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TALE蛋白AVRXA7在防治柑橘潰瘍病害上的應用.pdf

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TALE 蛋白 AVRXA7 防治 柑橘 潰瘍 病害 應用
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摘要
申請專利號:

CN201710319409.3

申請日:

20170509

公開號:

CN106973944A

公開日:

20170725

當前法律狀態:

有效性:

審查中

法律詳情:
IPC分類號: A01N63/02,A01P1/00 主分類號: A01N63/02,A01P1/00
申請人: 福建農林大學
發明人: 鄒華松,孫東玲,卓濤,范曉靜,戶勛
地址: 350002 福建省福州市倉山區上下店路15號
優先權: CN201710319409A
專利代理機構: 福州元創專利商標代理有限公司 代理人: 蔡學俊
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法律狀態
申請(專利)號:

CN201710319409.3

授權公告號:

法律狀態公告日:

法律狀態類型:

摘要

本發明提供TALE蛋白AvrXa7在防治柑橘潰瘍病害上的應用,屬生物技術領域,從稻黃單胞菌中分離的TALE蛋白AvrXa7通過干擾柑桔潰瘍病菌pthA4對感病基因的激活,抑制潰瘍病害的發生;在生防熒光假單胞菌Pf中表達AvrXa7,能夠有效抑制潰瘍癥狀的形成,AvrXa7是構建高效基因工程菌株的極佳基因資源,在柑橘潰瘍病的生物防控中具有重要的應用價值。

權利要求書

1.TALE蛋白AvrXa7在防治柑橘潰瘍病害上的應用。

說明書

技術領域

本專利屬生物技術領域,涉及TALE蛋白AvrXa7在防治柑橘潰瘍病害上的應用。AvrXa7來源于水稻白葉枯病菌,對柑橘潰瘍病菌中的PthA4致病功能有抑制作用,干擾柑桔中感病基因的表達,從而有效控制柑橘潰瘍病害發生。

背景技術

柑橘潰瘍病是我國柑橘產區的一個重要細菌病害,為國內外檢疫對象。引起潰瘍病產生的病原菌是柑橘黃單菌(Xanthomonas citri subsp. citri),在所有已經測序得柑橘黃單胞菌中都含有4個avr/pthA基因家族成員pthA1、pthA2、pthA3和pthA4,其中pthA4是病原菌的主要致病基因,該基因突變后病原菌在柑橘寄主上的致病力完全喪失。在病害發生過程中,病原菌首先克服寄主植物表層結構,隨后依賴pthA4激活柑橘中的感病基因表達,使得潰瘍癥狀最終形成。從提高寄主抗性角度對柑橘潰瘍病進行控制,除了選用基礎抗性較強的柑橘品種,對pthA4的致病功能進行干擾也是一個有效的控制策略,主要的突破途徑在于干擾pthA4對感病基因的激活。目前并未有利用水稻白葉枯病菌的TALE蛋白AvrXa7用于防治柑橘潰瘍病的報道。

發明內容

本發明的目的在于提供水稻白葉枯病菌的TALE蛋白AvrXa7在柑橘潰瘍病生物防治中應用。本發明利用水稻白葉枯病菌的AvrXa7干擾柑橘潰瘍病菌的致病基因pthA4對柑橘感病基因的激活,從而達到防治柑橘潰瘍病菌的目的。

本發明的優點在于:本發明的AvrXa7基因來源于引起水稻白葉枯病菌的稻黃單胞(Xanthomonas oryzae pv. oryzae)(Yang B, Zhu WG, Johnson LB and White FF.The virulence factor AvrXa7 of Xanthomonas oryzae pv. oryzae is a type III secretion pathway-dependent nuclear-localized double-stranded DNA-binding protein. PNAS, 2000, 97:9807–9812.),在基因序列上與柑橘潰瘍病菌pthA4同源性很高,屬同一個基因家族成員。在野生型柑橘潰瘍病菌中異源表達AvrXa7,潰瘍菌喪失了在柑橘上形成潰瘍癥狀的能力。轉錄組學和Real-time PCR結果顯示,與pthA4對應的感病基因在引入AvrXa7以后,不能被誘導表達,表明AvrXa7干擾了pthA4對柑橘感病基因的激活。將AvrXa7在熒光假單胞菌中表達,對潰瘍病有顯著的防治作用。相對柑橘潰瘍病菌而言,AvrXa7雖然是來源于黃單胞屬的不同種菌株,但可以干擾pthA4在致病過程中的功能,可用做高效生防菌株的分子改造,應用于柑橘潰瘍病的生態物控制。

附圖說明

圖1、AvrXa7在柑橘潰瘍病菌中抑制潰瘍病害的發生。

圖2、表達AvrXa7的熒光假單胞菌對柑橘潰瘍的防治作用。

具體實施方式

實施例1

(1)在野生型柑橘潰瘍病菌中表達AvrXa7

將avrXa7基因克隆到質粒pUFR034中,通過電轉化方法進入野生型柑橘潰瘍病菌Xac 29-1中。在NB液體培養基中培養后,注射接種柑橘葉片。5天后觀察潰瘍癥狀的形成情況。接種野生型菌株的區域,一般3天后就可以看到潰瘍癥狀出現,5天后注射接種區域的潰瘍斑隆起;而表達AvrXa7的潰瘍菌株接種后,觀察不到潰瘍癥狀的形成 (圖1)。

(2)AvrXa7對柑橘潰瘍病菌pthA4基因致病功能的干擾

柑橘植物接種攜帶AvrXa7的柑橘潰瘍菌株以后,運用轉錄組學方法分析寄主植物的基因表達情況,發現一批與avrXa7和pthA4相關的基因,其中最為突出的是與pthA4對應的感病基因。接種野生型菌株后,與pthA4對應的感病基因誘導表達,表達水平增高100多倍,而接種表達AvrXa7的潰瘍菌株后,感病基因沒有誘導表達,表明AvrXa7干擾了柑橘潰瘍病菌pthA4基因的致病功能。

(3)AvrXa7在柑橘潰瘍病害生物防治中的應用

將AvrXa7轉到生防熒光假單胞菌Pf中,借助假單胞菌的III型分泌系統,將AvrXa7分泌到寄主植物細胞。將野生型柑橘潰瘍病菌和Pf在液體培養基中培養后,采用摩擦接種的方法在柑橘葉片制造傷口,用攜帶AvrXa7的假單胞菌液浸泡葉片30秒,然后放在室溫下自然風干;2小時后,浸液接種柑橘潰瘍病菌。以后每隔10天用攜帶AvrXa7的假單胞菌液處理一次葉片。1個月后觀察潰瘍病的發生情況。用水處理作為對照,1個月后,葉片出現典型的潰瘍癥狀,在傷口的位置都會形成隆起的潰瘍病斑。生防假單胞菌的傷口也會出現潰瘍斑,但癥狀輕微,稍有凸起。攜帶AvrXa7的假單胞菌處理的葉片僅能看到葉片傷口的愈合,沒有看到任何潰瘍癥狀出現(圖2)。

以上所述僅為本發明的較佳實施例,凡依本發明申請專利范圍所做的均等變化與修飾,皆應屬本發明的涵蓋范圍。

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