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一種延緩薯塊根采后生理性變質的方法.pdf

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一種 延緩 塊根 后生 理性 變質 方法
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摘要
申請專利號:

CN201610038248.6

申請日:

20160120

公開號:

CN106982599A

公開日:

20170728

當前法律狀態:

有效性:

審查中

法律詳情:
IPC分類號: A01F25/00 主分類號: A01F25/00
申請人: 中國科學院上海生命科學研究院,海南大學
發明人: 張鵬,馬秋香,王振宇
地址: 200031 上海市徐匯區岳陽路319號
優先權: CN201610038248A
專利代理機構: 上海專利商標事務所有限公司 代理人: 陳靜
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法律狀態
申請(專利)號:

CN201610038248.6

授權公告號:

法律狀態公告日:

法律狀態類型:

摘要

本發明涉及一種延緩薯塊根采后生理性變質的方法。首次揭示了褪黑素可以應用于處理薯類植物,從而有效地延緩或抑制薯類植物塊根采后的生理性變質,本發明的方法簡單、有效,具有良好的應用價值。

權利要求書

1.一種延緩或抑制薯塊根采后生理性變質的方法,其特征在于,所述的方法包括:以褪黑素處理薯塊根。2.如權利要求1所述的方法,其特征在于,使得薯塊根在褪黑素溶液中浸泡,從而延緩或抑制薯塊根采后生理性變質。3.如權利要求2所述的方法,其特征在于,所述的褪黑素溶液中,褪黑素的含量是:高于50mg/L。4.如權利要求3所述的方法,其特征在于,所述的褪黑素溶液中,褪黑素的含量是:50~3000mg/L;較佳地100~2000mg/L;更佳地200~1500mg/L;更佳地400~1200mg/L。5.如權利要求1-4任一所述的方法,其特征在于,所述的薯包括:木薯、甘薯、馬鈴薯、山藥、芋。6.一種褪黑素的用途,其特征在于,用于延緩或抑制薯塊根采后生理性變質;或用于制備延緩或抑制薯塊根采后生理性變質的組合物。7.如權利要求6所述的用途,其特征在于,所述的褪黑素用于減緩塊根中HO含量增加。8.如權利要求6所述的用途,其特征在于,所述的褪黑素用于減緩塊根中丙二醛含量增加。9.如權利要求6所述的用途,其特征在于,所述的褪黑素用于提高塊根中SOD或CAT活性,提高根中SOD或CAT的基因的表達水平。10.如權利要求6所述的用途,其特征在于,所述的褪黑素用于提高谷胱甘肽還原酶活性;或所述的褪黑素用于提高MeGPX、MePX3或MeGST的基因表達水平。11.如權利要求6-10任一所述的用途,其特征在于,所述的薯包括:木薯、甘薯、馬鈴薯、山藥、芋。

說明書

技術領域

本發明屬于植物學領域,更具體地,本發明涉及一種延緩薯類植物塊根采后生理性變質的方法。

背景技術

薯類植物主要指具有可供食用塊根或地下莖的一類陸生作物,其產品器官是塊根和塊莖,生長在土壤中。

常見的薯類有木薯、甘薯、馬鈴薯、芋類、山藥等。薯類有明顯的營養優勢。薯類食物能量低、水分高,含較多的碳水化合物。以100克馬鈴薯為例,能量僅為76千卡,約為同等重量大米的23%,水分含量是79.8%,為同等重量大米的5倍,是很好的低能量、高水分食物。薯類還供給一定量的碳水化合物(主要成分是淀粉,其含量為12.4-25.2%),所以,薯類被公認為是兼有主食和蔬菜特性的天然健康食材。薯類基本不含脂肪,其脂肪含量僅為0.2%,是低脂肪食物。薯類蛋白質含量一般在1.1-2.2%之間,是不完全蛋白質,但賴氨酸的含量豐富,正好補充谷物所缺乏的賴氨酸。薯類含豐富的膳食纖維,為0.7-1.6%,是大米的1.7~4倍。膳食纖維可增加飽腹感,防止能量過剩,增加胃腸蠕動,通便防癌,預防心血管疾病、糖尿病和膽石癥。薯類還含有多種維生素和礦物質。因此,薯類食品是較為健康的食品。

但是,收獲后薯類植物的儲藏根不耐貯藏,易變質。例如木薯收獲后,必須在3天內加工,否則儲藏根周邊部位出現褐變或青褐變,并且呈現長的筋狀,被稱之為木薯特有的“采后生理性變質(post-harvest physiological deterioration,PPD)”。這種變質是由酚類等物質氧化所引起,會導致儲藏根褐化及腐爛,影響其食用、加工及產品性能,給農民和淀粉及燃料乙醇加工企業造成嚴重的經濟損失。據統計每年由于木薯采后生理性變質導致的損失都在收獲量的5%以上,直接經濟損失達2億元以上。對于少量的儲藏根,在收獲后可通過立即封蠟、套袋或加工成干片來抑制生理性變質,但增加了原材料成本,不適用于規模化木薯加工企業。采收前兩周對木薯的莖桿進行修剪可在一定程度上延緩儲藏根的采后生理性變質,但會導致儲藏根的食用品質和淀粉質量大大降低,限制了該方法的應用。

至今還沒有一種行之有效的方法可用于抑制薯類植物儲藏根的采后生理性變質。因此,探索薯類植物采后生理性變質的內在生理生化變化,并研究其發生的原因、途徑及其影響因素等,對有效抑制薯類植物采后生理性變質具有重要的理論和實踐意義。

發明內容

本發明的目的在于提供一種延緩薯類植物塊根采后生理性變質的方法。

在本發明的第一方面,提供一種延緩或抑制薯塊根(儲藏根)采后生理性變質的方法,所述的方法包括:以褪黑素處理薯塊根。

在一個優選例中,使得薯塊根在褪黑素溶液中浸泡,從而延緩或抑制薯塊根采后生理性變質。

在另一個優選例中,所述的褪黑素溶液中,褪黑素的含量是:高于50mg/L。

在另一個優選例中,所述的褪黑素溶液中,褪黑素的含量是:50~3000mg/L;較佳地100~2000mg/L;更佳地200~1500mg/L;更佳地400~1200mg/L;如500、600、700、800、900或1000mg/L。

在另一個優選例中,所述的薯包括但不限于:木薯、甘薯、馬鈴薯、山藥、芋等。

在本發明的另一方面,提供一種褪黑素的用途,用于延緩或抑制薯塊根(儲藏根)采后生理性變質;或用于制備延緩或抑制薯塊根(儲藏根)采后生理性變質的組合物(如溶液)。

在一個優選例中,所述的褪黑素用于減緩塊根中H2O2含量增加。

在另一個優選例中,所述的褪黑素用于減緩塊根中丙二醛(MDA)含量增加。

在另一個優選例中,所述的褪黑素用于提高塊根中SOD或CAT活性,提高根中SOD或CAT的基因的表達水平。

在另一個優選例中,所述的褪黑素用于提高谷胱甘肽還原酶(GR)活性,或所述的褪黑素用于提高MeGPX、MePX3或MeGST的基因表達水平。

本發明的其它方面由于本文的公開內容,對本領域的技術人員而言是顯而易見的。

附圖說明

圖1、木薯儲藏根生理性變質(PPD)發生過程。不同濃度(分別為0、10、50、100、250、500和1000mg/L)褪黑素溶液處理后,在不同的時間點(24h,48h和72h)的PPD發生。

圖2、木薯儲藏根PPD發生過程(500mg/L褪黑素溶液處理)。實驗節點為0h、12h、24h、36h和48h。

圖3、以褪黑素溶液或對照溶液處理儲藏根切片,在不同時間點上,用ImageJ處理軟件統計儲藏根壞死斑點比例。

圖4、以褪黑素溶液或對照溶液處理儲藏根切片,在不同時間點上,熒光染料探針定位PPD過程中ROS發生部位和積累量。

圖5、以褪黑素溶液或對照溶液處理儲藏根切片,在不同時間點上,ImageJ處理軟件統計儲藏根熒光強度。

圖6、以褪黑素溶液或對照溶液處理儲藏根切片,在不同時間點上,測定PPD過程中木薯儲藏根H2O2含量的變化。

圖7、以褪黑素溶液或對照溶液處理儲藏根切片,在不同時間點上,PPD過程中木薯儲藏根MDA含量的變化。

圖8、以褪黑素溶液或對照溶液處理儲藏根切片,在不同時間點上,PPD過程中木薯儲藏根SOD和CAT轉錄水平及酶活變化。

圖9、以褪黑素溶液或對照溶液處理儲藏根切片,在不同時間點上,PPD過程中儲藏根APX和GR酶活變化。

圖10、以褪黑素溶液或對照溶液處理儲藏根切片,在不同時間點上,PPD過程中儲藏根ROS相關基因轉錄水平變化。

圖11、以褪黑素溶液或對照溶液處理儲藏根切片,在不同時間點上,PPD過程中儲藏根內源褪黑素含量的變化。

圖12、PPD過程中儲藏根褪黑素合成基因(MeTDC1、MeTDC2、MeT5H、MeSNAT、MeHIOMT1、MeHIOMT2、MeASMT1、MeASMT2、MeASMT3)在不同時間點的表達變化。

具體實施方式

本發明人經過深入的研究,首次揭示了褪黑素可以應用于處理薯類植物,從而有效地延緩或抑制薯類植物塊根采后的生理性變質。

如本文所用,所述的“薯”表示薯類植物,又稱為薯類作物或根莖類作物,是指具有可供食用塊根或地下莖的一類陸生作物。主要包括木薯、甘薯、馬鈴薯、山藥、芋類等。

褪黑素

褪黑素又稱為褪黑激素、美拉酮寧、抑黑素、松果腺素,是一種胺類激素,它存在于從藻類到人類等眾多生物中,含量水平隨每天的時間變化。其化學名稱為N-乙酰基-5-甲氧基色胺,化學式為C13N2H16O2,結構式為:

在本發明中,所述的“褪黑素”可以是純凈形式存在的式I所示的化合物,或純度大于85%的式I所示的化合物,也可以是含有褪黑素或其衍生物的提取物。

所述的褪黑素可提取自任何含有褪黑素或其衍生物(如鹽或酯)的生物中。作為本發明的優選方式,所述的褪黑素也可通過化學合成的方式獲得,包括以5-甲氧基吲哚為原料,經草酰基化、胺化、還原、乙酰化四步反應制得褪黑素;或以吲哚和氯乙胺為主要原料,經羥基化、氨乙基化、甲基化、乙酰化制得褪黑素;或采取Fischer吲哚合成法制得褪黑素;或以5-甲氧基吲哚-3-甲醛為主要原料,經縮合、還原、乙酰化三步反應制得褪黑素;或以游離基吲哚合成法制得褪黑素。

在本發明中,還包括褪黑素的鹽,這種鹽可以是褪黑素與無機酸或有機酸反應生成的鹽。

本發明還包括含有褪黑素的組合物,所述的組合物包括:50~3000mg/L;較佳地100~2000mg/L;更佳地200~1500mg/L;更佳地400~1200mg/L,如500、600、700、800、900或1000mg/L的褪黑素;以及與之相容的溶劑。較佳地,所述的溶劑是水性溶劑,例如水。

本發明中,術語“含有”表示各種成分可一起應用于本發明的混合物或組合物中。因此,術語“主要由...組成”和“由...組成”包含在術語“含有”中。

用途及處理方法

為了論證褪黑素的上述用途,本發明人以不同終濃度的褪黑素溶液處理木薯塊根切片,實驗結果表明,與對照組相比,適當濃度的褪黑素處理可明顯延緩早期生理性變質(PPD)的發生,可以使得木薯塊根切片中壞死斑點比例顯著性降低。

基于本發明人的上述新發現,本發明提供了褪黑素、或其鹽的用途,用于延緩或抑制薯塊根(儲藏根)采后生理性變質;或用于制備延緩或抑制薯塊根(儲藏根)采后生理性變質的組合物(如溶液)。

基于本發明的上述新發現,本發明還提供了一種延緩或抑制薯塊根(儲藏根)采后生理性變質的方法,所述的方法包括:以褪黑素處理薯塊根。

任何將薯塊根與褪黑素有效接觸的方法均可以實現本發明的技術方案,例如,可將褪黑素涂布于薯塊根上;或者,使得薯塊根在褪黑素溶液中浸泡,從而延緩或抑制薯塊根采后生理性變質。

作為本發明的優選方式,所述的褪黑素溶液中,褪黑素的含量是:高于50mg/L。較佳地,所述的褪黑素溶液中,褪黑素的含量是:50~3000mg/L;較佳地100~2000mg/L;更佳地200~1500mg/L;更佳地400~1200mg/L,如500、600、700、800、900或1000mg/L。

本發明的方法簡單、有效,具有良好的應用價值。

下面結合具體實施例,進一步闡述本發明。應理解,這些實施例僅用于說明本發明而不用于限制本發明的范圍。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法,通常按照常規條件如J.薩姆布魯克等編著,分子克隆實驗指南,第三版,科學出版社,2002中所述的條件,或按照制造廠商所建議的條件。

實施例1、表型觀察

褪黑素結構式如下:

本實施例中,以木薯主栽品種華南205為研究材料,收獲生長4個月的木薯儲藏根清洗干凈,切成約3-4mm切片進行預實驗。切片置于28℃不同濃度的褪黑素溶液中(濃度分別為0、10、50、100、250、500和1000mg/L。褪黑素溶液的配制:褪黑素以少量的無水乙醇(濃度小于0.5%(v/v))助溶,用滅菌水定溶至需要濃度,過濾滅菌。108rpm懸浮培養,在不同的時間點(24h,48h和72h)取樣觀察。

結果如圖1,與對照(0mg/L)相比,較低濃度(100-500mg/L)的褪黑素處理就可以延緩采后生理性變質(PPD)的發生,高濃度褪黑素處理(>1000mg/L)則顯著抑制PPD的發生。因此,選取500mg/L濃度的褪黑素溶液對木薯儲藏根PPD過程進行分析。

為避免懸浮造成的厭氧環境及培養過程中微生物污染造成的影響,后續實驗優化條件如下:儲藏根切片于500mg/L褪黑素溶液和對照(0mg/L褪黑素溶液)中浸泡2h后置于恒溫(28℃)、恒濕(70%)和16h/8h光周期培養箱中觀察PPD過程。實驗節點為0h、12h、24h、36h和48h。

實驗結果表明,與對照組(0mg/L)相比,500mg/L褪黑素處理可明顯延緩早期PPD的發生(36h),如圖2。

利用ImageJ處理軟件統計儲藏根壞死斑點比例,結果如圖3,可見與對照組相比,褪黑素處理組的壞死斑點比例顯著性降低。

實施例2、木薯儲藏根熒光染料染色和H2O2含量測定

1、木薯儲藏根熒光染料染色

PPD是一個氧爆發的過程,其發生與活性氧(ROS)的大量積累緊密相關(Xu J等,Enhanced reactive oxygen species scavenging by overproduction of superoxide dismutase and catalase delays postharvest physiological deterioration of cassava storage roots.Plant Physiol 161,1517-28)。本實施例中,分別選擇特異染色ROS的DHR和線粒體的MitoTracker-Deep Red FM兩種熒光染料探針,測定儲藏根在PPD發生過程中ROS發生的部位及積累量。

熒光染料探針定位PPD,方法如下:

木薯儲藏根ROS檢測所選染色劑Dihydrorhodamine123(DHR)和MitoTracker-Deep Red FM購自分子探針公司(Invitrogen,Molecular Probes,USA),DHR為ROS特異染料,該染料本身無色,進入細胞后被ROS氧化成為熒光產物,通過共聚焦顯微鏡可以觀察到熒光;MitoTracker-Deep Red FM為線粒體特異熒光染料[Joo JH等,Role of auxin-induced reactive oxygen species in root gravitropism[J].Plant Physiology,2001,126(3):1055-1060;Miller G等,UnravelingΔ1-Pyrroline-5-Carboxylate-Proline cycle in plants by uncoupled expression of proline oxidation enzymes[J].The Journal of Biological Chemistry,2009,284(39):26482-26492]。將木薯儲藏根切成薄片,將5mm×5mm方塊浸沒于磷酸緩沖液(0.1mol/L pH 7.0),分別加入終濃為50μmol/L DHR和250nmol/L MitoTracker-Deep Red FM避光染色10min和20min。激光掃描共聚焦顯微鏡(Fluo View FV1000,Olympus,Japan)觀察熒光信號,其中DHR Ex/Em為488nm/515nm,MitoTracker-Deep Red FM Ex/Em為635nm/680nm。

熒光檢測發現,儲藏根切片維管束細胞在0h時僅可激發微弱的熒光信號,褪黑素處理的儲藏根切片和對照(0mg/L)無明顯差異。PPD發生24h后,對照組儲藏根在木質部維管束細胞和薄壁細胞組織開始變質,激發強烈的熒光信號,然而褪黑素處理的儲藏根切片并未激發強烈的熒光信號,與0h的熒光信號無明顯差異,說明褪黑素能夠將木質部維管束細胞和薄壁細胞組織線粒體中ROS積累量維持在正常水平,提示褪黑素參與細胞內ROS的清除(圖4和5)。PPD發生48h時,對照組與褪黑素處理的儲藏根中都可檢測到熒光信號,但褪黑素處理的儲藏根中激發的熒光信號明顯低于對照組的熒光信號。

2、木薯儲藏根H2O2含量測定

為驗證褪黑素在儲藏根PPD發生過程中與ROS的清除相關,對儲藏根中H2O2含量進行了檢測。

H2O2含量測定方法:

取1g葉片加入10ml 0.1%預冷的TCA溶液,冰浴上研磨,勻漿液12000g,15min。取1ml上清,添加1ml 100mM磷酸鹽緩沖液(PBS)(pH7.0),2ml KI(1mol/L),搖勻,靜置片刻,390nm測OD值,根據標準曲線求得H2O2含量(Velikova V等,Oxidative stress and some antioxidant system in acid rain-treated bean plants:protective role of exogenous polyamines[J].Plant Science,2000,151(1):59-66)。

結果發現,在PPD過程中,對照組儲藏根中H2O2含量持續增加,而褪黑素處理的儲藏根H2O2含量增加相對緩慢,如圖6,提示褪黑素在ROS清除過程中或ROS逆轉過程中發揮作用。

實施例3、MDA含量測定

丙二醛(MDA)是脂質過氧化所產生的可溶性副產物,其含量可作為膜脂過氧化程度的指標。MDA還能與蛋白質等交聯導致酶失活或膜系統受損,因此測定MDA的積累可在一定程度上了解木薯PPD過程中膜脂過氧化的程度和細胞受損程度(Vanderschuren H等,2014.Large-Scale Proteomics of the Cassava Storage Root and Identification of a Target Gene to Reduce Postharvest Deterioration.Plant Cell 26,1913-24)。

以褪黑素溶液或對照溶液處理儲藏根切片,在不同時間點上,測定PPD過程中木薯儲藏根MDA含量的變化。

MDA含量測定方法(Dhindsa RS等,Drought tolerance in two mosses:correlated with enzymatic defence against lipid peroxidation[J].Journal of Experimental Botany,1981,32(1):79-91):

稱取剪碎材料1g,加入2mL 10%TCA和少量石英砂,迅速研磨至勻漿,再加8mL TCA進一步研磨,4,000g勻漿離心10min,上清液為樣品提取液;吸取離心的上清液2mL(對照加2mL ddH2O),加入2mL 0.6%TBA溶液,混勻后于沸水浴上反應15min,迅速冷卻后再離心。取上清液測定532nm,600nm和450nm波長下的吸光值;計算公式如下:

C(μmol/L)=6.45×(OD532-OD600)-0.56×OD450。

結果發現,PPD過程中對照組儲藏根的MDA含量快速增加,12h達到峰值,隨后逐漸降低,而褪黑素處理的儲藏根MDA含量則逐漸增加,但均低于對照組儲藏根中MDA的含量,如圖7,提示褪黑素通過保護膜系統降低PPD造成的傷害。

實施例4、PPD過程中儲藏根SOD和CAT基因轉錄水平及酶活檢測

本發明人之前的研究表明過表達木薯MeCu/ZnSOD和MeCAT1基因可以延緩木薯PPD的發生,這兩個酶可清除體內H2O2以降低對植物體的傷害(Xu J等,Enhanced reactive oxygen species scavenging by overproduction of superoxide dismutase and catalase delays postharvest physiological deterioration of cassava storage roots.Plant Physiol 161,1517-28)。

因此,本發明對PPD過程中過氧化物酶(SOD)和過氧化氫酶(CAT)的酶活性及其轉錄水平進行分析。

取1g的樣品加入5mL酶提取緩沖液(50mmol/L磷酸緩沖液,1%PVP,1mmol/L EDTA)研磨,4℃,10,000rpm離心20min,取上清,將酶液轉移至EP管中(約3-4mL),置冰上待用。

1、SOD酶活測定方法

顯色反應:取透明度、質地相同玻璃試管5支,3支為測定、2支為對照,按表1加入試劑。

表1

按照表1混勻后,給1支對照管罩上比試管稍長的雙層黑色硬紙套遮光,與其他各管同時置于5000lx日光燈下反應10min(要求各管照光情況一致,反應溫度控制在25~35℃之間,視酶活性高低適當調整反應時間)。當對照管變藍,而樣品管仍為黃色時,結束反應,測定各管的吸光度。

SOD活性=(OD0-ODS)×VT/OD0×0.5×FW×V1;

其中,OD0:照光對照光管的光吸收值;ODS:樣品管的光吸收值;VT:樣液總體積(mL);V1:測定時樣品用量(mL);FW:樣品鮮重(g)。

2、CAT酶活測定

2mL反應體系=1.6mL酶提取緩沖液+0.2mL 0.1mol/L酶液+0.2mL0.1mol/L的H2O2。加完H2O2立即計時,試管上下顛倒混勻,240nm下測定吸光度,每隔1min讀數1次,共測5min。以1min內OD240減少0.1的酶量為1個酶活單位(U)。

3、轉錄水平分析

1μg總RNA在反轉錄酶ReverTra Ace(貨號TRT-101,TOYOBO,上海)作用下于20μL反應體系中合成cDNA,并用于Real-time PCR檢測。PCR反應在Bio-Rad CFX96熒光定量PCR儀上進行,20μL體系中包括2×SYBR Master Mix(貨號QPK-201,TOYOBO,上海)10μL,cDNA 50ng,Forward Primer和Reverse Primer各400nmol L-1。反應條件為:95℃變性1min;95℃變性15sec,60℃退火延伸30sec,40-50個循環數;Actin基因作為內參。每個樣品三個重復,根據相對Ct值計算所檢測基因的相對表達量,單個樣本中各基因的相對表達量計算公式為:ΔCt=Ct(Target gene)-Ct(Actin);特定基因在兩個樣本中的相對表達量計算公式為:ΔΔCt=ΔCt(Sample 1)-ΔCt(Sample 2)。

所用引物:

MeActin F:TGATGAGTCTGGTCCATCCA(SEQ ID NO:1),

R:CCTCCTACGACCCAATCTCA(SEQ ID NO:2);

MeCu/ZnSOD F:ATGTTCATGCCCTTGGAGAC(SEQ ID NO:3),

R:GATCACCAGCATGACGAATG(SEQ ID NO:4);

MeCAT1F:TGGGAAACAACTTCCCTGTC(SEQ ID NO:5),

R:ACATCATCGAAGAACCAGGC(SEQ ID NO:6)。

結果表明,在PPD過程中,對照組與褪黑素處理的儲藏根SOD酶活性均逐漸增加而CAT酶活性均逐漸降低,但褪黑素處理的儲藏根SOD和CAT活性均高于對照組(圖8A和B)。通過基因表達分析發現盡管這兩個基因的表達模式不同但褪黑素處理的儲藏根中目的基因的表達水平均高于對照組(圖8C和D)。

結果提示,褪黑素通過調控ROS清除相關基因的表達而延緩PPD的發生。

實施例5、PPD過程中儲藏根與ROS相關其它基因轉錄水平及酶活檢測

前人研究結果表明,其它與抗氧化相關的酶,如谷胱甘肽還原酶(GR)參與調控PPD過程,而抗壞血酸過氧化物酶(APX)的作用不明顯(Vanderschuren H等,2014.Large-Scale Proteomics of the Cassava Storage Root and Identification of a Target Gene to Reduce Postharvest Deterioration.Plant Cell 26,1913-24)。

為進一步研究GR與APX是否在PPD過程中直接發揮作用,以及褪黑素與其它ROS清除相關酶之間的關系,本發明人對GR和APX的酶活性及其基因轉錄水平進行了檢測。

1、GR酶活測定

蛋白提取過程同SOD提取方法,谷甘肽還原酶(GR,EC1.6.4.2)活性參照Crace and Logan的方法測定(參見Grace SC and Logan BA.Acclimation of foliar antioxidant systems to growth irradiance in three broad-leaved evergreen species[J].Plant Physiology,1996,112(4):1631-1640),即測定340nm處吸光度3min內的下降。1mL反應體系包括50mM磷酸緩沖液(pH 7.8),2mM Na2EDTA,0.15mM NADPH,0.5mM GSSG和100μL酶提取液,加入NADPH啟動反應。將每克樣品1min內氧化1mmol/L NADPH所需的酶量定義為一個酶活單位,計算酶活時所使用的摩爾系數為6.2mmol L-1cm-1。

2、APX酶活測定

蛋白提取過程同SOD提取方法,但酶提取緩沖液中加1mmol/L AsA。1mL反應體系加入0.9mL酶提取緩沖液,0.1mL上清,10μL 0.01mol/L的H2O2。加入H2O2后讀取第10s和第40s的290nm吸光度[55]。AsA氧化量按消光系數2.8mM cm-1計算,酶活性可用μmolAsA/(g FW·h)表示。參見Nakano Y,Asada K.Hydrogen peroxide is scavenged by ascorbate-specific peroxidase in spinach chloroplasts[J].Plant and Cell Physiology,1981,22(5):867-880。

消光系數的定義:ε=ΔOD/CL→C=ΔOD/εL

根據定義酶活性為:ΔODV/εLtFW

式中:ΔOD為吸光度的變化;C為被測物質的摩爾濃度;L為比色杯光徑(cm);ε為消光系數;FW為鮮重(g);t為時間(s)。

3、基因轉錄水平檢測

基因轉錄水平檢測所用的引物如下:

MeAPX2 F:CATTGATAAGGCCAGGAGGA(SEQ ID NO:7),

R:TTGTTAGCAGCATGACCCTG(SEQ ID NO:8);

MeGPX F:TCAAGTCCTCACTTGGGTCC(SEQ ID NO:9),

R:TGAGAGAAACCTCCTTCCCA(SEQ ID NO:10);

MePX3 F TCACTTGGCCTTACCCAAAC(SEQ ID NO:11),

R:CAATGGCAATTCTTGGGTCT(SEQ ID NO:12);

MeDHAR F:GATGGGACAGAACAGGCATT(SEQ ID NO:13),

R:GTGACTCAGGAACCGACCAT(SEQ ID NO:14);

MeGST F:CAGAGAGGGCACCAGAACTC(SEQ ID NO:15),

R:AAGAAGACCAACGCCAAATG(SEQ ID NO:16);

MeGR F:TTTGGGGGTGATATTGAGGA(SEQ ID NO:17);

R:ATGAGGACCAACAACCTTGC(SEQ ID NO:18)。

所用的內參同前。

與先前的結果一致,在PPD過程中APX的酶活性無明顯變化(圖9A),然而在PPD發生的早期MeAPX表達水平較高而在后期表達水平降低(圖10A)。MeDHAR基因的表達水平在早期也沒有發生明顯的變化(圖10D)。在PPD過程中對照組與褪黑素處理的儲藏根中GR酶活性均逐漸增加,但褪黑素處理的儲藏根GR活性高于對照組(圖9B),MeGR(編碼GR)轉錄表達水平也有相似的結果(圖10F)。

本發明人進一步分析了MeGPX、MePX3和MeGST等其它ROS清除途徑中基因的表達模式(圖10B、C和E)。結果表明,PPD過程中褪黑素處理的儲藏根中這些基因的表達水平整體趨勢上均高于對照組,提示褪黑素通過調控相關抗氧化酶活性以維持ROS的平衡,從而延緩PPD的發生。

實施例6、褪黑素合成基因轉錄水平、含量檢測

上述研究結果表明,褪黑素可能通過維持體內ROS的平衡以延緩PPD的發生,但不確定PPD是否可誘導褪黑素的產生以維持體內ROS的動態平衡。

因此,本發明人對PPD過程中木薯儲藏根內源褪黑素的含量進行了定量分析。

1、褪黑素含量檢測

60℃烘干的木薯塊根樣品碾成細粉,精密稱取100mg干重的,三個重復。加入甲醇1.0ml,稱重;超聲波(80Hz,45℃)提取30min后,再稱重;用甲醇補足重量。13000r/min離心取上清液0.5ml,用濾膜對上清進行過濾(0.2μm×25mm,Millipore)。利用Melatonin(MT)ELISA kit(Melatonin ELISA,IBL-Hamburg,Germany)測定褪黑素含量。

結果表明,木薯儲藏根中褪黑素含量較低,但在PPD過程中內源褪黑素含量在12h和36h出現兩個峰值,提示褪黑素在PPD過程中具有直接的調控作用,如圖11。

2、褪黑素合成相關基因轉錄水平檢測

早期研究表明,水稻褪黑素合成途徑中相關的基因在多種脅迫條件下可被誘導表達(Park S,Lee D-E等,2013.Melatonin-rich transgenic rice plants exhibit resistance to herbicide-induced oxidative stress.Journal of Pineal Research 54,258-63)。本發明人檢測了木薯儲藏根PPD過程中褪黑素合成基因表達情況。

所用引物如下:

MeTDC1 F:AGCACTGCAGCTTTTGTTGG(SEQ ID NO:19),

R:TTGAAGCAGGTGAAGCAAGC(SEQ ID NO:20);

MeTDC2 F:AGTGTTGCCGGATTTTTGGG(SEQ ID NO:21),

R:TTCAAGCTCTGTTGCAGCAG(SEQ ID NO:22);

MeSNAT F:AAGAAGCTGATTGGCATGGC(SEQ ID NO:23),

R:CAATAAGAGCCTTGCCAAGACC(SEQ ID NO:24);

MeT5H F:TCGGCGGAATTTGTGATTGC(SEQ ID NO:25),

R:ATTCTCAGGAGCAGCACCAC(SEQ ID NO:26);

MeASMT1 F:AATGCGCAGTTGAGCTTCAC(SEQ ID NO:27),

R:TGTGGTGGGATTTTGATGGG(SEQ ID NO:28);

MeASMT2 F:CCGACAAAAGTGAACTCTCTGC(SEQ ID NO:29),

R:TTGGCTGAAGCAAAGAAGCC(SEQ ID NO:30);

MeASMT3 F:TGTTTGGAGAGCCACTTTGG(SEQ ID NO:31),

R:ACTTGACAACCACTGCCTTG(SEQ ID NO:32);

MeHIOMT1 F:ACCGCCGAAACTCAAATGAC(SEQ ID NO:33),

R:ATTTCAAGCAGGTCGAGCTC(SEQ ID NO:34);

MeHIOMT2 F:AGATGGGTTGTTTGCGATGC(SEQ ID NO:35),

R:TGAGCACCTTCACCCTTTTC(SEQ ID NO:36);

所用的內參同前。

結果發現,四個褪黑素合成相關基因MeTDC、MeT5H、MeSNAT和MeASMT在PPD發生初期(12h)下調表達,但是在長期過程中明顯上調表達(圖12A-D,G-I),MeHIOM基因在整個PPD過程中均被上調表達(圖12E-F)。

褪黑素含量及轉錄表達水平檢測結果表明,PPD會誘導褪黑素的合成,褪黑素在PPD過程中可能作為一個信號對ROS相關基因的表達進行調控,以清除體內H2O2,從而延緩木薯儲藏根PPD的發生。

在本發明提及的所有文獻都在本申請中引用作為參考,就如同每一篇文獻被單獨引用作為參考那樣。此外應理解,在閱讀了本發明的上述講授內容之后,本領域技術人員可以對本發明作各種改動或修改,這些等價形式同樣落于本申請所附權利要求書所限定的范圍。

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