• / 5
  • 下載費用:30 金幣  

牛羊腸毒血癥的D型產氣莢膜梭菌類毒素疫苗的制備方法.pdf

關 鍵 詞:
牛羊 毒血癥 型產氣 莢膜 菌類 毒素 疫苗 制備 方法
  專利查詢網所有資源均是用戶自行上傳分享,僅供網友學習交流,未經上傳用戶書面授權,請勿作他用。
摘要
申請專利號:

CN201310398764.6

申請日:

20130905

公開號:

CN103463632B

公開日:

20160106

當前法律狀態:

有效性:

有效

法律詳情:
IPC分類號: A61K39/08,A61P31/04 主分類號: A61K39/08,A61P31/04
申請人: 山東農業大學
發明人: 柴同杰,王方山,王海榮
地址: 271018 山東省泰安市岱宗大街61號
優先權: CN201310398764A
專利代理機構: 代理人:
PDF完整版下載: PDF下載
法律狀態
申請(專利)號:

CN201310398764.6

授權公告號:

法律狀態公告日:

法律狀態類型:

摘要

本發明涉及一種牛羊腸毒血癥的D型產氣莢膜梭菌類毒素疫苗的制備方法,是利用D型產氣莢膜梭菌菌種經過菌種復蘇、增菌、培毒、滅活制備類毒素溶液;將類毒素溶液與白油佐劑乳化制得;使用時,對牛羊肌肉注射,每半年免疫一次,每次4ml,可有效的防止牛羊腸毒血癥的發生。本發明根據該病的致病機理開發制備了效價全、免疫力強、針對性好、無毒副作用的D型產氣莢膜梭菌類毒素疫苗,用于動物的D型產氣莢膜梭菌病的預防,控制D型產氣莢膜梭菌病的流行。

權利要求書

1.一種牛羊腸毒血癥的D型產氣莢膜梭菌類毒素疫苗,其特征在于通過以下制備方法得到:1)將D型產氣莢膜梭菌菌種接種于5%綿羊血-1%葡萄糖-瓊脂平板上,37℃厭氧培養36小時復蘇;2)挑取復蘇后的單個菌落接種于硫乙醇酸鹽流體培養基FT45℃厭氧增菌10h;將FT增菌培養液按照接種量5%體積比接種厭氧肉肝湯,43℃厭氧培養6h;取厭氧肉肝湯菌液4℃10000r/min離心15min,蔡氏濾器過濾取上清得到毒素溶液;3)將毒素溶液用1MNaOH調pH至7.2,然后加入甲醛使毒素溶液中甲醛濃度達到0.3%,充分振蕩混勻,置37℃96h滅活,間隔5-6h振搖一次,即得類毒素溶液;4)將白油和Span-80按照94:6的體積比混合,再加入白油和Span-80混合液質量比2%的硬脂酸鋁溶化混勻,121℃高壓滅菌30分鐘即為油相;取類毒素溶液,加入Tween-80s使Tween-80s在類毒素溶液中濃度達到2%,混勻,即為水相;將油相與水相按體積比1:1的比例乳化,乳化液中加入硫柳汞使硫柳汞終濃度為0.01%,即得牛羊腸毒血癥的D型產氣莢膜梭菌類毒素疫苗;所述5%綿羊血-1%葡萄糖-瓊脂平板成分為:1克葡萄糖、3.8克豆粉瓊脂、5毫升綿羊血和100毫升去離子水。

說明書

(一)技術領域

本發明涉及一種牛羊腸毒血癥的D型產氣莢膜梭菌類毒素疫苗的制備方法。

(二)發明背景

產氣莢膜梭菌是人、畜消化道的正常菌群,廣泛分布于自然界中,該菌能產生多種外毒素,目前已發現的外毒素達12種,其中α、β、ε和ι是主要的致死性毒素也是分型毒素,根據這四種毒素,產氣莢膜梭菌分為A、B、C、D和E五個毒素型,每個毒素型均能感染人或畜禽引起特定的疾病。D型菌主要產生α、ε外毒素,能引起羔羊、綿羊、山羊、牛以及灰鼠等動物的腸毒血癥。近年來黑龍江、青海、云南、寧夏等地均有D型菌導致牛腸毒血癥的報道,成年牛和犢牛均有發生。除了感染畜禽外,D型菌引起國家珍稀動物腸毒血癥例如上海動物園的國家二級保護動物青鹿的死亡。該病發病一般比較急、死亡率高、危害極大,要從根本上控制本病的傳播,減少或避免給畜牧業生產帶來的巨大經濟損失,必須采取切實有效地預防措施。Mueller(1988)指出:“魏氏梭菌致病是由于它們形成分泌的毒素和代謝產物,無毒素產生就不會出現臨床癥狀”;柴同杰(1999,2001)也提出同樣的觀點即產氣莢膜梭菌感染導致的猝死癥,是由于在某些應激條件下,這些病原菌在動物體內“爆炸性”繁殖,分泌產生的大量外毒素進入血液循環,導致腸源性毒血癥,對組織器官發生毒害作用,造成快速死亡。根據上述致病機理,疫苗的預防重點也應當放在針對毒素引起的毒血癥的免疫。應當在對魏氏梭菌外毒素研究的基礎上研制類毒素疫苗魏氏梭菌形成的主要外毒素的化學成分為蛋白質,具有較好的免疫原性。因此,根據魏氏梭菌的發病機理,制備D型魏氏梭菌毒素,將其滅活后做成類毒素疫苗,然后在此基礎上制備抗毒素血清,用于畜禽預防和治療,是能夠達到確實可靠的免疫和治療效果。

(三)發明內容

為了解決上述問題,本發明提供給了一種牛羊腸毒血癥的D型產氣莢膜梭菌類毒素疫苗的制備方法。

一種牛羊腸毒血癥的D型產氣莢膜梭菌類毒素疫苗的制備方法,具體步驟如下:

(1)將D型產氣莢膜梭菌菌種接種于5%綿羊血-1%葡萄糖-瓊脂平板上,37℃厭氧(厭氧環境氣體組成成分88%N2、7%H2、5%CO2)培養36小時復蘇;

(2)挑取復蘇后的單個菌落接種于硫乙醇酸鹽流體培養基FT45℃厭氧增菌10h;將FT增菌培養液按照接種量5%(體積比)接種厭氧肉肝湯,43℃厭氧培養6h;取厭氧肉肝湯菌液4℃10000r/min離心15min,蔡氏濾器過濾取上清得到毒素溶液;

(3)將毒素溶液用1MNaOH調pH至7.2,然后加入甲醛使毒素溶液中甲醛濃度達到0.3%,充分振蕩混勻,置37℃96h滅活,間隔5-6h振搖一次,即得類毒素溶液;

(4)將白油和Span-80按照94:6的體積比混合,再加入白油和Span-80混合液質量比2%的硬脂酸鋁溶化混勻,121℃高壓滅菌30分鐘即為油相;取類毒素溶液,加入Tween-80s使Tween-80s在類毒素溶液中濃度達到2%,混勻,即為水相;將油相與水相按體積比1:1的比例乳化,乳化液中加入硫柳汞使硫柳汞終濃度為0.01%,即得牛羊腸毒血癥的D型產氣莢膜梭菌類毒素疫苗類毒素疫苗。

所述5%綿羊血-1%葡萄糖-瓊脂平板成分為:1克葡萄糖、3.8克豆粉瓊脂、5毫升綿羊血和100毫升去離子水;

使用時,對牛羊肌肉注射,每半年免疫一次,每次4ml,可有效的防止牛羊腸毒血癥的發生。

有益效果

現在市場上預防牛羊腸毒血癥疫苗都是滅活的全菌苗,對該病的流行有一定的控制作用,但也存在一些不足,由于滅活時甲醛濃度大,家畜接種反應較重。而本發明根據該病的致病機理開發制備了效價全、免疫力強、針對性好、無毒副作用的D型產氣莢膜梭菌類毒素疫苗,用于動物的D型產氣莢膜梭菌病的預防,控制D型產氣莢膜梭菌病的流行

(四)具體實施方式

實施例1牛羊腸毒血癥的D型產氣莢膜梭菌類毒素疫苗制備

菌種的復蘇將D型產氣莢膜梭菌種(NationalCollectionofTypeCultures英國微生物菌種保藏中心保藏,保藏號:NCTC8346)接種于5%綿羊血-1%葡萄糖-瓊脂平板(1克葡萄糖、3.8克豆粉瓊脂、5毫升綿羊血和100毫升去離子水)上,37℃厭氧(厭氧環境氣體組成成分88%N2、7%H2、5%CO2)培養36小時復蘇;

細菌增菌挑取單個菌落接種于硫乙醇酸鹽流體培養基(FT,購自青島日水生物技術有限公司)45℃厭氧增菌10h后,取5mlFT增菌培養液加入到100ml厭氧肉肝湯(購自青島日水生物技術有限公司)43℃厭氧培養6h,得到厭氧肉肝湯菌液;

毒素的制備將厭氧肉肝湯菌液4℃10000r/min離心15min,再用孔徑0.22μm蔡氏濾器過濾取上清得到毒素溶液;

驗證毒素α、ε的存在使用間接酶聯免疫吸附實驗(ELISA)和聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)檢測外毒素中存在α、ε;

毒素的滅活將上述毒素溶液用1MNaOH調pH至7.2,然后加入甲醛使毒素溶液中甲醛濃度達到0.3%,充分振蕩混勻,置37℃96h滅活,間隔5-6h振搖一次,即得類毒素溶液;

類毒素疫苗的制備將白油和Span-80按照94:6的體積比混合,再在白油和Span-80混合液中加入質量比2%的硬脂酸鋁,使硬脂酸鋁終濃度為2%,溶化混勻,121℃高壓滅菌30分鐘即為油相;在類毒素溶液加入Tween-80s使Tween-80s終濃度達到2%,混勻,即為水相;將油相與水相按1:1的體積比乳化,在乳化液中加入硫柳汞使硫柳汞終濃度為0.01%,即得類毒素疫苗。

實施2牛羊腸毒血癥D型產氣莢膜梭菌類毒素疫苗效果檢驗

無菌檢驗硫乙醇酸鹽培養基(T.G)用于厭氧性及需氧性細菌檢驗;酪胨瓊脂(G.A)固體培養基用于需氧性細菌檢驗;葡萄糖蛋白胨湯(G.P)用于霉菌及腐生菌檢驗。類毒素脫毒過濾后,接種TG小管、GA斜面各兩支,每支0.2ml,一支置25℃培養,一支置于37℃培養,另取0.2ml接種1支GP小管置25℃培養。均培養7日,無菌生長(主要參照《中華人民共和國獸用生物制品質量標準》)

安全檢驗取1.5-2kg健康兔4只,分別肌肉接種5mlD型產氣莢膜梭菌類毒素疫苗,連續觀察10天。觀察無局部或全身異常反應(主要參照《中華人民共和國獸用生物制品質量標準》)

綿羊的最小致死量(MLD)測定取6-12月齡、30-40kg的綿羊8只,2只一組,用4ml、8ml、12ml、16ml本發明制備的D型產氣莢膜梭菌毒素溶液對綿羊進行靜脈注射,觀察24h.測的MLD為12ml。

免疫劑量確定取6-12月齡、30-40kg綿羊8只,每2只為一組(每組分別肌肉注射2ml、4ml、6ml、8mlD型產氣莢膜梭菌類毒素疫苗),21天后再均用一個MLD的產氣莢膜梭菌毒素溶液進行靜脈接種攻毒,觀察72h,記錄發病死亡情況。注射2ml的免疫組綿羊一只發病、一只死亡,4ml、6ml、8ml的免疫組綿羊無發病。因此免疫劑量為4ml。

效力檢驗用1-3歲的綿羊18只,分成3組,每組6只,其中每組的4只肌肉注射D型產氣莢膜梭菌類毒素疫苗4ml/只,另2只不注射疫苗作為對照。接種21天后,每組每只綿羊再注射1個MLD(12ml)的D型產氣莢膜梭菌毒素溶液。對照組的綿羊全部死亡,注射疫苗的綿羊死亡一只,其余全部存活。

類毒素疫苗的抗體消長規律取6-12月齡、30-40kg左右的綿羊(未進行過魏氏梭菌菌苗免疫)4只,三只各肌肉注射4ml制備的D型產氣莢膜梭菌類毒素疫苗,一只肌肉注射相同劑量的生理鹽水作為對照。分別于注射后1周、2周、3周、4周、5周、6周、7周、17周、20周、22周、24周對四只綿羊進行頸靜脈采血,應用間接ELISA試驗檢測其血清中的α、ε毒素抗體效價。根據測的抗體效價可知有效保護周期為6個月。

關于本文
本文標題:牛羊腸毒血癥的D型產氣莢膜梭菌類毒素疫苗的制備方法.pdf
鏈接地址:http://www.rgyfuv.icu/p-6973785.html
關于我們 - 網站聲明 - 網站地圖 - 資源地圖 - 友情鏈接 - 網站客服 - 聯系我們

[email protected] 2017-2018 zhuanlichaxun.net網站版權所有
經營許可證編號:粵ICP備17046363號-1 
 


收起
展開
山东11选5中奖结果走势图