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油松節中茋類化合物作為免疫抑制活性成分在制備藥物或保健品中的用途.pdf

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油松 節中茋類 化合物 作為 免疫抑制 活性 成分 制備 藥物 保健品 中的 用途
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摘要
申請專利號:

CN201310287562.4

申請日:

20130709

公開號:

CN103479601A

公開日:

20140101

當前法律狀態:

有效性:

失效

法律詳情:
IPC分類號: A61K31/085,A61K31/05,A61P37/06,A61P19/02,A61P29/00,A61P1/16,A23L1/29 主分類號: A61K31/085,A61K31/05,A61P37/06,A61P19/02,A61P29/00,A61P1/16,A23L1/29
申請人: 中國科學院上海藥物研究所,上海中醫藥大學
發明人: 趙維民,楊以阜,王羅醫,楊揚,張如雋,左建平
地址: 201203 上海市浦東新區浦東張江祖沖之路555號
優先權: CN201310287562A
專利代理機構: 北京金信立方知識產權代理有限公司 代理人: 朱梅;王榮
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法律狀態
申請(專利)號:

CN201310287562.4

授權公告號:

法律狀態公告日:

法律狀態類型:

摘要

本發明屬于醫藥技術領域,具體而言,涉及茋類化合物,例如赤松素(pinosylvin)、赤松素單甲醚(pinosylvin monomethyl ether,PME)和松茋(pinostilbene)在制備預防或治療類風濕關節炎等自身免疫性疾病的藥物或保健品中的用途以及在制備用于預防或治療移植后排斥反應的藥物中的用途。經體外免疫抑制生物活性篩選和動物體內生物活性測定,該類化合物無明顯細胞毒作用,可顯著抑制T淋巴細胞的增殖,口服給藥能顯著減輕牛II型膠原誘導的小鼠關節炎病變的嚴重程度,可作為一類新型天然的免疫抑制劑,用于類風濕性關節炎等自身免疫性疾病的預防和治療。赤松素赤松素單甲醚松茋。

權利要求書

1.由油松節提取的茋類化合物在制備用于預防或治療自身免疫性疾病的保健品或藥物中的用途或者在制備用于預防或治療移植后排斥反應的藥物中的用途。2.根據權利要求1所述的用途,其中,所述由油松節提取的茋類化合物為選自赤松素、赤松素單甲醚和松茋中的一種或多種。3.根據權利要求1所述的用途,其中,所述自身免疫性疾病為T淋巴細胞介導的免疫性疾病。4.根據權利要求1所述的用途,其中,所述自身免疫性疾病為類風濕性關節炎、系統性紅斑狼瘡、多發性硬化癥、干燥綜合癥或自身免疫性肝炎。

說明書

技術領域

本發明屬于醫藥技術領域,具體而言,涉及茋類化合物,例如赤松素(pinosylvin)、赤松素單甲醚(pinosylvin?monomethyl?ether,PME)和松茋(pinostilbene)作為免疫抑制活性成分在藥物及保健品中的用途。

背景技術

人體免疫功能的失調可導致多種疾病的產生,如類風濕性關節炎、系統性紅斑狼瘡、多發性硬化癥、干燥綜合癥和自身免疫性肝炎,等等。作為自身免疫性疾病的一種,類風濕性關節炎常見的臨床表現為頑固的慢性關節炎癥,尤其是四肢小關節的慢性關節炎癥,并可引起全身的關節腫脹疼痛及功能障礙。我國約有400萬類風濕性關節炎患者,患病率為0.32-0.34%,致殘率高達15%,給患者帶來很大的痛苦,對社會造成沉重的負擔。[參考文獻:Smolen,J.S;Steiner,G.Therapeutic?strategies?for?rheumatoid?arthritis.Nat.Rev.Drug?Discov.2003,2,473-488.]

免疫抑制劑(immunosuppressor)是針對免疫系統具有抑制作用的藥物,不同的具體藥物分別作用于免疫反應及免疫調節的不同環節,在臨床上可用于自身免疫性疾病的治療和防止器官移植手術產生的排斥反應。免疫抑制劑主要分為以下幾種:(1)化學制劑類,如烷化劑類的氮芥;(2)激素類,如糖皮質激素;(3)真菌代謝產物,如環孢素A(cyclosporinA,CsA);(4)中藥及其有效成分。免疫抑制劑大多具有明顯的毒副作用,主要是產生骨髓抑制,肝、腎毒性等。此外,一些免疫抑制劑作用的非特異性可導致機體免疫功能下降,增加機體被病原微生物感染致病的風險,長期應用還可能提高腫瘤的發病率。因此,尋找新型安全有效的免疫抑制劑對自身免疫性疾病的治療具有重要意義。[參考文獻:Mann,J.Natural?products?as?immunosuppressive?agents.Nat.Prod.Rep.2001,18,417-430.]

天然產物具有結構骨架多樣性的特點,是藥物先導結構的重要來源之一,據統計,在1981-2010年間全世界批準的175個小分子抗腫瘤藥物中,有85個((占48.6%))源于天然產物或其衍生物。中草藥是我國人民千百年來抵御各種疾病的經驗產物,許多中草藥被藥理學及現代臨床驗證具有確切的療效。依據中草藥的療效研究其活性作用的物質基礎,是發現藥物先導化合物的有效途徑。[參考文獻:Newman,D.J.;Cragg,G.M.Natural?products?as?sources?of?new?drugs?over?the30years?from1981to2010.J.Nat.Prod.2012,75,311-335.]

油松節為松科(Pinaceae)松屬(Pinus)植物油松(Pinus?tabulaeformis?Carr.)或馬尾松(Pinus?massoniana?Lamb.)的干燥瘤狀物或分支節(又名松節、黃松木節、松榔頭等),其具有祛風除濕、通絡止痛之功效,用于風寒濕痹、歷節風痛、轉筋攣急和跌打傷痛等癥。[參考文獻:國家藥典委員會.中華人民共和國藥典(2010版一部).北京:中國醫藥科技出版社,2010:211.]

發明內容

本發明針對自身免疫性疾病或移植后排斥反應通過免疫抑制生物活性篩選,對油松節進行活性成分跟蹤分離,從中鑒定出具有免疫抑制活性的茋類化合物,例如赤松素(pinosylvin)、赤松素單甲醚(pinosylvin?monomethyl?ether,PME)和松茋(pinostilbene),其結構式如下:

赤松素????赤松素單甲醚????松茋

經體外模型和動物體內試驗確定,該類化合物在無明顯細胞毒作用的情況下,可顯著抑制T淋巴細胞的增殖,口服給藥能顯著減輕牛II型膠原誘導的小鼠關節炎病變的嚴重程度。

因此,本發明的一個目的為提供由油松節提取的茋類化合物在制備免疫抑制劑中的用途。

本發明的另一個目的為提供由油松節提取的茋類化合物在制備用于預防或治療自身免疫性疾病的保健品或藥物中的用途;或者在制備用于預防或治療移植后排斥反應的藥物中的用途。

其中,由油松節提取的茋類化合物按以下步驟獲得:

干燥的油松節藥材經醇提、減壓濃縮、MCI樹脂減壓柱層析分離、硅膠柱層析分離和Toyopearl?HW-40柱層析分離純化。

其中,所述由油松節提取的茋類化合物為選自赤松素、赤松素單甲醚和松茋中的一種或多種;所述自身免疫性疾病為T細胞介導的免疫性疾病,優選為類風濕性關節炎、系統性紅斑狼瘡、多發性硬化癥、干燥綜合癥或自身免疫性肝炎等。

附圖說明

圖1為動物體內試驗中赤松素單甲醚對小鼠關節炎病變嚴重程度的影響;

圖2為赤松素單甲醚對關節炎模型小鼠血清中抗CII抗體(IgG)產生的影響。

具體實施方式

以下通過具體實施例來進一步說明本發明。應理解,以下實施例僅用于說明本發明而不用于限定本發明的范圍。

實施例1.油松節中茋類化合物的制備分離

干燥的油松節藥材(1.0kg)(2012年8月購自安徽亳州)粉碎,用工業乙醇室溫浸泡提取3次,每次3天。減壓濃縮提取液得到乙醇浸膏(198g)。所得油松節乙醇浸膏以MCI樹脂(Mitsubishi?Chemical?Corporation,日本,東京)減壓柱層析分離,甲醇-水(5:5~10:0)梯度洗脫,得到流分Fr.1~Fr.5。Fr.2(16g)經硅膠(青島海洋化工有限公司,中國,青島)柱層析分離,以石油醚-乙酸乙酯(15:1~2:1)梯度洗脫,得亞流分Fr.21~Fr.27。Fr.26再以Toyopearl?HW-40(Tosoh?Corporation,日本,東京)柱層析(95%乙醇)分離,得流分Fr.261~Fr.263。Fr.263經硅膠柱層析(氯仿-甲醇,50:1)分離純化,得化合物松茋(45mg)和赤松素(120mg)。Fr.3(17g)經硅膠柱層析分離,以石油醚-乙酸乙酯(10:1~1:1)梯度洗脫,得亞流分Fr.31~Fr.39。Fr.32先后以C18反相硅膠柱層析(70%含水乙腈)、硅膠柱層析(氯仿-丙酮,50:1)和Toyopearl?HW-40柱層析(95%乙醇)分離純化,得化合物赤松素單甲醚(660mg)。

赤松素:分子式:C14H12O2,分子量:212;1H?NMR(CD3OD,400MHz)δ:7.50(2H,d,J=7.2Hz),7.33(2H,t,J=7.6Hz),7.22(1H,t,J=7.3Hz),7.04(1H,d,J=16.3Hz),6.98(1H,d,J=16.3Hz),6.49(2H,d,J=2.2Hz),6.20(1H,br?s);ESIMS(正離子模式):m/z213[M+H]+,ESIMS(負離子模式):m/z211[M-H]-。[參考文獻:Wang,M.;Jin,Y.;Ho,C.T.Evaluation?of?resveratrol?derivatives?as?potential?antioxidants?and?identification?of?a?reaction?product?of?resveratrol?and2,2-diphenyl-1-picryhydrazyl?radical.J.Agric.Food?Chem.1999,47,3974-3977.]

赤松素單甲醚:分子式:C15H14O2,分子量:226;1H?NMR(CD3OD,400MHz)δ:7.50(2H,d,J=7.4Hz),7.32(2H,t,J=7.6Hz),7.21(1H,t,J=7.3Hz),7.08(1H,d,J=16.4Hz),7.02(1H,d,J=16.4Hz),6.60(2H,d,J=2.0Hz),6.30(1H,br?s),3.76(3H,s);ESIMS(正離子模式):m/z227[M+H]+,ESIMS(負離子模式):m/z225[M-H]-。[參考文獻:Garo,E.;Hu,J.F.;Goering,M.;Hough,G.;O’Neil-Johnson,M.;Eldridge,G.Stilbenes?from?the?Orchid?Phragmipedium?sp.J.Nat.Prod.2007,70,968-973.]

松茋:分子式:C15H14O3,分子量:242;1H?NMR(CD3OD,400MHz)δ:7.37(2H,d,J=8.5Hz),7.00(1H,d,J=16.4Hz),6.85(1H,d,J=16.4Hz),6.77(2H,d,J=8.6Hz),6.55(2H,m),7.22(1H,t,J=2.2Hz),3.77(3H,s);ESIMS(正離子模式):m/z243[M+H]+,ESIMS(負離子模式):m/z241[M-H]-。[參考文獻:Paul,S.;Mizuno,C.S.;Lee,H.J.;Zheng,X.;Chajkowisk,S.;Rimoldi,J.M.;Conney,A.;Suh,N.;Rimando,A.M.In?vitro?and?in?vivo?studies?on?stilbene?analogs?as?potential?treatment?agents?for?colon?cancer.Eur.J.Med.Chem.2010,45,3702-3708.]

實施例2.油松節中茋類化合物的體外免疫抑制活性測試

淋巴細胞毒性評價:脊椎法處死小鼠,無菌取其脾臟,磨碎制成單細胞懸液,用3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium?bromide(MTT)溶解液(含10%十二烷基硫酸鈉(sodium?dodecyl?sulfate,SDS)和50%二甲基甲酰胺(DMF))去除紅細胞后,用含10%胎牛血清(fetal?bovine?serum,FBS)的Roswell?Park?Memorial?Institute(RPMI-1640)培養液將細胞濃度調成5×105個/mL。96孔板中加入5×105細胞懸液,加入200μL?RPMI-1640培養液,適當濃度的待測試樣品,放入37°C、5%CO2培養箱中培養48小時,在結束培養前5小時,每孔加入5mg/mL?MTT18μL。結束培養時,每孔加入90μL?MTT溶解液,在培養箱中放置6-7小時后,用酶標儀于570nm處測定OD570值。

淋巴細胞增殖實驗:5×105個新鮮的脾臟細胞按照以上條件培養48小時,培養液用5μg/mL的伴刀豆蛋白A(concanavalin?A,ConA)來誘導細胞的增殖,各待測組分以適當的濃度加入測試其活性。以3H-TdR滲入法定量測定細胞的增殖。在培養結束前8個小時每孔加入25μCi的3H-TdR,培養結束,用細胞收集儀收集細胞于玻璃纖維膜上,加入閃爍液,用液體閃爍計數儀檢測DNA中3H-TdR滲入量來反映細胞增殖情況。

測試結果如表1所示,結果表明,茋類化合物赤松素、赤松素單甲醚和松茋在無明顯細胞毒作用情況下,對T淋巴細胞的增殖具有顯著抑制作用。

表1油松節中茋類化合物的體外免疫抑制活性測試結果

實施例3.化合物赤松素單甲醚(PME)對實驗性類風濕關節炎動物模型的治療作用

采用牛II型膠原(CII)誘導DBA/1小鼠關節炎模型(CIA)。CII溶于0.1M醋酸溶液,于4°C保存過夜。實驗當天將等體積含結核分枝桿菌菌株(Mycobacterium?tuberculosis?strain)H37Rv的弗氏完全佐劑(complete?Freund’s?adjuvant,CFA)與膠原充分乳化混勻,以250μg乳化劑于DBA/1小鼠尾基部進行致敏,3周后以同樣劑量的乳化劑于尾部進行攻擊。在攻擊后1周確認模型小鼠發病,開始進行連續2周的口服給藥治療。PME治療組在以CII第2次免疫攻擊小鼠后的第7天開始到第21天實驗結束,每隔1天觀察溶劑對照組和PME治療組中的每只小鼠關節炎病變嚴重程度。關節病變的嚴重程度通過評分標準評定確定,每一肢體關節炎評分指數在0-4分之間(0分:正常;1分:輕度紅腫或足趾關節紅腫;2分:中度紅腫并延伸至整個足部;3分:較重紅腫并延伸至踝關節;4分:趾、足、踝均嚴重紅腫,消退后關節強直),結果以四肢評分的總和表示。

如附圖1所示,實驗結果表明,化合物赤松素單甲醚(PME)在50mg/kg和100mg/kg口服給藥劑量下,能夠顯著減輕小鼠關節炎病變的嚴重程度(圖1)。

實施例4.化合物赤松素單甲醚(PME)對關節炎模型小鼠血清中抗CII抗體(IgG)產生的影響

模型小鼠處死后,取其血清,備用。以CII(50μg/ml)加入96孔板中37℃包被1小時,密封酶標板,防止蒸發。而后用洗液洗3次。在室溫下將膠原溶液倒掉,用洗液洗3次,每孔加入200μl封閉液。密封平板,在室溫下放置1小時,而后用洗液洗3次。將血清樣品分別稀釋1000倍(測定IgG2a)和5000倍(測定總IgG和IgG1),每孔加入50μl標準品或血清樣品(封閉液稀釋),密封平板,在室溫放置2小時。而后用洗液洗3次。每孔加入50μl加入稀釋的HRP-羊抗鼠IgG、IgG1、IgG2a孵育1小時。密封酶標板,在室溫放置1小時。而后用洗液洗3次。在使用時,將反應底物TMB用0.1M檸檬酸-0.2M?NaH2PO4緩沖液(pH5.4)稀釋成0.1mg/ml,加入0.075%H2O2,每孔加入100ul,在室溫放置30分鐘。加入50μl終止液終止現色反應。于450nm、校正570nm處,測定OD值。根據標準曲線換算出培養上清中細胞因子含量。

CIA的發生伴隨著高水平的外周循環抗體的產生。結果顯示化合物赤松素單甲醚高劑量組(100mg/kg)給藥顯著抑制了CII免疫小鼠血清中CII特異性抗體的水平(圖2)。

我們對油松節中茋類化合物進行了初步的藥理學研究,并對赤松素單甲醚(PME)進行了進一步深入的實驗。實驗結果顯示:由油松節中提取的茋類化合物在無明顯細胞毒作用情況下,對T淋巴細胞的增殖具有顯著抑制作用;以PME為代表的這類茋類化合物能夠有效地抑制由ConA誘導的T淋巴細胞增殖,證明其具有良好的免疫抑制活性;PME能抑制小鼠四肢炎癥的發展,臨床評分顯示具有良好的量效關系,PME還降低了血清中抗CII特異性抗體的水平,進一步證明其免疫抑制活性。由于PME與赤松素和松茋母核結構相同,僅有個別取代基的不同,因此有理由推定赤松素和松茋以及其他從油松節中提取的與其結構類似的茋類化合物具有與PME相似的藥理活性。同時,T淋巴細胞在移植后排斥反應中發揮著重要的介導作用,因此從油松節中提取的茋類化合物也能夠用于預防或治療移植后排斥反應。

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