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一種桃葉衛矛莖尖超低溫保存方法.pdf

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一種 桃葉衛矛莖尖 超低溫 保存 方法
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摘要
申請專利號:

CN201710239317.4

申請日:

20170413

公開號:

CN106993609A

公開日:

20170801

當前法律狀態:

有效性:

審查中

法律詳情:
IPC分類號: A01N3/00 主分類號: A01N3/00
申請人: 東北林業大學
發明人: 宋紅,李享,蘇晴
地址: 150040 黑龍江省哈爾濱市香坊區和興路26號
優先權: CN201710239317A
專利代理機構: 代理人:
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法律狀態
申請(專利)號:

CN201710239317.4

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法律狀態類型:

摘要

本發明涉及一種桃葉衛矛莖尖超低溫保存方法,依次包括:桃葉衛矛莖尖的剝離、莖尖預處理、裝載、PVS2玻璃化處理、液氮保存、解凍和卸載以及恢復培養的方法。本發明具有操作簡單、占用空間小、安全穩定、保存成本低等優點,同時經過超低溫保存后的莖尖能保存其遺傳完整性和穩定性。此外低溫環境還可以避免病蟲害的引入,在桃葉衛矛雜交育種以及分子研究方面上具有重要的實踐與推廣意義。

權利要求書

1.一種桃葉衛矛莖尖超低溫保存方法,其特征在于,依次包括:桃葉衛矛莖尖的剝離、莖尖預處理、裝載、PVS2玻璃化處理、液氮保存、解凍和卸載以及恢復培養的方法。2.根據權利要求1所述的桃葉衛矛莖尖超低溫保存方法,其特征在于:所述的桃葉衛矛莖尖的剝離具體是指:在無菌條件下,從生長健康的無菌桃葉衛矛組培苗上剝取的莖尖長度為2~3mm的離體莖尖。3.根據權利要求1所述的桃葉衛矛莖尖超低溫保存方法,其特征在于:所述的預處理是指將剝離后的莖尖放入預培養液中處理,預培養液中蔗糖最適濃度為0.4mol/L的MS鹽溶液,于環境條件為25℃的人工氣候箱中暗培養2d。4.根據權利要求1所述的桃葉衛矛莖尖超低溫保存方法,其特征在于:所述的裝載具體是指將預培養后的離體莖尖轉接于裝載液中,于室溫下裝載10~30min;所述的裝載液的組成為:MS鹽溶液+2M甘油+0.4M蔗糖。5.根據權利要求1所述的桃葉衛矛莖尖超低溫保存方法,其特征在于所述的玻璃化處理具體是指:將裝載后的莖尖放入100%PVS2玻璃化溶液于0℃條件下處理30min;所述的PVS2玻璃化溶液的組成為:MS鹽溶液+30%甘油+15%乙二醇+15%二甲基亞砜+0.4M蔗糖。6.根據權利要求1所述的桃葉衛矛莖尖超低溫保存方法,其特征在于所述的液氮保存是指:將PVS2溶液處理后的莖尖換上新的PVS2溶液,然后迅速將冷凍管浸入液氮中,至少冷凍1h以上。7.根據權利要求1所述的桃葉衛矛莖尖超低溫保存方法,其特征在于所述的解凍和卸載是指:將液氮保存后的冷凍管取出并于40℃水浴中化凍70s,再將冷凍管轉至超凈工作臺上用卸載液洗滌20min;所述的卸載液的組分為:MS鹽溶液+1.2M蔗糖。8.根據權利要求1所述的桃葉衛矛莖尖超低溫保存方法,其特征在于:所述的恢復培養具體是指將卸載液洗滌后的莖尖接種在恢復培養基上進行恢復培養;所述的恢復培養基為MS+6-BA1.0mg/L;所述的恢復培養條件為:先在25℃人工氣候箱中暗培養7d,然后轉入組培苗培養室進行培養。

說明書

技術領域

本發明涉及一種莖尖長期保存方法,具體是一種桃葉衛矛莖尖超低溫保存方法。

背景技術

桃葉衛矛,又名白杜、絲綿木,是衛矛科衛矛屬的一種小喬木,是我國常見的觀賞類庭園樹種之一,其葉形秀麗,植株繁茂,包被有紅色假種皮的果實可長期宿存于枝頭,到了冬季,白雪紅果相映,十分美麗,為冬季的北方園林增添了不少色彩。桃葉衛矛在耐寒、抗旱、抗風等方面具有良好的適應性;桃葉衛矛果實總皂苷對人肝癌細胞系-SMMC、人宮頸癌細胞系-HeLa和乳腺癌細胞系-MCF7有明顯的抑制生長作用;桃葉衛矛的種子含豐富的脂肪類物質,含油率高達40%以上,可用做工業用油;木材細膩堅韌,可用于雕刻、制帆桿或滑車等;種子及根藥用,可用于治療膝關節痛、漆瘡等疾病。由此可見,桃葉衛矛是一種集工業、藥用、觀賞應用于一體的植物,具有較高的推廣價值。若采用傳統的種植保存,極易使其受到病菌或蟲害的影響,進而造成極大的人力財力的損失,由于莖尖具有良好的分生能力,因此目前已經廣泛地將其應用于植物種質資源的離體保存。

植物種質資源超低溫保存是指將植物細胞、組織或器官在液氮(-196℃)的超低溫條件下進行保存。在如此低的溫度下,植物材料中參與新陳代謝的各種生物酶的活性受到極大抑制,生物體新陳代謝基本停止,處于“假死”狀態,利用該方法可以實現植物種質資源的永久保存。目前成功進行超低溫保存的材料類型有種子、休眠芽、莖尖分生組織、花粉、合子胚(胚軸)、體細胞胚、懸浮細胞、愈傷組織、原生質體等。而較于植物的其他部位,頂端分生組織具有更強的分生能力,而當莖尖經過超低溫保存后依然能夠保持較強的分生能力,因此莖尖也是超低溫保存的首選材料之一,因此已經廣泛應用于植物種質資源超低溫保存。

將超低溫保存技術應用于莖尖保存,其優點:操作簡單易行、占用空間小、安全穩定保存成本低同時還能很好服務于育種工作,還可以避免病蟲害的引入,為地區間、國際間的種質交換提供方便。

桃葉衛矛莖尖超低溫保存目前還未見報道。因此,研發一種適合于桃葉衛矛莖尖的可行的超低溫保存方法是非常必要的。

發明內容

本發明的目的是通過以下技術方案來實現:

本發明涉及一種桃葉衛矛莖尖玻璃化超低溫保存的方法,依次包括:桃葉衛矛莖尖的剝離、莖尖預處理、裝載、PVS2玻璃化處理、液氮保存、解凍和卸載以及恢復培養的方法。

優選地,所述的桃葉衛矛莖尖的剝離具體是指:在無菌條件下,從生長健康的無菌桃葉衛矛組培苗上剝取的莖尖長度為2~3mm的離體莖尖。

優選地,所述的預處理是指:將剝離后的莖尖放入預培養液中處理,預培養液中蔗糖最適濃度為0.4mol/L的MS鹽溶液,于環境條件為25℃的人工氣候箱中暗培養2d。

優選地,所述的裝載具體是指:將預培養后的離體莖尖轉接于裝載液中,于室溫下裝載10~30min;所述的裝載液的組成為:2M甘油+0.4M蔗糖的MS鹽溶液。

優選地,所述的玻璃化處理具體是指:將裝載后的莖尖放入100%PVS2玻璃化溶液于0℃條件下處理30min;所述的PVS2玻璃化溶液的組成為:MS鹽溶液+30%甘油+15%乙二醇15%+15%二甲基亞砜+0.4M蔗糖。

優選地,所述的液氮保存是指:將PVS2溶液處理后的莖尖換上新的PVS2溶液,然后迅速將冷凍管浸入液氮中,至少冷凍1h以上。

優選地,所述的解凍和卸載是指:將液氮保存后的冷凍管取出并于40℃水浴中化凍70s,再將冷凍管轉至超凈工作臺上用卸載液洗滌20min;所述的卸載液的組分為:MS鹽溶液+1.2M蔗糖。

優選地,所述的恢復培養具體是指:將卸載液洗滌后的莖尖接種在恢復培養基上進行恢復培養;所述的恢復培養基為MS+6-BA1.0mg/L;所述的恢復培養條件為:先在25℃人工氣候箱中暗培養7d,然后轉入組培苗培養室進行培養。

與現有技術相比,本發明存在以下有益結果:

本發明的一種桃葉衛矛莖尖超低溫保存的方法,是一種長期安全、穩定可靠、簡單有效的保存桃葉衛矛優良種質資源的方法,超低溫保存后桃葉衛矛莖尖成活率高達70%;本發明以不定芽莖尖為超低溫保存材料,一方面取材方便,另一方面由于莖尖含有莖尖分生組織,細胞再生能力較強,遺傳穩定性高。

附圖說明

圖1為本發明實施例3中桃葉衛矛莖尖長度對超低溫保存后莖尖成活率的影響

圖2為本發明實施例4中預培養液蔗糖濃度對超低溫保存后莖尖成活率的影響

圖3為本發明實施例4中預培養時間對超低溫保存后莖尖成活率的影響

圖4為本發明實施例5中裝載液處理時間對超低溫保存后莖尖成活率的影響

圖5為本發明實施例6中PVS2溶液處理時間對超低溫保存后莖尖成活率的影響

圖6為本發明實施例7中卸載液處理時間對超低溫保存后莖尖成活率的影響

圖7為本發明中桃葉衛矛莖尖超低溫保存體系流程圖;a桃葉衛矛實生苗頂芽;b桃葉衛矛離體莖尖;c超低溫保存后轉入恢復培養基的桃葉衛矛莖尖;d暗培養7d后桃葉衛矛莖尖存活情況;e超低溫保存后存活的莖尖;f超低溫保存后死亡的莖尖;g,h超低溫保存后桃葉衛矛莖尖形成的愈傷組織;i超低溫保存后桃葉衛矛莖尖愈傷組織的增殖;j超低溫保存后桃葉衛矛莖尖愈傷組織的分化;k分化芽的增殖;l分化芽成苗;m超低溫保存后桃葉衛矛再生苗的生根;n超低溫保存后桃葉衛矛再生苗的移栽。

具體實施方式:

下面結合實施例對本發明做進一步詳細說明,本實施例在以本發明技術方案為前提下進行實施,給出了詳細的實施方式和具體的操作過程。

實施例1

一種桃葉衛矛莖尖超低溫保存的方法,具體操作如下:

1)在無菌條件下,從生長健康的無菌桃葉衛矛組培苗上剝取的莖尖長度為2~3mm的離體莖尖;

2)將剝離后的莖尖放入預培養液中處理,預培養液中蔗糖最適濃度為0.4mol/L的MS鹽溶液,于環境條件為25℃的人工氣候箱中暗培養2d;

3)將預培養后的離體莖尖轉接于裝載液中,于室溫下裝載10~30min;所述的裝載液的組成為:MS鹽溶液+2M甘油+0.4M蔗糖;

4)將裝載后的莖尖放入100%PVS2玻璃化溶液于0℃條件下處理30min;所述的PVS2玻璃化溶液的組成為:MS鹽溶液+30%甘油+15%乙二醇+15%二甲基亞砜+0.4M蔗糖;

5)將PVS2溶液處理后的莖尖換上新的PVS2溶液,然后迅速將冷凍管浸入液氮中,至少冷凍1h以上;

6)將液氮保存后的冷凍管取出并于40℃水浴中化凍70s,再將冷凍管轉至超凈工作臺上用卸載液洗滌20min;所述的卸載液的組分為:MS鹽溶液+1.2M蔗糖;

7)將卸載液洗滌后的莖尖接種在恢復培養基上進行恢復培養;所述的恢復培養基為MS+6-BA1.0mg/L;所述的恢復培養條件為:先在25℃人工氣候箱中暗培養7d,然后轉入組培苗培養室進行培養。

實施例2無菌苗的獲得

在桃葉衛矛的營養生長期(5~8月份),將帶莖尖的外植體帶回實驗室用洗潔精水進行清洗,并在流動水下沖洗1~2h。沖洗完畢后將外植體放置在超凈工作臺上進行滅菌。首先用75%酒精對其表面滅菌10s,用無菌水沖洗3~4遍;再利用不同的滅菌劑處理不同時間進行深度滅菌(如表1所示),最后用無菌水沖洗6~8遍。然后將剝離的莖尖接種于MS+6-BA2.0mg/L+NAA0.5mg/L+30g/L的蔗糖+7g/L瓊脂,pH值為5.8的培養基上。15d后統計各瓶中的污染率、死亡率以及成活率。同時為了研究愈傷組織最適宜的培養基,將莖尖接種于不同濃度培養基上,以MS為基本培養基,加入30g/L的蔗糖,不同濃度的6-BA和NAA,30d后統計愈傷組織誘導率及其生長情況。然后以所得的愈傷組織為材料,來研究最適宜愈傷組織分化幼芽的培養基激素配比,在MS基本培養基中將不同濃度的6-BA和NAA進行組合后加入,其他條件設為30g/L的蔗糖+7g/L瓊脂,pH值為5.8。然后當分化芽長至3cm以上時對其進行剝離接種于1/2MS+NAA0.2mg/L的生根培養基上。

研究結果表明(如表2所示)采用HgCl2進行滅菌后外植體的萌發率要明顯高于采用NaClO進行滅菌,且污染率小。并且隨著處理時間的增加,外植體污染率在逐漸減小,但是其死亡率也在增加,在具體試驗操作中也發現部分莖尖外植體由于未將HgCl2沖洗干凈,外植體出現發黃枯萎的現象,因此選擇75%酒精10s+0.1%HgCl24min作為最佳滅菌方法。另外不同濃度的6-BA和NAA組合對桃葉衛矛愈傷組織的誘導起著顯著的作用(如表3所示),隨著6-BA濃度的逐漸提高,桃葉衛矛愈傷組織的出愈率呈現出先升高后降低的趨勢;隨著NAA濃度的逐漸升高,桃葉衛矛愈傷組織的出愈率呈現出逐漸降低的趨勢。此外當6-BA濃度和NAA濃度相差較大時,出愈率高。最終比較可知當6-BA濃度為1.0mg/L,NAA濃度為0.1mg/L時,桃葉衛矛出愈率最高可達98.0%,且生長情況良好。同時,對于芽分化最適培養基的研究結果表明不同濃度的6-BA和NAA對芽的分化和增殖具有明顯的作用(如表4所示)。隨著6-BA濃度的逐漸升高,愈傷組織上芽的分化率和增殖系數不斷增加;而當6-BA與NAA相結合時,芽的分化率呈現不同的變化。當6-BA濃度為0.5mg/L時,不論NAA濃度的高低,芽的分化率和增殖系數都比較低,且分化芽的長勢弱;當愈傷組織接種在6-BA濃度為1.5mg/L,NAA濃度為0.2mg/L的培養基上時,芽的分化率可達99%,增值系數為3.21,且分化芽的生長狀況良好。

表1試驗所用的不同滅菌方式組合

表2不同滅菌劑及其處理時間對桃葉衛矛外植體生長的影響

表3不同生長調節劑及其濃度配比對愈傷組織誘導的影響

表4不同生長調節劑及其濃度配比對芽分化與增殖的影響

實施例3

測試了莖尖長度對桃葉衛矛莖尖超低溫保存的影響:無菌條件下剝取生長健康的無菌桃葉衛矛組培苗的莖尖,通過體視顯微鏡可以觀察到桃葉衛矛莖尖部位是對稱型,因此在剝離過程中可以依據所剩幼葉的對數來確定莖尖長度,共設置1~2mm(不包含葉原基)、2~3mm(包含一對葉原基)、3~5mm(包含兩對葉原基)三個梯度。研究結果表明(如圖1所示)桃葉衛矛莖尖長度對超低溫保存后莖尖成活率有顯著影響。當莖尖長度為2~3mm時,超低溫保存后莖尖成活率可達83.33%,遠大于長度為1~2mm和3~5mm的莖尖。當莖尖長度為1~2mm時,由于莖尖分生組織外面沒有幼葉包被使得分生組織承受較大損害,最終失活;而當莖尖長度為3~5mm時,雖然莖尖分生組織得到良好的保護,但是由于莖尖體積過大,導致在玻璃化過程中莖尖分生組織部位脫水不徹底,進而使得在超低溫保存過程中形成結晶破壞細胞結構,最終使得莖尖失活。因此在莖尖剝離過程中選擇適當的切取長度對于超低溫保存后莖尖成活是至關重要的。

實施例4

測試了預培養基中蔗糖濃度和預培養時間對桃葉衛矛莖尖超低溫保存的影響:僅改變預培養基中的蔗糖濃度和預培養時間,首先將剝取的莖尖分別放入裝有不同濃度(0.1M~0.5M)蔗糖的MS鹽溶液中進行預培養;預培養環境條件為25℃暗培養,培養時間為(0、1d、2d、3d);然后統計莖尖經過超低溫保存后恢復培養的成活率。研究結果表明(如圖2圖3所示)將剝離的莖尖放入不同蔗糖濃度的預培養液中進行預培養不同時間后,莖尖經過超低溫保存后的成活率各有不同,當蔗糖濃度為0.4M時,預培養時間為2d時,莖尖成活率最高可達60%。由此可知預培養是影響桃葉衛矛莖尖超低溫保存成活率的關鍵因素,最佳的預培養蔗糖濃度為0.4M,培養時間為2d。

實施例5

測試了裝載液處理時間對超低溫保存后莖尖成活率的影響:莖尖經過預培養處理后轉入超凈工作臺,將莖尖連同預培養液一同倒入培養皿(d=120mm)中,再用無菌牙簽將莖尖挑入裝有Loading溶液的冷凍管中,室溫下裝載不同的時間(0、10、20、30min)。研究結果表明(如圖4所示)莖尖經過裝載液處理和對照組之間存在顯著差異,當莖尖不經裝載液處理直接進行PVS2脫水處理時,莖尖成活率僅為6%;當裝載液處理時間為10min時,莖尖成活率可達70%,而隨著裝載時間的進一步延長,處理10min的成活率與處理20min、40min的結果沒有顯著性差異,因此為了節省時間提高保存效率,裝載液最佳處理時間為10min。

實施例6

測試了PVS2溶液處理時間對超低溫保存后莖尖成活率的影響:莖尖經過Loading溶液處理后轉入在玻璃化溶液PVS2中,在0℃冰盒中處理不同的時間(0、20、40、60min)后,測定莖尖的成活率;研究結果表明(如圖5所示)當莖尖未經PVS2溶液處理直接投入液氮中保存后,莖尖在恢復培養時全部失活變白;當PVS2處理時間為60min時,莖尖成活率最高可達73.3%,而當處理時間進一步延長至80min時,成活率降低至50%。

實施例7

測試了卸載液處理時間對超低溫保存后莖尖成活率的影響:將裝有莖尖的冷凍管從液氮中撈出后迅速投入40℃水浴鍋中化凍70s,再將冷凍管中的莖尖轉入Uploading溶液中處理不同的時間(0、10、20、30min),洗滌過程在無菌環境中進行;研究結果表明(如圖6所示)當不經過卸載液處理的莖尖直接進行恢復培養時,莖尖全部死亡,說明莖尖外部仍有殘留的PVS2溶液;利用含1.2M蔗糖的MS鹽溶液對化凍后的莖尖洗滌10min后,莖尖成活率可達80%以上,洗滌時間的長短對莖尖成活率的影響不顯著。

實施例8

測試了恢復培養基對超低溫保存后莖尖成活率的影響:超低溫保存后的桃葉衛矛莖尖經Uploading溶液洗滌后,接種在不同的恢復培養基上進行培養,培養條件為先在25℃人工氣候箱中暗培養7d,然后轉入組培苗培養室進行培養。根據不同生長調節劑的配比將恢復培養基設置為:①MS;②MS+6-BA1.0mg/L;③MS+6-BA1.0mg/L+NAA0.1mg/L;研究結果表明(如表5所示)莖尖在不添加激素的培養基中的成活率低于添加激素的培養基;此外還可以看出在只添加6-BA的恢復培養基中莖尖恢復效果優于添加6-BA和NAA的恢復培養基,由此可知,6-BA對于超低溫保存后莖尖成活率具有顯著影響。

表5恢復培養基對超低溫保存后莖尖成活率的影響

上述實施例只為說明本發明的技術構思及特點,其目的在于讓熟悉此領域技術的人士能夠了解本發明內容并加以實施,并不能以此限制本發明的保護范圍。

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