌株對柑橘木虱和蚜蟲的毒力。

表12 刀孢輪枝菌ZJLP09孢子制劑對柑橘木虱和蚜蟲的室內毒力和溫室防效

注:同列中數字后面標注不同小寫字母表示在P<0.05水平差異顯著。

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