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SRC和SRC家族激酶的NA/KATP酶特異性肽抑制劑/激活劑.pdf

關 鍵 詞:
SRC 家族 激酶 NA KATP 特異性 抑制劑 激活劑
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摘要
申請專利號:

CN201310382990.5

申請日:

20071031

公開號:

CN103463621B

公開日:

20160106

當前法律狀態:

有效性:

有效

法律詳情:
IPC分類號: A61K38/17,A61K38/10,A61P35/00,A61P13/12,A61P9/00,A61P9/10,A61P9/12,A61P9/04,C07K14/47,C07K7/08,G01N33/573 主分類號: A61K38/17,A61K38/10,A61P35/00,A61P13/12,A61P9/00,A61P9/10,A61P9/12,A61P9/04,C07K14/47,C07K7/08,G01N33/573
申請人: 托萊多大學
發明人: Z·謝,J·I·沙皮羅,J·田
地址: 美國俄亥俄
優先權: 60/855,482
專利代理機構: 中國國際貿易促進委員會專利商標事務所 代理人: 袁泉
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法律狀態
申請(專利)號:

CN201310382990.5

授權公告號:

法律狀態公告日:

法律狀態類型:

摘要

公開了調控Src和其下游信號傳導通路的方法,其包括Src和Na+/K+-ATP酶之間的結合。Na+/K+-ATP酶/Src復合體是強心類固醇如烏本苷的功能性受體。還公開了Src抑制劑或激活劑,其包括干擾Na/K-ATP酶和Src之間相互作用的Na+/K+-ATP酶或Src,通過不同于ATP類似物的機理發揮作用,并且是通路(Na+/K+-ATP酶)特異性的。

權利要求書

1.包含由圖20B所示序列[SEQIDNO:34]組成的肽的組合物。2.組合物,其包含:a)包含由SEQIDNO:34組成的肽;和b)第一種可檢測的部分,其中所述第一種可檢測的部分與該肽結合。3.鑒定影響Src調節肽與Src激酶結構域的結合的候選物的方法,包括如下步驟:a)提供測定系統,其包括以下中的至少一種:由Kd1[SEQIDNO:34]組成的肽,b)將所述測定系統與測試試劑在一定條件下接觸,除了存在測試試劑,所述系統提供了參考活性;和c)檢測測定系統的偏測試試劑活性,其中偏測試試劑活性和參考活性之間的差異將該測試試劑鑒定為候選物。4.藥學組合物,包含:一種或多種分離的肽,其刺激Na+/K+-ATP酶的信號傳導功能并且不抑制Na+/K+-ATP酶的離子泵功能,其中所述藥學組合物介導與癌細胞生長、心臟纖維質生成、膠原合成和尿毒癥心肌病中一種或多種有關的一種或多種信號傳導通路,并且其中所述一種或多種分離的肽包含由SEQIDNO:34的氨基酸序列組成的分離的Na+/K+-ATP酶結合肽(KD1)。5.由SEQIDNO:34的氨基酸序列構成的分離活性多肽。

說明書

本申請是申請日為2007年10月31日、申請號為200780043725.7、發明名稱為“Src和Src家族激酶的Na+/K+-ATP酶特異性肽抑制劑/激活劑”的發明專利申請的分案申請。

相關申請的交叉引用

本申請要求2006年10月31日提交的美國臨時申請號60/855,482的權益,將其公開內容引入本文作為參考。

關于聯邦政府資助的研究的申明

本發明在政府支持下做出并且根據國家心臟、肺和血液研究所(美國公共衛生部,健康和人類服務部)授予的美國國立衛生研究院項目HL-36573和HL-67963,政府在本發明中享有權利。

本發明的技術領域和工業實用性

所鑒定的肽可用作用于治療癌癥和其他疾病的治療劑和/或作為開發更好的治療劑的促進劑,在所述疾病中,Src和Src家族激酶或者高度升高或者在遺傳上和/或功能上被降低。這些疾病狀態包括但不限于,白血病、前列腺癌和乳腺癌、缺血/再灌注損傷、尿毒癥心肌病、高血壓、心臟纖維質生成和缺乏心肌收縮力。此外,如所鑒定的肽證實的,可能利用新發現的Na+/K+-ATP酶/Src受體復合體作為靶標用于開發新的受體激動劑和拮抗劑以及新的Src和Src家族激酶抑制劑和激活劑。

發明背景

強心類固醇(CTS)由一組特異結合Na+/K+-ATP酶的化學物質組成。它們包括植物來源的毛地黃藥物(如地高辛和烏本苷)和脊椎動物來源的糖苷配基(如蟾蜍靈和海蟾蜍靈)。最近的研究已經將烏本苷和海蟾蜍靈鑒定為內源類固醇,其產生和分泌受到多種生理和病理學刺激,包括人類中的血管緊張肽II和腎上腺素的調控。這些類固醇可以激活蛋白質激酶和調控細胞生長、基因表達、細胞內鈣和活性氧(ROS)濃度,從而在控制腎和心血管功能、保護缺血/再灌注損傷和刺激或抑制細胞生長中起重要作用。

Src家族激酶是52-62kDa膜結合的非受體酪氨酸激酶并且它們應答多種細胞外配體而參與幾種酪氨酸磷酸化相關的信號通路。例如,Src含有至少三個重要的蛋白質相互作用結構域。SH3結構域結合到聚脯氨酸基序并且SH2結構域與磷酸化的酪氨酸殘基相互作用。該激酶結構域與核苷酸反應并磷酸化底物。蛋白質配體與SH3或SH2結構域的結合可以激活Src。也報導結合Src的激酶結構域的蛋白質能夠調控Src活性。

Na+/K+-ATP酶——細胞鈉泵的分子機器,屬于在進化上遠古的酶家族,其將ATP的水解與膜離子轉運相偶聯。現在認為Na+/K+-ATP酶具有雙重功能。它不僅將Na+和K+泵穿過細胞膜,而且通過不同激活蛋白激酶將細胞外CTS信號傳遞到細胞內區室。

特別地,發明人發現Na+/K+-ATP酶與Src和Src家族激酶相互作用形成功能性受體。烏本苷與該受體的結合激活Src,其又磷酸化多種效應子,導致不同通路(包括Ras/Raf/ERKl/2和磷脂酶C/蛋白激酶C級聯)的裝配和激活以及細胞內Ca2+和細胞ROS產生的增加。這些信號通路的激活最終導致心臟和腎功能的改變,刺激細胞增殖和組織纖維質生成,保護組織抵抗缺血/再灌注損傷和抑制癌細胞生長。這些效應以組織/細胞特異性方式發生。

因為Src和Src家族激酶在細胞信號轉導中起重要作用,所以許多研究人員參與尋找激酶特異性和通路特異性抑制劑。迄今為止,已經開發了許多抑制劑,并且它們中的多數被開發為ATP類似物,其與ATP競爭對這些激酶的結合,導致對激酶活性的抑制。然而,缺乏通路特異性是當前的Src抑制劑的主要缺點。因為Src和Src家族激酶對于許多細胞功能是必須的,因此一般性抑制可以損害治療的總體益處。過去,這已經通過這些抑制劑在動物研究中的嚴重副作用所證實。此外,這些抑制劑中的一些顯示出對受體酪氨酸激酶的交叉活性。

強心類固醇已經被用作治療充血性心力衰竭和其他心臟病的藥物,因為它們增加細胞內Ca2+從而增加收縮力。然而,這些化學品不僅激活Na+/K+-ATP酶相關的細胞信號傳導通路,而且抑制Na+/K+-ATP酶的離子泵功能。后者促進了它們的臨床副作用并且限制了這些藥物的臨床應用。內源強心類固醇是調控腎臟和心血管功能的激素。已知這些激素對新發現的Na+/K+-ATP酶/Src的過度刺激引起高血壓并在腎臟上皮細胞中誘導異常細胞增殖以及誘導組織纖維質生成。

考慮到上述問題,清楚的是本領域中仍然需要開發通路(例如,Na+/K+-ATP酶)特異性Src抑制劑或激活劑的方法,所述抑制劑或激活劑可以用于阻斷內源CTS激活的Src通路或者刺激Na+/K+-ATP酶相關的Src以模擬CTS效應而不抑制Na+/K+-ATP酶的離子泵功能。此外,需要靶向新發現的Na+/K+-ATP酶/Src受體復合體以開發該受體的新型激動劑或拮抗劑,從而使得Na+/K+-ATP酶/Src復合體的受體功能可以被刺激以治療疾病,如充血性心力衰竭和缺血/再灌注損傷,或者被抑制以治療疾病,如組織纖維質生成和癌癥。

還需要監測Src與Na+/K+-ATP酶的相互作用和激酶酶促活性的測定法,所述測定法是靈敏的、容易使用,并且適應于高通量篩選方法。

還需要分離參與蛋白質-蛋白質相互作用的操作上確定的配體和最佳地鑒定一組詳盡的參與配體結合的含有模塊結構域的蛋白質的方法。

然而,如果這種方法可以得到,這種方法將可用于分離具有任何目的功能結構域的功能形式的任何多肽。

此類一般性方法將具有巨大的實用性,因為可以鑒定相關蛋白的完整家族,其中每個蛋白具有其自身形式的目的功能結構域。此類相關蛋白質的知識將為我們理解多種生理學過程貢獻巨大,所述生理學過程包括細胞生長或死亡、惡性腫瘤、腎臟/心血管功能和免疫反應,等等。

此類方法將也促進開發更有效的具有更少副作用的治療劑、診斷劑或預防劑。

根據本發明,提供了這樣的方法。

發明概述

一方面,本文提供了調控Src及其下游信號傳導通路的方法,其包括Src和Na+/K+-ATP酶之間的結合。

另一方面,本文提供了誘導烏本苷引起的信號轉導的受體,其包含Na+/K+-ATP酶/Src或Src家族激酶的復合體。

另一方面,本文提供了靶標,其包含Na+/K+-ATP酶和Src或Src家族激酶之間的相互作用位點。

另一方面,本文提供了藥物組合物,其用于調控涉及控制細胞生長、運動性、活性氧類別(ROS)的產生、por-膠原合成和肌肉收縮的多種信號傳導通路,所述組合物包含一種或多種Src和Src家族激酶抑制劑或激活劑。在一些實施方案中,該組合物包含一種或多種肽或肽片段,其抑制或刺激Na+/K+-ATP酶的信號傳導功能并且不抑制Na+/K+-ATP酶的離子泵功能。而且,在一些實施方案中,所述抑制劑不直接與ATP競爭。

另一方面,本文提供了包含Na+/K+-ATP酶或Src序列的Src抑制劑或激活劑,其干擾Src和Na+/K+-ATP酶之間的相互作用,通過與ATP類似物不同的機理發揮作用,并且是通路(Na+/K+-ATP酶)特異性的。

另一方面,本文提供了治療組合物,其包含至少一種如本文所述的肽Src抑制劑或激活劑。

另一方面,本文提供了開發小分子的方法,所述小分子模擬肽抑制劑或激活劑,通過與ATP類似物不同的機理發揮作用,并且是通路(Na+/K+-ATP酶)特異性的。

另一方面,本文提供了包含Na+/K+-ATP酶的信號轉導物,其介導與癌細胞生長、心臟纖維質生成、缺血/再灌注損傷、肌肉收縮或尿毒癥心肌病有關的一種或多種信號傳導通路。

另一方面,本文提供了包含在Src或Na+/K+-ATP酶α1亞基中發現的功能結構域的組合物,其中Na+/K+-ATP酶介導的對Src的抑制是由于所述α亞基或其他P型ATP酶的α亞基的N結構域和Src激酶結構域之間的相互作用。

另一方面,本文提供了包含ND1肽,或其片段的組合物。

另一方面,本文提供了來自ND1的肽,其足夠結合Src以及其他Src家族激酶,包括但不限于Lyn,和抑制它們的活性。

另一方面,本文提供了來自Src激酶結構域(KDl)或來自其他Src家族激酶的類似結構域的肽,其能夠與Na+/K+-ATP酶結合并通過競爭Src的結合基序而有效激活Na+/K+-ATP酶抑制的Src。

另一方面,本文提供了用于激活或抑制Na+/K+-ATP酶通路特異性Src或Src家族激酶的肽。

另一方面,本文提供了包含肽或其片段的Src抑制劑和/或激活劑,所述肽或其片段靶向i)與Na+/K+-ATP酶或者Src特異相互作用而不是競爭ATP結合,和ii)提供Src活性的通路特異性調節的區域。

另一方面,本文提供了各Src家族激酶的同種型特異性Src抑制劑和/或激活劑,所述激酶包括具有序列或其片段的激酶,其中使用也結合該激酶結構域的Na+/K+-ATP酶的一個或多個α亞基開發所述序列或其片段。

另一方面,本文提供了小分子,其包含如本文所述的同種型特異性Src抑制劑和/或激活劑。

另一方面,本文提供了用于大規模和高通量篩選的快速篩選測定法,其包含Na+/K+-ATP酶和至少一種Src或Src家族激酶之間的相互作用。

另一方面,本文提供了治療蛋白激酶相關的疾病狀態的方法,該方法包括對需要其的受試者施用治療有效量的至少一種如本文所述的組合物。

另一方面,本文提供了方法,其中所述疾病狀態涉及使用Src或Src家族激酶作為效應物的非受體酪氨酸激酶或者受體酪氨酸激酶。

另一方面,本文提供了方法,其中所述疾病狀態涉及包括Src的細胞酪氨酸激酶。

另一方面,本文提供了方法,其中所述疾病狀態包括癌癥或者腎臟或心血管相關的疾病。

另一方面,本文提供了物質的組合物,其包含:a)具有5到50個氨基酸長度的肽,該肽包含選自任一種如本文所述的肽序列的基序和b)第一種可檢測的部分,其中所述第一種可檢測的部分與該肽結合。

另一方面,本文提供了組合物,其包含圖19B中所示的序列[SEQIDNO1]或者基于該序列開發。

另一方面,本文提供了組合物,其包含圖20B中所示的序列[SEQIDNO34]或者基于該序列開發。

另一方面,本文提供了組合物,其包含圖24A中所示的肽序列[SEQIDNO2]或者基于該肽序列開發。

另一方面,本文提供了組合物,其包含Na+/K+-ATP酶和Src或Src家族激酶之間相互作用的結構信息或者基于該信息開發。

另一方面,本文提供了小分子Src抑制劑或激活劑,其被開發以靶向Na+/K+-ATP酶和Src或Src家族激酶之間的相互作用或基于該相互作用開發。

另一方面,本文提供了Src抑制劑或激活劑,其基于NA+/K+-ATP酶或其他P-ATP酶和Src或Src家族激酶之間的相互作用開發。

另一方面,本文提供了開發鑒定的Na+/K+-ATP酶/Src受體復合體的激動劑或拮抗劑的方法。

另一方面,本文提供了組合物,其包含基于Na+/K+-ATP酶/Src復合體開發的激動劑或拮抗劑。

另一方面,本文提供了治療組合物,其包含至少一種如本文所述的激動劑或拮抗劑。

另一方面,本文提供了在培養的細胞中操作細胞Na+/K+-ATP酶的方法,其包括用A4siRNA表達載體轉染細胞,從而降低克隆的細胞中Na/K-ATP酶的表達。

另一方面,本文提供了至少部分沉默培養的細胞中內源α1的表達的方法,其包括用A4siRNA表達載體轉染細胞,從而降低克隆的細胞中α1的表達。

另一方面,本文提供了耗盡內源Na+/K+-ATP酶而不需要使用烏本苷以迫使表達轉染的Na+/K+-ATP酶的方法,其包括使用A4siRNA以沉默來自希望的物種(包括人和豬)的細胞中的α1表達。

另一方面,本文提供了包含GST-NT(氨基酸殘基6-90)[SEQIDNO51]的表達載體。

另一方面,本文提供了包含GST-CD2(氨基酸殘基152-288)[SEQIDNO52]的表達載體。

另一方面,本文提供了包含GST-CD3(氨基酸殘基350-785)[SEQIDNO53]的表達載體。

另一方面,本文提供了包含GST-H+/K+-CD3[SEQIDNO54]的構建體。

另一方面,本文提供了包含GST-SERCA-CD3[SEQIDNO55]的構建體。

另一方面,本文提供了基于siRNA的測定法,其經配置以測定Na+/K+-ATP酶的量和性質的改變對基礎的和烏本苷刺激的Src活性的影響。

另一方面,本文提供了用于測定外源的/突變的α1的信號傳導功能的α1耗盡細胞,該細胞通過用α1表達載體轉染敲減(knockdown)的細胞來制備,所述載體中A4siRNA靶向的序列被沉默突變,其中外源α1被敲入并且α1的表達被恢復,不僅總的細胞Na+/K+-ATP酶蛋白,而且Na+/K+-ATP酶活性都被恢復。

當按照附圖閱讀時,根據下面優選實施方案的詳述,本發明的多種目標和優點將對于本領域技術人員變得顯而易見。

附圖簡述

圖1A和B.LLC-PK1細胞中Na+/K+-ATP酶和Src之間的相互作用。

圖1A.在1024X1024像素分辨率下,LLC-PKl細胞中Na+/K+-ATP酶(紅色)和Src(綠色)的共定位。左邊和中間的圖像分別顯示了Na+/K+-ATP酶α1和Src的膜定位,合并的圖像(右邊)顯示了這兩種蛋白質的共定位。比例尺:20μm。

圖1B.LLC-PKl細胞中EYFP-大鼠α1(黃色)和Src-ECFP(青色)之間相互作用的熒光共振能量轉移(FRET)分析。加方框的區域(ROI1)被光漂白并且就FRET進行分析。發明人也測量了沒有被光漂白的環形區域(ROI2)處的FRET。在來自6個獨立實驗的16個細胞中進行了相同的實驗。比例尺:8μm。

圖2A-D.純化的豬腎Na+/K+-ATP酶(PKE)與GST-Src的結合。將純化的Na+/K+-ATP酶溶解在1%TritonX-100中。以100,000Xg離心后,將所示量的澄清的上清液與5μgGST-Src在0.5%TritonX-100存在下溫育30分鐘,接著用相同緩沖液洗滌四次。

圖2A和2B.考馬斯藍染色的GST-Src和純化的Na+/K+-ATP酶(PKE)。

圖2C.來自三個獨立實驗的代表性蛋白質印跡,顯示了用抗Na+/K+-ATP酶α1抗體檢測的pulldown產物。

圖2D.進行與C中相同的pulldown測定法并將650ng(總輸入的三分之一)純化的Na+/K+-ATP酶(PKE)酶直接作為輸入對照裝載。

圖3A-C.鑒定涉及與Na+/K+-ATP酶相互作用的Src結構域:

圖3A.Src結構的圖示。

圖3B.GST-Src、GST-SH2、GST-SH3、GST-SH3SH2和GST激酶的考馬斯藍染色。

圖3C.GST-Src、GST-SH3SH2、GST-激酶、GST-SH2,但非GST-SH3結構域與Na+/K+-ATP酶的結合。純化的Na+/K+-ATP酶的等分試樣(2μg)用于每個結合測定法。相同的實驗重復三次。

圖4A-D.鑒定涉及與Src相互作用的Na+/K+-ATP酶結構域:

圖4A.Na+/K+-ATP酶的α1亞基的圖示。NT,N-末端;CD2,胞質結構域2;CD3,胞質結構域3;PD,磷酸化結構域;ND,核苷酸結合結構域;CT,C-末端。

圖4B.四個獨立實驗的代表性蛋白質印跡顯示了當使用200ngSrc時,純化的Src(缺少前84個氨基酸)與CD3結合,但是不與α1亞基的NT結合。

圖4C.蛋白質印跡,顯示Src被Na+/K+-ATP酶(Na/K)和NA+/K+-ATP酶(H/K)的GST-CD3拉下(pulldown)但是沒有被來自1mgLLC-PK1細胞裂解物的SERCA拉下。

圖4D.蛋白質印跡,顯示了Na+/K+-ATP酶和Src之間的結構域相互作用。將不同的GST-融合的Na+/K+-ATP酶結構域構建體與Src的His標記的SH3SH2結構域或激酶結構域溫育,并通過蛋白質印跡分析pulldown產物。

圖5A-B.Na+/K+-ATP酶和GST-CD3對Src的調控:

圖5A.將所示量的純化的Na+/K+-ATP酶(PKE)與重組Src(4.5U)在PBS中溫育30分鐘,然后加入2mMATP/Mg2+并另外溫育5分鐘。樣品在SDS-PAGE上分離后,用如所示的抗體探測膜。*與對照相比p<0.05;**與對照相比p<0.01。

圖5B.將GST(100ng)或不同量的GST-CD3與重組Src(4.5U)在PBS中溫育30分鐘。如A中分析Src的磷酸化。值為至少四次獨立實驗的平均值±SE。*與對照相比p<0.05。

圖6A-C.通過烏本苷刺激Na+/K+-ATP酶/Src復合體:

圖6A.將預先形成的Na+/K+-ATP酶/Src復合體與不同濃度的烏本苷在2mMATP/Mg2+存在下處理5分鐘,并使用如所示的位點特異性抗體分析磷酸化的Src。值為至少四次獨立實驗的平均值±SE。**與對照相比p<0.01。

圖6B.用10μM烏本苷處理Src或Src/Na+/K+-ATP酶復合體,并測量Src活性。**與對照相比p<0.01。

圖6C.四次實驗的代表性蛋白質印跡,顯示了烏本苷和釩酸鹽對Na+/K+-ATP酶/Src復合體的影響。重復與A中相似的實驗以評估釩酸鹽(Van)或釩酸鹽加烏本苷(Oua)對Src磷酸化的影響。

圖7A-D.通過從Na+/K+-ATP酶釋放激酶結構域激活Src:

圖7A.對照實驗,顯示了Src可以與Na+/K+-ATP酶共同沉淀。在0.5mlPBS中用或不用5μgNa+/K+-ATP酶溫育的Src(4.5U)以100,000Xg離心30分鐘。將沉淀重懸浮在PBS中并進行如材料和方法中所述的磷酸化測定。作為輸入對照,將4.5USrc直接懸浮在PBS中并測定pY418磷酸化。**p<0.01。

圖7B.在PBS中將Src(4.5U)與5μg純化的Na+/K+-ATP酶預溫育然后暴露于10μM烏本苷15分鐘。然后通過離心收集對照處理的和烏本苷處理的Na+/K+-ATP酶/Src復合體,重懸浮在PBS中,并將其進行如A中的磷酸化測定。兩個代表性蛋白質印跡在A和B中顯示,值為至少三次獨立實驗的平均值±SE。**p<0.01。

圖7C.四次單獨實驗的代表性蛋白質印跡,顯示了烏本苷誘導激酶結構域從Na+/K+-ATP酶的釋放。將GST-Src、GST-SH3SH2或GST-激酶在室溫下于500μlPBS中與1μg純化的Na+/K+-ATP酶溫育30分鐘。然后在谷胱甘肽珠上拉下(pulldown)復合體,洗滌三次,重懸浮在500μlPBS中,并暴露于10μM烏本苷15分鐘。隨后將小珠用PBS再洗滌三次,用抗-α1抗體通過蛋白質印跡分析拉下(pulldown)的Na+/K+-ATP酶。

圖7D.三次獨立實驗的代表性蛋白質印跡,顯示了GST-激酶結構域融合蛋白對Src的激活。將GST、GST-SH3SH2或GST-激酶(各5μg)與2μg純化的Na+/K+-ATP酶在室溫下預溫育15分鐘。然后向混合物加入重組Src(4.5U)溫育額外的30分鐘。通過加入2mMATP/Mg2+開始磷酸化反應并如A中測量SrcpY418。

圖8A-C.烏本苷在活細胞中從Na+/K+-ATP酶解離Src激酶結構域:

圖8A.LLC-PK1細胞中烏本苷誘導的FRET信號改變的代表性跡線。

圖8B.用Src-Rluc和GFP-α1共轉染293T細胞。用Rluc-GFP融合蛋白轉染的293T細胞用作陽性對照,并將Rluc和GFP-Na+/K+-ATP酶共轉染的細胞用作陰性對照。

圖8C.烏本苷處理以依賴劑量的方式降低GFP-Na+/K+-ATP酶和Src-Rluc之間的BRET信號。值為至少四次實驗的平均值±SE。*p<0.05;**p<0.01。

圖9A-D.烏本苷-激活的Na+/K+-ATP酶/Src磷酸化并募集下游效應物;

圖9A.用1μM烏本苷處理LLC-PK1細胞5分鐘,并用抗-α1抗體免疫沉淀細胞裂解物并分析酪氨酸磷酸化的蛋白質。

圖9B.用100μM烏本苷處理SYF和SYF+Src細胞5分鐘并如A中進行分析。在A和B中顯示了三次實驗的代表性蛋白質印跡。

圖9C.對Src的抑制阻斷了烏本苷誘導的Src向Na+/K+-ATP酶信號復合體的募集。將LLC-PK1細胞用1μMPP2或PP3預處理15分鐘,然后暴露于1μM烏本苷5分鐘。免疫沉淀并分析細胞裂解物。值為至少四次獨立實驗的平均值±SE。*p<0.05。

圖9D.在2mMATP存在或不存在下,如以前所述的(Wang等人,2004)分離胞膜窖并用100nM烏本苷處理5分鐘。之后,胞膜窖在RIPA緩沖液中裂解,并通過離心使裂解物澄清并用抗窖蛋白-1抗體免疫沉淀。通過蛋白質印跡用α1、Src、和窖蛋白-1探測免疫沉淀物。顯示了三個獨立實驗的代表性蛋白質印跡。

圖10.圖示顯示了所鑒定的Na+/K+-ATP酶和Src(A)之間的相互作用和烏本苷怎樣調控Na+/K+-ATP酶/Src受體復合體(B)。

圖11A-B.通過siRNA對內源Na+/K+-ATP酶的沉默:

圖11A.通過SDS-PAGE分離來自不同細胞系的總細胞裂解物(30μg/泳道)并通過蛋白質印跡分析Na+/K+-ATP酶的α1亞基的表達。顯示了代表性蛋白質印跡(見表2中的定量數據)。

圖11B.混合P-11和PY-17細胞,共同培養24小時,然后如“實驗步驟”中所述的用抗-α1抗體(克隆C464.6)免疫染色。比例尺代表50μm。

圖12A-B.AAC-19細胞中Na+/K+-ATP酶的表達。

圖12A.如“實驗步驟”中所述的用表達大鼠α1的載體轉染PY-17細胞產生克隆AAC-19。通過SDS-PAGE分離細胞裂解物(來自P-11和AAC-19的15μg和來自PY-17的60μg)并通過蛋白質印跡分析。印跡首先用識別豬和大鼠α1亞基的抗體α6F探測,然后剝離,用與大鼠α1特異反應的抗NASE再次探測。

圖12B.混合P-11和AAC-19細胞,共同培養24小時,然后如“實驗步驟”中所述的用抗-α1抗體(克隆C464.6)免疫染色。比例尺代表50μm。

圖13.烏本苷(oua)對Na+/K+-ATP酶活性的濃度依賴性作用。如“實驗步驟”中所述的從P-11和AAC-19細胞制備全細胞裂解物并測定Na+/K+-ATP酶活性。數據顯示為對照的百分比,并且每個點表示為四次獨立實驗的平均值±S.E.。用GraphPad軟件進行曲線擬合分析。

圖14A-C.Na+/K+-ATP酶對Src活性的調控:

圖14A和14B-通過SDS-PAGE分離來自不同細胞系的細胞裂解物(30μg/泳道)并通過抗-c-Src(B-12)或抗-Tyr(P)418-Src抗體分析。定量數據是來自四次獨立實驗的平均值±S.E.。*,相當于對P-11的p<0.05。

圖14C.使培養的P-11和TCN23-19細胞血清饑餓12h并使用抗-Tyr(P)418-Src抗體免疫染色。如“實驗步驟”中所述的收集圖像。比例尺代表50μm。

圖15A-D.無泵的Na+/K+-ATP酶對Src活性的調控:

圖15A和15B.通過SDS-PAGE分離來自不同細胞系的細胞裂解物(30μg/泳道)并通過抗-c-Src(B-12)或抗-Tyr(P)418-Src抗體分析。定量數據是來自四次獨立實驗的平均值±S.E.。*,相當于對P-11的p<0.05。

圖15C.PY-17細胞用空載體(模擬物)、沉默突變的野生型大鼠α1(AAC)或D371E突變體瞬時轉染PY-17細胞。36h后,如所述的裂解轉染的細胞并通過蛋白質印跡分析。顯示了代表性蛋白質印跡,相同的實驗重復四次。

圖15D.用表達EYFP-融合的α1D371E突變體的載體(pEYFP-D371E)瞬時轉染TCN23-19細胞。24h后,使細胞血清饑餓12h并使用抗-Tyr(P)418-Src抗體免疫染色。來自代表性實驗的圖像表明突變pEYFP-D371E的表達降低了紅色(Tyr(P)418-Src)熒光的強度(與綠色和附近的非綠色細胞相比)。收集四次獨立實驗中來自40個不同顯微鏡視野的Tyr(P)418-Src的定量數據并表示為平均值±S.E.**,p<0.01。比例尺代表22μm;W/O,無。

圖16A-B.Src和無泵Na+/K+-ATP酶之間的相互作用:

圖16A和16B.用Src-ECFP和EYFP-大鼠α1突變體(D371E)表達載體共轉染TCN23-19細胞。24h后,如“實驗步驟”中所述的進行FRET分析。將加框的ROI_1(綠色)光漂白,并分析ROI_3(黃色)膜區域的FRET。選擇加框的ROI_2(紫色)并用作非漂白對照。重復實驗三次,并分析總共20個細胞。

圖16C.如A中用沉默突變的野生型大鼠α1(AAC)或大鼠α1無泵突變體(D371E)表達載體瞬時轉染TCN23-19細胞。36h后,制備細胞裂解物并用單克隆的抗-Src(克隆GD11)抗體進行免疫沉淀。使用抗-NASE抗體(對于大鼠α1)或抗-c-Src(SRC2)抗體通過蛋白質印跡分析免疫沉淀物。相同的實驗重復三次,并顯示了代表性蛋白質印跡。IP,免疫沉淀。

圖17A-E.通過Src-相互作用的Na+/K+-ATP酶對FAK磷酸化的調控:

圖17A.使培養的P-11和PY-17細胞血清饑餓12小時。然后用抗磷酸酪氨酸抗體(4G10)免疫沉淀細胞裂解物,并通過抗-FAK抗體分析免疫沉淀物。合并的定量數據來自三個獨立的實驗。

圖17B.通過SDS-PAGE分析來自不同細胞系的細胞裂解物并通過抗-Tyr(P)925-FAK和抗-Tyr(P)418-Src抗體分析。剝離相同的膜并用抗c-Src(B-12)抗體再次探測。顯示了三個獨立實驗的代表性印跡。

圖17C.通過抗-pERKl/2或抗-ERKl/2抗體分析細胞裂解物。從四個獨立實驗計算定量數據(平均值±S.E.)作為pERK/ERK的相對比例。

圖17D.用1μMPP2處理P-11和PY-17細胞0.5和2小時。通過使用特異性抗體測量FAK和Src激活。顯示了代表性蛋白質印跡,相同的實驗重復三次。

圖17E.用空載體(模擬物)或D371E突變體瞬時轉染PY-17細胞。36小時后,裂解轉染的細胞并如所示用特異性抗體通過蛋白質印跡分析。顯示了代表性蛋白質印跡,相同的實驗重復三次。IP,免疫沉淀物;IB,免疫印跡。*,相對于P-11的p<0.05。

圖18A-D.烏本苷對Src和ERKl/2的作用:

圖18A和18B.將細胞暴露于100nM烏本苷5或15分鐘,并通過蛋白質印跡分析細胞裂解物(50μg/泳道)的活性Src或活性ERK1/2。印跡首先用抗-Tyr(P)418-Src或抗-pERK抗體探測,然后剝離,并再次探測總的Src或ERK1/2以確保相等上樣。

圖18C和18D.細胞用所示濃度的烏本苷處理5分鐘,如圖18A和18B對總的細胞裂解物分析Tyr(P)418-Src和總的Src或pERKl/2和總的ERKl/2。顯示了代表性蛋白質印跡和組合的定量數據。相對于P-11細胞的對照條件計算來自三個獨立實驗的定量數據(pSrc/Src或pERK/ERK的相對比例)(平均值±S.E.)。*,相對于每種細胞系的各自對照條件,p<0.05,con,對照。

圖19.與Src相互作用并抑制Src的Na+/K+-ATP酶中特定結構域的進一步作圖:

圖19A.Na+/K+-ATP酶α1和CD3結構域圖解。

圖19B.NDl的氨基酸序列[SEQIDNO1]

[LTQNRMTVAHMWSDNQIHEADTTENQSGVSFDKTSATWLALSRIAGLCNRAVFQANQ].

圖19C.使用GST-標記的α1截短和His-Src的體外結合測定法。

圖19D.序列,顯示了ND1肽在不同物種和Na/K-ATP酶的不同同種型中是保守的(顯示了部分序列并且全長序列可以根據提供的檢索號[SEQIDNO:2-33]從SwissProt數據庫得到。

圖20A-C.與Na+/K+-ATP酶相互作用的Src中特定結構域的進一步作圖:

圖20A.Src和它的激酶結構域的示意性結構。

圖20B.KDl的氨基酸序列[SEQID:34]

[LRLEvKLGQGcFGEvwMGTwNGTTRvAIKTLKpGTMspEAFLQEAQvMKKLRHE].

圖20C.使用GST標記的Src截短和純化的Na+/K+-ATP酶的體外結合測定法。

圖21.活性測定證實NDl和KDl涉及Src的Na+/K+-ATP酶介導的調控。

圖22A-B.NDl在活細胞中有效阻斷Src活性。

圖22A.用YFP-標記的NDl、ND和CD3瞬時轉染LLC-PK1細胞24小時。

圖22B.來自三次獨立實驗的定量數據。*p<0.05。

圖23.YFP-NDl抑制人前列腺癌細胞(DU145)生長。

圖24.來自ND1的抑制Src的20個氨基酸的肽(P-3)的作圖。

圖24A.P-3的肽序列[SEQID2]

[SATWLALSRIAGLCNRAVFQ]。

圖24B.當將純化的Src與P-3肽在37℃溫育20分鐘并加入2mMATP后溫育額外的5分鐘時得到的結果。

圖25.表1-人Na+/K+-ATP酶-α1亞基特異性siRNA的靶標和寡核苷酸序列,其中通過粗體字母標記靶序列。[SEQIDNO.35-46]。(見圖25-表4)。

圖26.表2-用于不同細胞系的DNA構建體的相對α1亞基蛋白質含量和組成。

圖27.表3-不同細胞系中的Na+/K+-ATP酶活性。

圖28.肽penetratin(TAT)和antennapedia(AP)的螺旋的序列[SEQIDNO47,48]。

圖29.TAT-P3和AP-P3抑制Src并阻斷DU145細胞生長。

圖29A.顯示了TAT或AP標記的Src肽抑制劑(TAT-P3或AP-P3)的序列[SEQIDNO49,50]。

圖29B顯示了新肽在體外抑制Src。

圖29C顯示FITC-綴合的TAT-P3靶向細胞膜。

圖29D顯示向DU145細胞加入TAT-P3或AP-P3抑制了細胞生長。

圖30A-B顯示了具有SEQIDNO1-55的表。

優選實施方案詳述

Src和Src家族激酶是非受體酪氨酸激酶,其在涉及控制細胞生長、運動和肌肉收縮的多種信號傳導通路的調控中起重要作用。此外,我們最近的研究已經表明通過強心類固醇對Na/K-ATP酶-結合的Src的激活保護心臟免于缺血/再灌注損失。它還抑制癌細胞生長和刺激成纖維細胞中的膠原合成。因為Src家族激酶在許多類型的癌癥中具有高活性,所以制藥公司對于開發特異性Src和Src家族激酶抑制劑感興趣。多數開發的抑制劑是直接與ATP競爭的ATP類似物。

一方面,本發明涉及肽Src抑制劑,其包括結合并抑制Src的Na+/K+-ATP酶。肽抑制劑不僅通過不同于ATP類似物的機理發揮作用,而且是通路(Na+/K+-ATP酶)特異性的。從而,這些肽可以用于開發癌癥和其他疾病的有效治療劑,在所述癌癥和其他疾病中Src或Na+/K+-ATP酶/Src活性是異常的。此外,本發明涉及包括Src片段的肽Src激活劑,其結合并阻止Na+/K+-ATP酶對Src的抑制。像強心類固醇一樣,這些肽激活劑可以激活Na+/K+-ATP酶結合的Src。與強心類固醇相比,它們不抑制Na+/K+-ATP酶的泵功能。從而,這些激活劑用于開發充血性心力衰竭、局部缺血/再灌注損失(例如,心肌梗塞)和其中Src或Na+/K+-ATP酶/Src活性異常的其他疾病的有效治療劑。

強心類固醇如烏本苷激活Src,導致許多不同類型細胞中的蛋白質酪氨酸磷酸化。發明人現在已經發現Src和Na+/K+-ATP酶通過多個結構域相互作用以形成功能性受體復合體。該相互作用有效保持Src處于失活狀態,表明Na+/K+-ATP酶是有效的Src抑制劑。

因為Na+/K+-ATP酶作為新發現的信號轉導物,介導若干信號通路,所述通路涉及癌細胞生長、心臟纖維質生成、缺血/再灌注損失和尿毒癥心肌病,本發明人現在已經發現Na+/K+-ATP酶和Src之間此類相互作用的干擾提供了這些疾病的有用的治療信息。

Src和Na+/K+-ATP酶α1亞基中功能結構域的詳細作圖揭示Na+/K+-ATP酶介導的對Src的抑制是由于α亞基的N結構域,特別是ND1肽和Src激酶結構域,特別是KD1肽之間的相互作用。

進一步分析揭示來自ND1的20個氨基酸的肽(P-3)足夠結合并抑制Src活性以及其他Src家族激酶,如Lyn。此外,當細胞穿透肽(例如,TAT或AP)附著到Src抑制性肽時,該新的肽完全能夠進入細胞并抑制細胞Src活性。當在前列腺癌DU145細胞中測試時,這些標記的肽抑制劑有效阻斷DU145細胞增殖。發明人還發現來自Src激酶結構域的KD1可以結合Na+/K+-ATP酶并且通過與結合基序競爭Src而有效激活Na+/K+-ATP酶-抑制的Src。

從而,發明人已經開發了可用于激活或抑制Na+/K+-ATP酶通路特異性Src或Src家族激酶的肽。此外,發明人已經鑒定了相互作用位點(即,α亞基的ND1和Src的KD1之間),其可以用作開發其他肽和小分子抑制劑或激活劑的靶標,所述小分子抑制劑或激活劑是更有效的、組織特異性的或者具有更高的藥效學或藥物代謝動力學性質。

另一方面,所述肽代表新類別的Src抑制劑和/或激活劑。因為這些肽靶向與Na+/K+-ATP酶特異相互作用而不是一般性競爭ATP結合的區域,所以它們更特異并且具有與受體酪氨酸激酶更小的交叉反應性。此外,這些肽提供了Src活性的通路特異性調節,從而被更狹窄(特異)地靶向。此外,結構-功能研究將產生各Src家族激酶的更有效和特異的抑制劑/激活劑,因為每種激酶具有不同的KD1序列。因為Na+/K+-ATP酶的其他α亞基也結合激酶結構域,所以可以開發同種型特異性Src抑制劑。最后,使用該結構信息,現在可能開發具有更好的藥效學和藥物代謝動力學性質的小分子。

Src抑制劑肽的基于序列的分析或者所鑒定的相互作用結構域的結晶可以揭示Src和Na+/K+-ATP酶之間的精確界面,這將允許開發抑制或激活Src的新肽或小分子。使用所鑒定的相互作用(Na+/K+-ATP酶/Src相互作用或α亞基N結構域/Src激酶結構域相互作用),可以開發快速篩選測定法用于大規模和高通量篩選其他的肽和小分子。可以用遺傳方法或化學品或激素上調或下調細胞的Na+/K+-ATP酶,從而抑制或激活細胞Src或Src家族激酶。

另一方面,所發現的Na+/K+-ATP酶/Src受體復合體作為開發該受體的新的激動劑和拮抗劑的靶標。

實施例1

Src與Na+/K+-ATP酶的結合形成功能性信號傳導復合體

Na+/K+-ATP酶與Src相互作用從而形成功能性信號傳導復合物

材料和方法

從Calbiochem(SanDiego,CA)得到一種Src激酶抑制劑PP2。從NewEnglandNuclear(Boston,MA)得到[γ-32P]ATP。使用的抗體和它們的來源如下:單克隆抗磷酸酪氨酸抗體(PY99)、單克隆抗-Src抗體(B12)、山羊抗兔和山羊抗小鼠二級抗體從SantaCruzBiotechnology(SantaCruz,CA)得到。多克隆的抗-SrcpY418抗體和抗-SrcpY529來自BiosourceInternational(Camarillo,CA)。單克隆抗His抗體來自Invitrogen(Carlsbad,CA)。純化的重組Src和用于測定Src激酶活性的測定試劑盒、抗磷酸酪氨酸抗體和G蛋白瓊脂糖得自UpstateBiotechnology(LakePlacid,NY)。質粒pGFP2-C、pRluc-N和DeepBlueC購自BiosignalPackard(Montreal,Canada)。質粒pEYFP-Cl和pECFP-Nl購自Clontech(PaloAlto,CA),pGEX-4T-l和pTrc-His來自Invitrogen。所有二級抗體都綴合到辣根過氧化物酶;因此,使用化學發光對免疫反應性帶顯色(Pierce,Rockford,IL)。谷胱甘肽珠來自AmershamBioscience(Uppsala,Sweden)。Optitran硝酸纖維素膜得自Schleicher&Schuell(Keene,NH)。

質粒構建體

進行缺少SH4結構域的雞c-Src和GST-Src突變體的制備(Ma等人,2000)。基于豬腎Na+/K+-ATP酶α1亞基的序列構建GST-NT(氨基酸殘基6-90)[SEQIDNO51],GST-CD2(氨基酸殘基152-288)[SEQIDNO52]和GST-CD3(氨基酸殘基350-785)[SEQIDNO53]表達載體(見圖3A)。

分別基于大鼠NA+/K+-ATP酶cDNA和大鼠心臟SERCA2acDNA構建GST-H+/K+-CD3[SEQIDNO54]和GST-SERCA-CD3[SEQIDNO55]。通過從GST-Src載體切除對應的SrccDNA然后將它們插入pTrc-HisA載體產生His標記的Src構建體。通過將全長c-Src符合讀框地克隆到pECFP-Nl或pRluc載體中構建用于熒光共振能量轉移(FRET)和生物發光共振能量轉移(BRET)測定法的Src-ECFP和Src-Rluc。從Pressley博士(TexasTechUniversity)提供的表達載體切除大鼠Na+/K+-ATP酶α1cDNA并將其符合讀框地插入pEYFP-Cl中,并將犬Na+/K+-ATP酶α1cDNA克隆到pGFP2載體中。通過DNA測序驗證所有構建體。

細胞制備、培養和瞬時轉染

豬腎近端LLC-PK1、人胚腎293T細胞和小鼠成纖維細胞SYF和SYF+Src細胞得自美國典型培養物保藏中心(Manassas,VA)并培養在含有10%胎牛血清(FBS)和青霉素(100U/ml)/鏈霉素(100gg/ml)的DMEM培養基中。使LLC-PK1和293T細胞血清饑餓24h,而SYF和SYF+Src細胞培養在含有0.5%FBS的培養基中24h并用于實驗。使用Lipofectamine2000,用多種質粒轉染細胞(Wang等人,2004)。除非另外指出,在轉染后24小時進行實驗。

制備Src、Na+/K+-ATP酶、GST融合的蛋白和His標記的蛋白

如所述的(Ma等人,2000)從sf-9細胞純化沒有前85個氨基酸殘基的Src并用于最初的結合測定中以確保Src結合Na+/K+-ATP酶,但是不結合純化的Na+/K+-ATP酶制備物中的脂類組分。在隨后的實驗(例如,磷酸化和活性測定)中,使用來自UpstateBiotechnology的純化的重組全長Src。使用Jorgensen方法(Xie等人,1996)從豬腎外髓質純化Na+/K+-ATP酶并使用具有1200到1400μmolPi/mg/h的比活性的制備物。

在我們的實驗條件下,100μM釩酸鹽或10μM烏本苷引起純化的豬腎Na+/K+-ATP酶的ATP酶活性的完全抑制。GST融合蛋白或His標記的蛋白在大腸桿菌BL21中表達并在谷胱甘肽珠或鎳柱上純化。

免疫沉淀和GSTpulldown

將細胞在含有1%NonidetP40、0.25%脫氧膽酸鈉、150mMNaCl、1mMEDTA、1mM苯甲基磺酰氟、1mM原釩酸鈉、1mMNaF、10μg/ml抑酶肽、10μg/ml抑酶醛肽和50mMTris-HCl(pH7.4)的RIPA緩沖液中裂解。細胞裂解物通過在16,000xg下離心15分鐘澄清,并將上清液(1mg)用抗-α1抗體免疫沉淀或者與不同的GST融合蛋白溫育。然后通過G蛋白瓊脂糖或谷胱甘肽柱(Ma等人,2000;Haas等人,2002)拉下(pulldown)復合體并通過蛋白質印跡分析。

Src激酶活性

使用商業試劑盒測定Src激酶活性(Haas等人,2000)。為了確定Na+/K+-ATP酶怎樣影響Src激酶活性,將純化的Src(4.5U)與5μg純化的Na+/K+-ATP酶在Src測定緩沖液中于室溫下溫育30分鐘。之后,將對照Src或Na+/K+-ATP酶結合的Src都暴露于10μM烏本苷并測定Src激酶活性。在其他實驗中,通過抗-pY418抗體測量SrcpY418以指示Src激活(Ma等人,2000)。為此,將純化的Src(4.5U)與不同量的純化的Na+/K+-ATP酶或GST-Na+/K+ATP酶構建體在磷酸緩沖鹽水(PBS)中于37℃下溫育30分鐘。之后,加入2mMATP/Mg2+。反應在37℃持續5分鐘并通過加入SDS樣品緩沖液終止。

體外結合測定

將純化的Na+/K+-ATP酶溶解在1%TritonX-100PBS中并以100,000xg離心30分鐘。收集上清液用于結合測定。將GST-融合蛋白(5μg)綴合在谷胱甘肽珠上并與500μlPBS中溶解的Na+/K+-ATP酶在0.5%TritonX-100存在下于室溫溫育30分鐘。用相同緩沖液洗滌所述珠四次。結合的Na+/K+-ATP酶在10%SDS-PAGE上分離并通過蛋白質印跡檢測。類似地進行互換結合測定(reciprocallbindingassag),其中使用GST-Na+/K+-ATP酶構建體(5μg)和缺少前85個氨基酸的純化的Src(200ng)或者His標記的Src構建體(100ng)。為了測試天然Na+/K+-ATP酶是否結合Src,在不存在TritonX-100的情況下下重復上面的實驗。為了制備Na+/K+-ATP酶/Src復合體,在不存在TritonX-100的情況下下將2-5μg純化的Na+/K+-ATP酶與PBS中的4.5USrc(~10ng)在室溫溫育30分鐘。復合體直接用于所指出的實驗或者通過以100,000xg離心30分鐘收集。對照實驗表明Na+/K+ATP酶-結合的而不是游離的Src可以通過離心共沉淀。

通過接納體光漂白進行FRET分析

使用上述pECFP-N1和pEYFP-C1載體,將增強的青色熒光蛋白(ECFP)融合到Src的C-末端,并且將增強的黃色熒光蛋白(EYFP)融合到大鼠Na+/K+-ATP酶α1亞基的N-末端。然后將Src-ECFP和EYFP-大鼠α1質粒共轉染到LLC-PK1細胞中。用ECFP/EYFP或ECFP/EYFP-大鼠α1轉染的細胞用作對照。24小時后,生長在蓋玻片上的細胞用冰冷的甲醇在-20℃下固定15分鐘并用PBS溶液洗滌兩次。然后將蓋玻片用于用LeicaDMIRE2共焦顯微鏡(Wetzlar,Germany)進行FRET測量。456nm處和515nm的激光線用于激發熒光,并對于Src-ECFP在465-509nm和對于EYFP-大鼠α1在530-570nm處記錄發射強度。選擇表達Src-ECFP和EYFP大鼠α1兩者的細胞進行FRET分析。選擇目的膜區域(ROI1)并通過應用100%強度的515-nm激光光漂白。所選的ROI1區域中在光漂白過程前后Src-ECFP和EYFP-大鼠α1的發射強度用于計算FRET效率。也計算非光漂白區(ROI2)的FRET效率并用作對照。

活細胞中的FRET分析

將LLC-PK1細胞用Src-ECFP和EYFP-大鼠α1共轉染并培養在蓋玻片上24小時。然后將蓋玻片封固在金屬腔中并用LeicaDMIRE2共焦顯微鏡分析。用456nm和515nm的激光線激發熒光,并對于Src-ECFP在465-509nm處和對于EYFP-大鼠α1在530-570nm處記錄發射強度。選擇表達Src-ECFP和EYFP大鼠α1兩者的細胞并僅僅通過456-nm激光照射。僅僅表達Src-ECFP或EYFP-大鼠α1的細胞用于校正和測定激光強度以及增益和補償設置。分別在465-509nm(FECFP)和530-570nm(FEYFP)下記錄所選膜區域中Src-ECFP和EYFP-大鼠α1的發射強度。FEYFP/FECFP的比率反映FRET效率。通過50s記錄后,將相同的細胞暴露于烏本苷并繼續記錄所指示的時間。

BRET分析

如Lowry等人(2002)所述的進行BRET測定。簡言之,用GFP-Na+/K+-ATP酶和Src-Rluc或如所述的其他構建體轉染后24小時,將細胞以一式三份接種在96孔微量培養板中。用所示濃度的烏本苷處理后,將細胞暴露于相等體積的含有10μMDeepBlueC(Rluc的底物)的BRET分析緩沖液中。使用具有微量培養板發光計檢測的FluoroskanAscentFL(Labsystems,Franklin,MA)立即獲得410nm(對于Rluc)和515nm(對于GFP)處的發射。如下計算BRET比率:(515nm處的發射-515nm處的背景)/(410nm處的發射-410nm處的背景),其中在每個實驗中通過測量非轉染細胞樣品的信號評估背景信號。

共定位分析

將LLC-PK1細胞在蓋玻片上培養24小時,用PBS快速洗滌兩次,然后用冰冷的甲醇固定15分鐘。細胞再次用PBS洗滌并用SignalEnhancer(MolecularProbes)封閉。兔多克隆抗-Src抗體和單克隆抗Na+/K+ATP酶抗體在3%BSA中混合并與蓋玻片在4℃過夜溫育。用PBS洗滌后,加入Alexafluor546-綴合的抗小鼠抗體和Alexafluor488-綴合的抗兔抗體并在室溫溫育1小時。用PBS再次洗滌蓋玻片三次。通過546nm處的激發和566-620nm處的發射顯示Na+/K+-ATP酶。通過488nm處的激發和505-535nm處的發射顯示Src。為了避免兩種熒光染料之間的干擾,發明人使用了順序方法,其特征是通過Leica共焦顯微鏡測量兩種蛋白質的共定位,其中交替地對細胞應用兩種激光光線488nm和546nm。用LeicaConfocalSoftware(版本2.5build1347)進行共定位分析。

數據分析

數據以平均值±SE給出。使用學生t檢驗進行統計學分析,并在p<0.05時認可顯著性。

結果

Na+/K+-ATP酶與Src的相互作用

烏本苷結合Na+/K+-ATP酶激活了幾種不同細胞系中的Src激酶。此外,Src可以與Na+/K+-ATP酶α1亞基共同免疫沉淀并且烏本苷以時間和劑量依賴性方式調控該相互作用(Haas等人,2002)。

發明人現在認為信號傳導的Na+/K+-ATP酶可以與Src相互作用形成信號傳導復合體。為了證實,將LLC-PK1細胞固定并通過單克隆抗-α1和多克隆抗-Src抗體雙染色。Na+/K+ATP酶α1和Src在LLC-PK1細胞中的質膜中共定位(圖1A)。

像素分析表明質膜中25.2±1.3%的Na+/K+-ATP酶與Src共定位。在過表達Src-ECFP的293T細胞中也觀察到這兩種蛋白質之間相似的共定位。為了測試LLC-PK1細胞中Na+/K+-ATP酶和Src是否相互作用,發明人用Src-ECFP和EYFP-大鼠α1轉染細胞。使用接納體光漂白方案在轉染的細胞中進行熒光共振能量轉移(FRET)分析。選擇大鼠α1用于最初的FRET實驗是因為發明人有大鼠α1特異性抗體,因此發明人除了檢測YFP熒光外還可以使用蛋白質印跡證實轉染的α1的表達。數據表明能量從Src-ECFP轉移到EYFP-大鼠α1。

如圖1B中所示,EYFP-大鼠α1的光漂白導致Src-ECFP信號的增強。從六次單獨實驗的共16個細胞測量的FRET效率為8.1到18.8(13.2±1.7)。相反,在用一對ECFP/EYFP或ECFP/EYFP-大鼠α1轉染的細胞中沒有檢測到FRET。這些數據表明Na+/K+-ATP酶和Src很接近,表明LLC-PK1細胞中這兩種蛋白質的直接相互作用。

為了得到直接結合證據,發明人首先用純化的豬腎Na+/K+ATP酶(PKE)和GST-Src進行在體外結合測定。重要的是注意到純化的Na+/K+-ATP酶是膜附著的制備物,其中α1和01亞基以1∶1摩爾比結合并且占制備物中90%以上的蛋白質含量(圖2B和Jorgensen,1974,1988)。

如圖2C中所示,1%TritonX-100-增溶的Na+/K+-ATP酶以濃度依賴性方式結合到GST-Src。當在結合測定中使用0.5μgNa+/K+-ATP酶時,檢測到顯著量的α1亞基。為了定量結合,進行如圖2D中所示的實驗。數據表明當使用2μg純化的Na+/K+-ATP酶時,GST-Src拉下(pulldown)輸入的12±2.4%(n=3)。這些數據提示Src和Na+/K+ATP酶之間直接結合的可能性。為了控制該結合不被Na+/K+-ATP酶的增溶誘導,發明人用純化的Na+/K+ATP酶不存在去污劑的情況下進行了上述實驗,表明Na+/K+-ATP酶和GST-Src之間相似的相互作用。為了分析Src的哪些結構域與Na+/K+-ATP酶(關于結構域結構見圖3A)相互作用,發明人表達并純化了GST-SH2、GST-SH3、GST-SH3SH2和GST-激酶結構域融合蛋白(Ma等人,2000)。使用相同的體外結合測定,發明人觀察到純化的Na+/K+-ATP酶結合到激酶結構域、SH3SH2和SH2結構域,但是不結合SH3結構域(圖3C)。因為GST-SH3SH2比GST-SH2拉下了更多的Na+/K+-ATP酶,所以該構建體用于隨后的實驗中。

盡管Src或其結構域構建體不可能通過它們與純化的酶制備物的中間蛋白質組分的結合拉下Na+/K+-ATP酶,但是為了排除該可能性和鑒定Na+/K+-ATP酶的哪些結構域涉及其與Src的相互作用,發明人制備了GST融合蛋白,其含有N-末端(GST-NT)、第二個胞質環(GST-CD2)、和連接Na+/K+-ATP酶的α1亞基的穿膜螺旋M4和M5的大的中央環(GST-CD3;圖4A),因為已知這些結構域與多種蛋白質相互作用。

如圖4B中所示,Src與GST-CD3和GST-CD2,但不與GST-NT相互作用。為了進一步測試該結合是Na+/K+-ATP酶特異的,發明人制備了來自大鼠胃NA+/K+-ATP酶的CD3和大鼠心臟肌質網Ca2+-ATP酶2a(SERCA)的GST融合蛋白。數據顯示來自NA+/K+-ATP酶的GSFCD3而不是SERCA從LLC-PK1細胞裂解物拉下Src(圖4C)。

為了對Na+/K+-ATP酶和Src之間的特異性結構域相互作用作圖,發明人制備了His標記的激酶結構域和SH3SH2結構域融合蛋白。使用相同的結合測定,發明人發現GST-CD3與激酶結構域,但不與Src的SH3SH2結構域相互作用。相反,CD2與SH3SH2,但不與激酶結構域相互作用(圖4D)。總之,上面的結果表明Na+/K+ATP酶可以通過α1亞基的CD2和CD3結構域直接與Src相互作用。

Na+/K+ATP酶對Src的調控

因為SH3SH2與調控蛋白的結合足夠激活Src,所以發明人測試了Src與Na+/K+-ATP酶的結合是否導致Src激活。當將純化的重組Src與不同量的純化的Na+/K+-ATP酶在ATP/Mg2+存在下在無去污劑的PBS溶液中溫育時,Src在Tyr418(pY418)處的自磷酸化(表明Src激活)以濃度依賴性方式降低(圖5A)。因為在100μM釩酸鹽(其完全抑制Na+/K+-ATP酶對ATP的水解)存在下重復實驗時發明人觀察到相同結果,所以Na+/K+-ATP酶對Src的影響可能是由于這兩種蛋白質之間的相互作用,但不是ATP的減少。為了進一步檢驗該假設,發明人測定了CD3對Src的作用。因為據報導維-奧二氏綜合征蛋白質通過激酶結構域的結合抑制Src,所以發明人推斷CD3和激酶結構域之間的相互作用可以足夠保持Src處于無活性狀態。實際上,如圖5B中所示,GST-CD3而不是GST作為純化的Na+/K+-ATP酶發揮作用,引起了SrcpY418的劑量依賴性抑制。

因為上面的數據提示Na+/K+-ATP酶可以結合Src并保持其處于無活性狀態,所以發明人現在認為Na+/K+-ATP酶/Src復合體可以構成烏本苷的功能復合體并且以與G蛋白偶聯的受體/G蛋白復合體相似的方式起作用;即,烏本苷與該復合體的結合釋放捕獲的Src激酶結構域,導致Src激活和隨后下游效應物的酪氨酸磷酸化。為了測試,發明人將重組Src與純化的Na+/K+-ATP酶在無去污劑的PBS溶液中,在烏本苷存在或不存在下溫育。蛋白質印跡分析表明烏本苷的家族以劑量依賴型方式顯著增加了pY418(圖6A)。

為了證實pY418的改變與Src活性相關,發明人現在使用通過商業通路可獲得的激酶測定試劑盒測量的Src介導的酪氨酸磷酸化。如圖6B中所示,盡管Na+/K+-ATP酶保持Src處于無活性狀態,但是烏本苷的加入恢復了激酶活性。發明人還確定了釩酸鹽是否影響該Na+/K+-ATP酶/Src復合體的活性。如圖6C中所示,盡管10-100μM釩酸鹽完全抑制了ATP酶活性,但是其對SrcpY418沒有顯示出影響。更重要的是,烏本苷仍然能夠在釩酸鹽存在下刺激Src的pY418。

為了測試烏本苷是否通過將Src從相互作用的Na+/K+-ATP酶解離而激活Src,發明人將Src與純化的Na+/K+-ATP酶溫育。因為純化的Na+/K+-ATP酶附著到膜,所以其可以通過以100,000Xg離心30分鐘沉淀。當Src結合到Na+/K+-ATP酶時,離心足夠沉淀Src。蛋白質印跡分析也表明共同沉淀的Src保持無活性狀態(圖7A),其與圖5中給出的發現相一致。因為僅僅Na+/K+-ATP酶結合的Src可以沉淀,所以發明人推斷如果烏本苷將Src從Na+/K+-ATP酶解離,那么所回收的Src將在烏本苷處理的樣品中減少。

令人驚奇地,當離心前用烏本苷處理樣品后進行樣品分析時,發明人發現烏本苷對與Na+/K+-ATP酶共同沉淀的總Src沒有影響,而是增加了SrcpY418的量(圖7B)。因為發明人已經表明多種結構域涉及Src與Na+/K+-ATP酶的相互作用,所以上面的發現導致我們檢測烏本苷是否僅僅從相互作用的Na+/K+-ATP酶解離單個(激酶)結構域。為此,將1μg純化的Na+/K+-ATP酶與GST-Src、GST-SH3SH2或GST激酶在無去污劑的PBS溶液中溫育,并通過離心收集復合體。之后,將復合體暴露于10μM烏本苷。

如圖7C中所描繪的,烏本苷對全長Src或SH3SH2結構域與Na+/K+-ATP酶的結合沒有影響,而是將激酶結構域從Na+/K+-ATP酶解離出來,其符合圖5中給出的發現。烏本苷對SH3SH2結構域與Na+/K+-ATP酶的結合沒有影響這一事實顯然解釋了為什么烏本苷沒有改變Src與該酶的總體結合。為了進一步測試激酶結構域的釋放是否足夠激活Src,發明人將GST-激酶融合蛋白與Na+/K+-ATP酶預溫育,然后加入全長Src以競爭激酶結構域結合位點。蛋白質印跡分析表明GST激酶,而不是GST或GST-SH3SH2顯著增加了SrcpY418(圖7D)。總之,這些發現為如下觀點提供了強烈支持:烏本苷通過釋放Src的被捕獲的激酶結構域而激活Na+/K+-ATP酶/Src復合體。

烏本苷激活活細胞中Na+/K+-ATP酶/Src復合體并刺激酪氨酸激酶磷酸化

如果烏本苷通過在活細胞中釋放激酶結構域而激活Na+/K+-ATP酶/Src復合體,發明人現在認為烏本苷將增加激酶結構域和相互作用的Na+/K+-ATP酶之間的距離,因為被釋放的激酶結構域將結合并磷酸化其效應物。這將導致共表達的Src-ECFP和EYFP-大鼠α1之間FRET信號的減弱。為了測試,發明人進行了活細胞FRET以及BRET分析。

如圖8A中所示,456nm處ECFP的激發引起對照細胞中ECFP譜(在465和509nm之間檢測為FECFP)和EYFP譜(在530和570nm之間檢測為FEYFP)的發射,表明Src-ECFP和EYFP-大鼠α1之間潛在的FRET。為了測試烏本苷是否刺激激酶結構域的釋放,將相同的細胞暴露于烏本苷并測量ECFP和EYFP強度。如圖8A中所示,一旦細胞暴露于100μM烏本苷,那么存在FEYFP的依賴時間的減弱和FECFP的同時增加,表明烏本苷引起了Src-ECFP和EYFP-大鼠α1之間FRET的減弱。作為對照,在用ECFP和EYFP轉染的細胞中重復了相同的實驗,并且沒有觀察到可檢測到的FRET。

因為必須激發ECFP以進行FRET分析,所以在實驗期間發生光漂白和光譜透膠,使得數據分析,特別是活細胞中的數據分析復雜化。此外,因為烏本苷不敏感的大鼠α1用于FRET分析,所以發明人想要測試烏本苷敏感的α1是否類似于大鼠α1發揮功能。因此,發明人使用GFP犬α1和Src-Renilla螢光素酶(Src-Rluc)進行BRET分析以確證上面的發現。將兩種構建體都瞬時轉染到293T細胞中并將GFP-融合Rluc的構建體用作陽性對照。選擇人293T細胞用于BRET分析,因為這些細胞在我們的實驗條件下更容易被瞬時轉染。

如圖8B中所示,共表達GFP-犬α1和Src-Rluc產生了與陽性對照相當的BRET比率,表明Src與活細胞中的Na+/K+-ATP酶相互作用。重要的是,當轉染的細胞暴露于不同濃度的烏本苷時,烏本苷引起了BRET比率的依賴劑量的降低。當使用10nM烏本苷時檢測到顯著降低(圖8C)。這些數據與犬α1的已知烏本苷敏感性一致并且支持圖8A中FRET分析的結果。

蛋白質酪氨酸磷酸化的增加對于烏本苷誘導的細胞功能改變是必需的。盡管烏本苷對Src的激活導致Na+/K+-ATP酶結合的EGF受體和PLC-,y的反式激活,但是發明人沒有測試所鑒定的Na+/K+-ATP酶/Src復合體的激活是否造成與所述信號傳導復合體結合的其他蛋白質的烏本苷誘導的酪氨酸磷酸化。

為了測試,將LLC-PK1細胞暴露于1μM烏本苷5分鐘。然后將來自對照和處理的細胞的細胞裂解物用抗-α1抗體免疫沉淀。當將免疫沉淀物在SDS-PAGE上分離并用抗磷酸酪氨酸抗體探測磷酸酪氨酸時,發明人觀察到烏本苷實際上刺激了多種Na+/K+-ATP酶結合的蛋白質的酪氨酸磷酸化(圖9A)。為了證實Src是應答烏本苷而啟動蛋白質酪氨酸磷酸化所需的,發明人在Src家族激酶敲除SYF細胞中重復了相同的實驗。

如圖9B中所示,烏本苷對蛋白質酪氨酸磷酸化的作用在SYF細胞中完全消失。另一方面,當將Src敲回到SYF細胞(SYF+Src)中時,烏本苷對蛋白質酪氨酸磷酸化的作用恢復,表明Src在啟動烏本苷激活的蛋白質酪氨酸磷酸化中的基本作用。這進一步受到如下事實的支持:Src抑制劑PP2能夠阻斷SYF+Src細胞中烏本苷誘導的蛋白質酪氨酸磷酸化。

因為發明人已經表明烏本苷刺激Src向Na+/K+-ATP酶信號傳導復合體的募集,所以發明人現在認為烏本苷首先激活Na+/K+-ATP酶結合的Src并隨后導致EGFR、窖蛋白-1和其他效應物的酪氨酸磷酸化。這些效應物又為募集額外Src和其他信號傳導蛋白至該信號復合體上提供了結合位點。

為了測試,發明人在1μMPP2存在或不存在下,用1μM烏本苷處理LLC-PK1細胞5分鐘。然后通過抗-α1抗體免疫沉淀細胞裂解物。免疫沉淀物的蛋白質印跡分析表明烏本苷增加了對照細胞而不是用PP2預處理的細胞中共沉淀的Src(圖9C),支持了如下觀點:Src的最初激活是將額外的Src募集到復合體所必須的。對照實驗也表明用PP3(Src抑制劑PP2的無活性類似物)預處理LLC-PK1細胞不能阻斷烏本苷誘導的Src向Na+/K+-ATP酶的募集(圖9C)。

為了確證上面的發現,發明人還用來自LLC-PK1細胞的分離的胞膜窖制備物進行了免疫沉淀實驗。發明人以前表明烏本苷以依賴Src的方式增加了分離的胞膜窖制備物中蛋白質的酪氨酸磷酸化。它也刺激了Na+/K+-ATP酶/窖蛋白-1/Src復合體的形成(Wang等人,2004)。然而,因為ATP的加入是烏本苷激活分離的胞膜窖中Src所需的,發明人認為如果Src激活和窖蛋白-1的酪氨酸磷酸化是Src的額外募集所需的,那么不存在ATP時,烏本苷不能刺激Src向窖蛋白-1復合體的募集。實際上,這是當發明人在不存在ATP時重復上述實驗時所觀察到的(圖9D)。總之,這些數據清楚地表明烏本苷通過首先激活Src然后將包括Src在內的更多效應蛋白募集到信號Na+/K+-ATP酶而通過Na+/K+-ATP酶傳遞信號。

討論

發明人現在顯示了涉及Na+/K+-ATP酶/Src相互作用的已作圖的結構域。發明人還闡明Na+/K+-ATP酶和Src可以通過所鑒定的蛋白質結構域裝配成功能信號傳導復合體并且烏本苷與Na+/K+-ATP酶的結合激活Src并引起下游蛋白質酪氨酸磷酸化。該結論和其他結論在圖10和中總結并在下文討論。

作為強心類固醇受體的Na+/K+-ATP酶/Src復合體

因為Na+/K+-ATP酶的α1亞基在其N-末端含有保守的富含脯氨酸的基序(Yudowski等人,2000),所以發明人最初認為烏本苷可能促進Src的SH3和Na+/K+-ATP酶之間的相互作用,導致Src的激活。另發明人驚奇的是,GSTpulldown測定法表明SH3結構域不參與和Na+/K+-ATP酶的直接相互作用。相反,SH2和Src的激酶結構域分別與Na+/K+-ATP酶α1亞基的CD2和CD3結構域相互作用。此外,發明人的結果表明Na+/K+-ATP酶和GST-CD3都抑制Src活性(圖5)。盡管發明人不能排除與Na+/K+-ATP酶共同純化的其他Src調節劑涉及其中的可能性,但是純化的CD3結構域單獨可以模擬Na+/K+-ATP酶的作用這一事實強烈提示Na+/K+-ATP酶足夠失活Src。

Na+/K+-ATP酶和Src形成無活性Src復合體這一事實導致發明人現在認為該受體復合體可以以類似于細胞因子受體的方式傳遞烏本苷信號。盡管這些受體沒有內在的激酶活性,但是與Src的偶聯允許它們激活下游的蛋白質酪氨酸磷酸化。本文描述的一些實例支持該觀點。

首先,烏本苷誘導的Na+/K+-ATP酶的構象改變足夠釋放Src的激酶結構域(圖7)。有趣的是,SERCA的一種抑制劑,毒胡蘿卜內酯能夠將CD3帶到膜附近。如果烏本苷可以對CD3發揮類似效果,那么這可以解釋烏本苷怎樣從Na+/K+-ATP酶釋放激酶結構域。另一方面,因為烏本苷對SH3SH2結構域與CD2的結合沒有影響,所以該結構域可以作為鉸鏈發揮功能,保持激活的Src結合到信號Na+/K+-ATP酶用于特異性和穩健的信號傳遞。

其次,通過加入GST-激酶結構域融合蛋白拮抗Src激酶結構域與Na+/K+-ATP酶的結合如烏本苷那樣發揮作用并且刺激了SrcpY418。

第三,所觀察到的烏本苷對Src的作用(圖6)不是由于對ATP酶活性的抑制,因為在完全抑制ATP酶活性的濃度下,釩酸鹽沒有顯示出對Src的作用。

此外,不水解ATP的GSTCD3也可以抑制Src激活。類似地,所述發現也反對離子強度改變涉及烏本苷誘導的對Src的激活,因為這些實驗在試管中在相同的離子條件下進行。

最后,FRET和BRET分析都表明烏本苷在活細胞中確實釋放激酶結構域(圖8)。重要的是注意到烏本苷對Na+/K+-ATP酶/Src-激酶結構域相互作用的影響是劑量依賴式的并且與烏本苷與Na+/K+-ATP酶結合的已知的劑量反應曲線良好相關(Haas等人,2002)。

簡言之,發明人已經闡明烏本苷引起的信號轉導的新的機理。因為Src家族激酶是高度保守的,所以發明人認為信號傳導Na+/K+ATP酶可以與Src家族的其他成員相互作用。此外,哺乳動物細胞以組織特異性方式表達至少四種不同類型的亞基,并且現在認為不同的同種型也可以以組織特異性方式與Src相互作用。至此,有趣的是注意到Src也與NA+/K+ATP酶的CD3結構域相互作用(圖4C),提示NA+/K+ATP酶在Src活性調節中的潛在功能。

發明人還認為這些P-ATP酶也可以作為Src效應物,因為最近的研究已經提出了這些P-ATP酶的Src介導的酪氨酸磷酸化(Kanagawa等人,2000;Masaki等人,2000;Ferrandi等人,2004)。

發現的重要性

Na+/K+-ATP酶在保持哺乳動物細胞中跨細胞膜的Na+和K+離子濃度中的基本功能是公知的。強心類固醇的結合位點在整個真核生物種系發生中如此保守這一事實表明這些類固醇在Na+/K+-ATP酶功能的調控中必定起重要作用。因為直到幾年前,離子泵是Na+/K+-ATP酶的唯一已知的功能,所以本領域充分接受強心類固醇必定通過抑制ATP酶活性傳遞信號,盡管沒有此類信號轉導的激素先例。該作用模式已經導致本領域許多人質疑內源性強心類固醇的重要性,因為它們在正常生理條件下以亞納摩爾濃度循環,并且僅僅可以結合到1-2%的細胞表面Na+/K+-ATP酶。因為多數哺乳動物細胞每個細胞含有1百萬Na+/K+-ATP酶分子,所以強心類固醇僅僅作為Na+/K+-ATP酶的泵功能抑制劑是非常無效的,因為它們必須針對細胞的大泵能力起作用。另一方面,如果結合位點對于調控Na+/K+-ATP酶的信號傳導功能是保守的,那么強心類固醇將作為真正的激動劑發揮功能。如通過我們的共定位分析估計的,-25%的Na+/K+-ATP酶具有與Src相互作用的能力。烏本苷對1-2%的這些受體的激活將產生每個細胞幾千活性分子。基于HeLa細胞中EGF信號傳導的發現和信號放大原理,這將足夠通過激酶級聯產生強烈信號,特別是如果信號傳導事件在膜微結構域如胞膜窖中發生。與這相一致的是,最近的研究已經表明在培養的細胞和動物模型中,生理學濃度(例如0.1-1nM)的烏本苷能夠激活Src和ERK(Aydemir-Koksoy等人,2001;Ferrandi等人,2004)。

在藥理學上,發明人已經闡明在分離的心臟制備物以及在培養的肌細胞中通過激活Src和ERK完成烏本苷誘導的收縮力(Mohammadi等人,2003)。此外,Src和ERK的抑制阻斷了心肌細胞中細胞內Ca2+的烏本苷誘導的增加(Tian等人,2001)。

從而,本文的實施例揭示了心臟中洋地黃誘導的收縮力的可能的分子機理。本文的實施例也表明這可以用于開發可以刺激Na+/K+-ATP酶的信號傳導功能而不影響離子泵功能的化學品或肽。此外,本文的發明人還提供了對所述分子機理的認識,其中膜轉運蛋白通過所述分子機理使用Src形成功能信號復合體。因為許多膜轉運蛋白和離子通道與Na+/K+-ATP酶一樣經歷底物或者配體依賴性構象改變,所以這些發現提出了關于其他膜轉運蛋白是否也涉及信號轉導從而構成另一組重要的受體和信號轉導物的重要生物學問題。至此,發明人指出Na+/K+-ATP酶的CD3在許多不同的P型ATP酶中是高度保守的并且現在認為其他P類型的ATP酶(例如,圖4C中所示的NA+/K+-ATP酶)也涉及Src的調控。發明人也指出一些最近的報導表明Src與許多其他膜離子通道相互作用并調控這些通道(Yu等人,1997;Sobko等人,1998;Tiran等人,2003)。

實施例II

使用RNA干擾測定法對Src相互作用的Na+/K+-ATP酶的功能表征

Na+/K+-ATP酶和Src形成信號傳導受體復合體。這里,發明人現在展示了Na+/K+-ATP酶的量和性質的改變怎樣影響基礎Src活性和烏本苷誘導的信號轉導。通過用表達α1特異性小干擾RNA的載體轉染LLC-PK1細胞產生了一些α1亞基敲減細胞系。盡管α1敲減導致Na+/K+-ATP酶活性的顯著降低,但是它提高了基礎Src活性和一種Src效應物黏著斑激酶的酪氨酸磷酸化。同時,它還消除了Src和ERK1/2的烏本苷誘導的激活。當通過大鼠α1挽救敲減的細胞時,恢復了Na+/K+-ATP酶活性和基礎Src活性。此外,烏本苷能夠以高得多的濃度刺激挽救細胞中的Src和ERK1/2,與豬和大鼠α1之間烏本苷敏感性的所確立的差異相一致。最后熒光共振能量轉移分析和免疫共沉淀測定表明泵缺失的大鼠α1(D371E)突變體也可以結合Src。該突變體的表達恢復了基礎Src活性和黏著斑激酶酪氨酸磷酸化。總之,發明人現在認為LLC-PK1細胞含有Src相互作用的Na+/K+-ATP酶庫,其不僅調控Src活性而且作為烏本苷激活蛋白激酶的受體。

Src的激活對于許多細胞活性(包括細胞內鈣的調控、基因表達和細胞生長)的烏本苷誘導的改變是必需的,并且發明人已經檢查了Na+/K+-ATP酶是否直接與Src相互作用以形成功能性信號傳導受體。

使用體外谷胱甘肽S轉移酶pulldown測定法,發明人現在鑒定了Na+/K+-ATP酶α1亞基的第二個和第三個細胞內結構域分別與SrcSH2和激酶結構域相互作用。在功能上,這些相互作用保持Src處于無活性狀態,并且烏本苷與該無活性的Na+/K+-ATP酶·Src復合體的結合釋放并隨后激活所結合的Src。這些新的實例表明細胞內Src相互作用的Na+/K+-ATP酶現在被認為在基礎Src活性的調控中起重要作用并且作為烏本苷的功能性受體刺激活細胞中蛋白質酪氨酸磷酸化。為了測試,發明人開發了基于siRNA的測定法,其允許我們確定Na+/K+-ATP酶的量和性質的改變對基礎的和烏本苷刺激的Src活性的影響。

材料和方法

最高純度的化學品購自Sigma。GeneSuppressor載體購自BioCarta(SanDiego,CA)。細胞培養基、胎牛血清、胰蛋白酶、Lipofectamine2000和限制酶購自Invitrogen。EYFP表達載體(pEYFP)和ECFP表達載體(pECFP)來自Clontech。QuikChange誘變試劑盒購自Stratagene(LaJolla,CA)。Optitran硝化纖維素膜來自Schleicher&Schuell。增強的化學發光SuperSignal試劑盒購自Pierce。Image-iTFX信號增強劑、Antifade試劑盒、AlexaFluor488-綴合的抗小鼠/兔IgG和AlexaFluor546-綴合的抗小鼠/兔IgG來自MolecularProbes(Eugene,OR)。抗-Src(克隆GD11)單克隆抗體、抗-Na+/K+-ATP酶α1多克隆和單克隆(克隆C464.6)抗體、抗磷酸酪氨酸(克隆4G10)抗體,和G蛋白-瓊脂糖來自UpstateBiotechnologyInc.(LakePlacid,NY)。單克隆抗-Tyr(P)418-Src和抗-Tyr(P)529-Src抗體來自BIOSOURCE(Camarillo,CA)。多克隆抗-FAK和抗-Tyr(P)925FAK抗體來自CellSignaling(Danvers,MA)。單克隆抗-α1抗體(a6F)來自UniversityofIowa的DevelopmentalStudiesHybridomaBank。抗-c-Src(B-12)單克隆抗體、抗c-Src(SRC2)多克隆抗體、抗-ERK(C-16)多克隆抗體、抗-pERK(E-4)單克隆抗體和所有二級辣根過氧化物酶綴合的抗體都來自SantaCruzBiotechnologyInc.(SantaCruz,CA)。多克隆大鼠α1特異性抗體(抗NASE)由ThomasPressley博士(TexasTechUniversity,Lubbock,TX)提供。

細胞培養

LLC-PK1細胞和人胚腎293T細胞來自美國典型培養物保藏中心并保持在5%CO2-濕潤培養箱中含有10%胎牛血清、100單位/ml青霉素和100μg/ml鏈霉素的Dulbecco改良的Eagle培養基中。

siRNA表達載體的構建

使用GeneSuppressor構建試劑盒構建siRNA。簡言之,使用人α1cDNA(GenBankTM檢索號NM_000701)作為模板合成四對寡核苷酸(A1-A4)(細節見表1),并通過將兩個互補的寡核苷酸退火制備插入片段。然后將退火的插入片段克隆入用SalI和XbaI消化的pSuppressorTM-U6載體中。通過核苷酸測序證實陽性克隆。

位點定向誘變

Pressley博士提供了大鼠α1表達載體pRc/CMV-α1AAC(12)。為了使得大鼠α1的表達對A4siRNA不敏感,使用QuikChange誘變試劑盒將α1siRNA靶向的序列從2530ggtcgtctgatcttt(GenBankTM檢索號NM_012504)沉默突變為2530ggcaggctaatattc。產生SspI(aat/att)限制酶位點以方便克隆篩選。通過DNA測序證實陽性突變體(pRc/CMV-α1AACml或縮寫為AAC)然后用于該研究中。通過用pRc/CMVα1AACml作為模板將1126gacaag突變為1126gagaag產生泵缺失的突變體(D371E)(13)。

產生穩定的α1亞基敲減和敲入細胞系

使用Lipofectamine2000,用不同的siRNA表達載體以及pEYFP瞬時轉染人胚腎293T細胞。48小時后,首先檢查細胞的EYFP表達用于評估轉染效率然后收集細胞用于通過蛋白質印跡分析內源α1含量。為了產生穩定細胞系,用A4siRNA表達載體(pSuppressor-A4siRNA)(見圖25-表1)和嘌呤霉素選擇標記物(pBade-puro)轉染一批LLC-PK1細胞。

圖25顯示了表1,人Na/KATP酶-α1亞基特異性siRNA的靶標和寡核苷酸序列,其中靶序列用粗體字母標記[SEQIDNO.35-46]。

另一批細胞用pEYFP以及pSuppressor-A4siRNA和pBade-puro共轉染使得共表達的EYFP可以用作標記物來挑選克隆。共同選擇空載體(pSuppressor)或AlsiRNA-轉染的細胞并用作對照。轉染后24小時用嘌呤霉素(1μg/ml)選擇細胞。克隆并擴增嘌呤霉素抗性菌落。為了挽救Na+/K+-ATP酶敲減細胞,細胞用pRc/CMV-α1AACm1轉染。用3μM烏本苷啟動選擇,因為未轉染的細胞對烏本苷非常敏感。大約1周后,分離烏本苷抗性菌落并且在烏本苷不存在下擴增成穩定細胞系。不使用G418是因為這些細胞抗G418,從而需要3mg/ml才能殺死未被轉染的細胞。敲減的細胞對殺稻瘟素(15μg/ml)也是敏感的,發明人也使用該試劑進行其他選擇。

免疫沉淀和免疫印跡分析

將細胞用PBS洗滌,溶解在修改的冰冷的放射免疫沉淀測定緩沖液中,并進行免疫沉淀或蛋白質印跡分析。使用增強的化學發光試劑盒檢測蛋白質信號并使用Bio-RadGS-670成像密度計進行定量。

Na+/K+-ATP酶活性測定

測定Na+/K+-ATP酶酶促活性。簡言之,用Tris-EGTA緩沖液(pH7.2)從培養物收集細胞并簡短超聲處理。然后室溫下用0.1mg/mg蛋白質濃度的阿拉霉素處理細胞裂解物30分鐘。通過測定32P從[,y-32P]ATP的最初釋放測量ATP酶活性,并在含有100mMNaCl、25mMKCl、3mMMgCl2、1mMEGTA、2mMATP、5mMNaN3和50mMTris-HCl(pH7.4)的反應混合物(1ml)中進行反應。Na+/K+-ATP酶活性計算為不存在烏本苷和存在1mM烏本苷時測量的活性之間的差異。為了測定烏本苷濃度曲線,將阿拉霉素處理的細胞裂解物與不同濃度的烏本苷預溫育15分鐘,然后加入ATP以開始反應。

共焦熒光顯微術

培養在蓋玻片上的細胞用PBS洗滌兩次并用在-20℃預冷的甲醇固定15分鐘。然后將固定的細胞用PBS洗滌三次并在室溫下用200μlImage-iTFX信號增強劑封閉30分鐘。再次洗滌細胞并用含有1%牛血清白蛋白的PBS中的一級抗體在室溫下溫育1小時。用PBS洗滌三次后,細胞用相應的AlexaFluor綴合的二級抗體溫育。使用LeicaDMIRE2共焦顯微鏡(Leica,Mannheim,Germany)進行圖像顯示。Leica共焦軟件用于數據分析。

通過接納體光漂白進行FRET分析

將ECFP融合到Src的C末端,并將EYFP融合到大鼠Na+/K+-ATP酶α1或其突變體的N-末端。使用接納體光漂白方案,在用Src-ECFP和EYFP-大鼠α1表達載體共轉染的細胞中進行FRET分析。簡言之,24小時培養后,將蓋玻片上的細胞用-20℃下預冷的甲醇固定15分鐘,并用PBS溶液洗滌兩次。通過應用高強度的515nM激光將EYFP-大鼠α1光漂白,并在EYFP光漂白之前(Dpre)和之后(Dpost)記錄456nM激光激發的ECFP發射。然后通過(Dpost-Dpre)/Dpre的比率計算FRET效率。用Src-ECFP和EYFP或EYFP-α1和ECFP表達載體轉染的細胞用作對照,在這些對照細胞中沒有觀察到可檢測到的FRET。

數據分析

數據以平均值±S.E給出。用學生t檢驗進行統計學分析,并且在p<0.05時認可顯著性。

結果

通過基于siRNA的測定法操作細胞Na+/K+-ATP酶含量

如圖25中的表1所示,選擇了共四對α1特異性siRNA。人胚腎293T細胞中的瞬時轉染測定法表明A4siRNA的表達導致人α1亞基表達的超過40%的降低,而其他的導致0(AlsiRNA)到20%(A2和A3siRNA)的減弱。因為如通過共表達的EYFP所指示的,轉染效率為約50%,所以發明人推斷A4siRNA在沉默內源Na+/K+-ATP酶的表達中是有效的。因此,將LLC-PK1細胞用A4siRNA表達載體(pSuppressor-A4siRNA)與嘌呤霉素選擇標記(pBade-puro)與或不與pEYFP進行轉染,如“實驗步驟”中所述。兩輪選擇后,發明人收集了20個穩定的轉染體。使用單克隆(a6F)抗體的蛋白質印跡分析表明這些克隆中α1亞基的表達與用空載體(pSuppressor)轉染并選擇的對照P-11細胞相比顯著降低。相反,從用AlsiRNA轉染的LLC-PK1細胞中得到的細胞克隆(例如A1)以與P-11細胞中相當的水平表達α1(見圖26,表2)。

圖26顯示了表2,相對α1亞基蛋白質含量和用于不同細胞系中的DNA構建體的組成。

本文的發明人已經擴增并進一步表征了3種表達A4siRNA-的克隆。如圖11A中所示,α1亞基的表達在A4-11、TCN23-19和PY-17細胞中顯著降低。在這些細胞系中,通過使用共表達的EYFP作為標記物克隆的PY-17細胞表達最低水平的Na+/K+-ATP酶。

圖26中的表2顯示了發明人產生的這些和其他細胞系中α1相對量的定量數據。因為使用從豬腎制備的純化的Na+/K+-ATP酶進行的對照蛋白質印跡表明僅僅可能進行合理的定量測定,其比較α1的量中小于6倍差異的兩個樣品(數據未顯示),所以發明人通過比較A4-11與對照P-11,然后比較TCN23-19和PY-17與A4-11測量了這些細胞中α1的相對量。為了證實上面的蛋白質印跡數據,發明人還用不同的抗Na+/K+-ATP酶α1單克隆抗體(克隆C464.6)和抗-Na+/K+-ATP酶α1多克隆抗體探測了印跡,顯示與圖11A中基本相同的結果。此外,當用抗Na+/K+-ATP酶α1抗體(克隆C464.6)免疫染色共培養的P-11和PY-17細胞時,發明人發現綠色PY-17細胞沒有顯示出α1的可檢測的表達,而對照P-11細胞的質膜被該抗體清楚地標記(圖11B)。為了確保α1亞基的敲減不誘導其他同種型的表達,發明人就α2和α3分析了細胞裂解物并且在上面的細胞系中沒有發現可檢測到的信號。

此外,當測量細胞裂解物中的烏本苷敏感的ATP酶活性時,與對照P-11細胞相比在PY-17細胞中注意到顯著(80%)降低(見圖27,表3)。

圖27顯示了表3,在細胞系P-11,PY-17和AAC-19中的Na+/K+-ATP酶活性。

PY-17細胞具有非常低的內源Na+/K+-ATP酶并且當細胞通過敲入內源α1進行挽救時,可用于研究Na+/K+-ATP酶的結構-功能性質。為了證實,發明人首先進行了大鼠α1cDNA的沉默突變以改變siRNA靶向的序列。發明人然后用突變的大鼠α1表達載體(pRc/CMVα1AACm1)轉染PY-17細胞并產生了一些穩定的轉染物。克隆AAC-19的進一步分析表明與P-11和PY-17,不同這些細胞不像表達大鼠α1(圖12A)。

當使用單克隆抗體(a6F)分析相同印跡的總α1時,發明人發現AAC-19細胞表達與對照P-11細胞中相當的量的α1(圖12A)。通過用抗-α1(克隆C464.6)抗體免疫染色共同培養的P-11和AAC-19細胞進一步證實了該結果。如圖12B中所述,綠色AAC-19和對照P-11細胞顯示出質膜中相似水平的Na+/K+-ATP酶。對照實驗也表明不存在烏本苷時,大鼠α1在該細胞系中穩定表達至少20代。大鼠α1向PY-17細胞的功能性敲入能夠恢復Na+/K+-ATP酶活性(見圖27-表3)。而且,它偏移了烏本苷對ATP酶活性的劑量反應曲線,并使得挽救的細胞對烏本苷的敏感性降低。實際上,挽救的細胞與僅僅表達α1同種型的大鼠細胞系的行為一樣(圖13)。重要的是注意到PY-17與對照P-11細胞一樣對烏本苷敏感,并且10μM烏本苷引起Na+/K+-ATP酶的完全抑制。

Na+/K+-ATP酶對基礎Src活性的調控

體外研究表明Na+/K+-ATP酶直接結合Src并保持其處于無活性狀態。本文的發明人現在認為該調控模式在活細胞中起作用并且細胞內Na+/K+-ATP酶的降低將減小該相互作用,導致基礎Src活性升高。為了測試,發明人測量了來自上面細胞系的細胞裂解物中Src的磷酸化(Tyr(P)418-Src),其指示Src的激活。

如圖14A中所述,內源Na+/K+-ATP酶的敲減沒有改變總Src的表達。然而,活性Src的水平在A4-11、TCN23-19和PY-17細胞中顯著降低。有趣的是,Src活性的升高似乎與這些細胞中表達的Na+/K+-ATP酶的量反相關(圖14B)。

通過用抗-Tyr(P)418-Src抗體免疫染色細胞進一步證實了這些發現,表明TCN23-19細胞含有比P-11細胞更多的活性Src(圖14C)。重要的是注意到兩個對照細胞系P-11和Al細胞之間活性Src的量沒有差異。

為了測試當補充Na+/K+-ATP酶時,由于Na+/K+-ATP酶的表達降低引起的Src活性的升高是可逆轉的,發明人測定了AAC-19細胞中總的Src和活性Src。如圖12A-B中所示,AAC-19細胞來自大鼠α1-轉染的PY-17細胞并且表達與對照P-11細胞中相當的量的Na+/K+-ATP酶。盡管大鼠α1的敲入不改變AAC-19細胞中總的Src,但是它降低活性Src水平至對照P-11細胞中所看到的水平(圖15A和15B)。

如圖27中表3所示,PY-17細胞中Na+/K+-ATP酶活性降低80%。當在22Na+(0.5μCi/ml)培養基中溫育細胞60分鐘以完全平衡可交換的細胞內Na+與22Na+(15)后測量細胞內Na+時,發明人發現PY-17細胞中穩態細胞內Na+約為P-11細胞中的兩倍。為了確保AAC-19細胞中觀察到的Src活性的改變不是由于功能性Na+/K+-ATP酶的恢復和隨后細胞內Na+的減少,發明人測試了大鼠α1的泵缺失突變體的敲入對于所觀察到的Na+/K+-ATP酶和Src之間的相互作用是否足夠,PY-17細胞用沉默突變的野生型大鼠α1(pRc/CMVα1AACm1)或大鼠α1泵缺失突變體(D371E)瞬時轉染。

如圖15C中所示,大鼠α1或突變體的表達減少了PY-17細胞中的活性Src。為了進一步證實,發明人還用EYFP融合的大鼠α1突變表達載體(pEYFP-D371E)瞬時轉染TCN23-19細胞并免疫染色活性Src。如圖15D中所示,表達大鼠α1突變體的細胞與未轉染的TCN23-19細胞相比具有低得多的活性Src。這些數據表明泵缺失的Na+/K+-ATP酶突變體仍然能夠與Src相互作用并調控Src。為了進一步證實,發明人在用EYFP-大鼠α1突變體(D371E)和Src-ECFP表達載體瞬時轉染的TCN23-19細胞中進行了FRET分析。

如圖16A中所示,泵缺失突變體被靶向至質膜。當通過接納體光漂白方案測量這些轉染的細胞中的FRET時,清楚了證明了能量從SrcECFP向EYFP-D371E的轉移(圖16B)。從三個獨立實驗中的共20個細胞測量的FRET效率為10.4到15.6(13.2±1.4)。這些數據表明泵缺失Na+/K+-ATP酶像野生型α1(10)一樣作用并且可以與Src相互作用而形成信號傳導復合體。該結論進一步得到免疫共沉淀測定法的支持,其表明大鼠α1突變體可以被抗-Src抗體共沉淀(圖16C)。

FAK是已知的Src效應物,其在細胞遷移和增殖的調控中起重要作用。Src的激活刺激FAKTyr925的磷酸化,其隨后也導致RDKl/2的激活。為了檢查基礎Src活性的升高是否可以導致Src效應物的激活,發明人測量了α1敲減細胞中FaK的酪氨酸磷酸化。如圖17A中所示,細胞裂解物被抗磷酸酪氨酸抗體免疫沉淀,并且使用抗FAK抗體探測免疫沉淀物。數據清楚地表明α1敲減能夠增加酪氨酸磷酸化的FAK的量。特別地,當探測細胞裂解物的Tyr(P)925-FAK時,發明人發現A4-11和PY-17細胞中Tyr(P)925-FAK的顯著升高(圖17B)。有趣的是,當測量總的ERK1/2和pERKl/2時,發明人發現PY-17細胞中活性ERK1/2的量的適度增加(圖17C)。這符合Tyr(P)925-FAK的已知的功能(19,20)。該Tyr(P)925的增加對Src抑制劑PP2敏感(圖17D)。重要的是注意到FAK磷酸化與PP2處理的敲減細胞中活性Src水平良好相關。總之,這些數據表明由于α1敲減引起升高的Src活性可以刺激Src效應物的酪氨酸磷酸化。這得到如下觀察的進一步支持:泵缺失突變體(D371E)的表達不僅恢復了基礎Src活性,而且降低了PY-17細胞中FAKTyr925磷酸化(圖17E)。

Na+/K+-ATP酶的敲減消除了Src和ERKl/2的烏本苷誘導的激活

因為Na+/K+-ATP酶·Src復合體作為烏本苷的功能性受體以誘導Src激活和ERKl/2的隨后刺激,所以上面的實施例導致發明人測試Na+/K+-ATP酶的敲減是否影響烏本苷激活的信號轉導。

如圖18A中所示,盡管烏本苷激活了P-11細胞中的Src,但是烏本苷的該效應在PY-17細胞中基本上被消除,而在A4-11細胞中觀察到顯著降低。為了確定該抑制不是由于受體信號轉導的非特異性缺陷,發明人也測量了EGF對Src的作用。發明人發現表皮生長因子能夠刺激P-11和PY-17細胞中的SrcTyr(P)418(P-11中2.5±0.3倍增加對比PY-17中1.7±0.2倍增加,n=3)。與對于Src的發現相一致,發明人也不能檢測PY-17細胞中ERKl/2磷酸化的任何烏本苷誘導的改變(圖18B)。

相反,表皮生長因子能夠刺激PY-17細胞中的ERKl/2。這些數據支持如下觀點:Na+/K+-ATP酶實際上是烏本苷誘導的信號轉導的受體。該觀點進一步得到圖18C和18D中給出的發現的支持,表明大鼠α1的敲入不僅恢復了烏本苷應答而且使AAC-19細胞中的劑量反應曲線偏向右邊。

討論

在該實施例中,發明人不僅介紹了有效的且α1特異性RNA干擾測定法,而且提供了挽救Na+/K+-ATP酶耗盡的細胞的方案。這些方法使得我們可能闡明細胞Na+/K+-ATP酶調控Src和其效應物FAK并且Na+/K+-ATP酶·Src復合體作為烏本苷的唯一受體而激活活細胞中的Src和隨后激活ERKl/2。

通過RNA干擾測定法操作細胞內Na+/K+-ATP酶含量

RNA干擾是最初在1998年在秀麗隱桿線蟲(Caenorhabditiselegans)中發現的細胞機理,并且指通過雙鏈RNA觸發的內源mRNA的降解進行的轉錄后基因沉默。其現在已經被開發為人工沉默多種生物系統(包括培養的細胞和完整生物)中特定基因的有力工具。使用Paul等人(2002)開發的策略和瞬時轉染測定法,發明人鑒定A4siRNA對于沉默α1表達是有效的。從而,發明人用A4siRNA表達載體轉染豬LLC-PK1細胞并克隆了幾個穩定的細胞系。蛋白質印跡分析和免疫染色測定表明克隆的細胞系中α1的表達被顯著降低(圖11和12和圖26-表2)。例如,PY-17細胞中α1為對照P-11細胞中的僅僅約8%。功能分析揭示α1的耗盡導致PY-17細胞中烏本苷-敏感性ATP酶活性降低80%(圖27-表3)。發明人現在開發了沉默培養的細胞中內源α1的表達的有效方案。

為了測試α1耗盡的細胞是否可以用于研究內源/突變α1的信號傳導功能,發明人用大鼠α1表達載體轉染了PY-17細胞,所述表達載體中,A4siRNA靶向的序列被沉默突變。通過利用與大鼠α1特異反應的抗體的可用性優點,發明人在本文中闡明內源大鼠α1可以被敲入并且大鼠α1的表達不僅恢復了總的細胞Na+/K+-ATP酶蛋白質而且恢復了Na+/K+-ATP酶活性。而且,大鼠α1挽救的細胞(AAC-19)顯示出與僅僅表達Na+/K+-ATP酶α1亞基的大鼠細胞系相同的烏本苷敏感性(圖13)。總之,這些數據表明發明人已經開發了操作細胞Na+/K+-ATP酶的有效方案。

該方案與廣泛使用的烏本苷選擇方案相比,為在烏本苷敏感細胞系中表達突變Na+/K+-ATP酶方面提供了額外的優點(23-26)。

首先,本方案使得可能耗盡內源Na+/K+-ATP酶,允許發明人研究Na+/K+-ATP酶表達的降低對細胞功能的影響。

其次,本方案不需要使用烏本苷以強迫表達轉染的Na+/K+-ATP酶。在考慮最近的研究中這是重要的,所述研究表明烏本苷刺激Na+/K+-ATP酶的信號傳導功能并且誘導該酶的胞吞作用。

第三,本方案可用于測定具有極低(小于10%)的內源Na+/K+-ATP酶的細胞中的內源/突變Na+/K+-ATP酶。

第四,所鑒定的A4siRNA可用于沉默來自不同于人和豬的物種的細胞中的α1表達,因為A4siRNA靶向的人α1cDNA序列(核苷酸2293到核苷酸2312)[SEQIDNO:38]在從魚類到人的所有鑒定的α1亞基(但不是其他同種型)中是保守的。

第五,用不同同種型的Lp挽救PY-17細胞,Na+/K+-ATP酶提供了揭露同種型特異性信號傳導功能的通路。

Src-相互作用的Na+/K+-ATP酶庫

Na+/K+-ATP酶存在于具有Src的胞膜窖中。FRET分析表明信號傳導Na+/K+-ATP酶和Src可能相互作用并形成功能性受體復合體。體外結合測定法表明α1亞基和Src可以通過多個結構域直接相互作用并且該相互作用保持Src處于無活性狀態。發明人現在認為存在Na+/K+-ATP酶的Src相互作用庫,其不僅調控基礎Src活性,而且作為烏本苷的受體以刺激多種效應物的依賴Src的酪氨酸磷酸化。

首先,因為信號傳導Na+/K+-ATP酶結合Src并保持其處于無活性狀態,所以發明人現在認為內源Na+/K+-ATP酶的減少將耗盡Na+/K+-ATP酶的Src相互作用庫,從而導致Src激活。實際上,如圖14中所示,α1敲減細胞含有比對照P-11細胞更高活性Src。重要的是提到α1敲減確實引起PY-17細胞中細胞內Na+濃度的顯著升高。然而,當通過fura-2測量細胞內Ca2+時,PY-17細胞中的穩態Ca2+與P-11細胞中的相當。從而,Src活性的增加不可能是由于細胞內Na+或Ca2+的改變。

其次,當通過大鼠α1挽救α1敲減的PY-17細胞時,發明人觀察到大鼠α1的敲入足夠耗盡Src相互作用的Na+/K+-ATP酶庫,導致基礎Src活性的恢復。

第三,因為當前所述的體外結合測定法表明α1的第三個細胞內結構域與Src相互作用并抑制Src活性,發明人現在認為大鼠α1的泵缺失突變體應該能夠結合并抑制活細胞中的Src。實際上,發明人發現將大鼠α1突變體D371E敲入PY-17細胞也能夠耗盡Na+/K+-ATP酶的該Src相互作用庫并減少活性Src的量(圖15)。

另外,FRET分析和免疫共沉淀測定法表明泵缺失突變體可以與活細胞中的Src相互作用(圖16)。因為泵缺失突變體的表達不降低PY-17細胞內的細胞內Na+濃度,所以這些數據也表明Na+/K+-ATP酶可以獨立于細胞內Na+濃度的改變與Src相互作用并調控Src。

FAK涉及細胞增殖、細胞存活和細胞遷移的調節。它也是Src的效應物之一。活性Src與FAK的結合導致FAK的完全激活和FAKTyr925的酪氨酸磷酸化,其導致一些下游信號傳導分子的裝配,其中包括ERKl/2的激活。發明人發現細胞Na+/K+-ATP酶的耗盡不僅激活了Src,而且刺激了FAK的酪氨酸磷酸化。PP2對Src的抑制或者泵缺失α1突變體的敲入減少了PY-17細胞中的Tyr(P)925-FAK(圖17)。相一致的是,發明人也觀察到烏本苷刺激了對照LLC-PK1細胞中的Src和隨后刺激了FAK。這些發現是重要的。首先,它們支持如下觀點:Na+/K+-ATP酶是蛋白激酶的重要調控物。其次,Na+/K+-ATP酶對Src和Src效應物FAK的調控作用依賴于Na+/K+-ATP酶與蛋白質相互作用而不依賴泵送離子的能力。第三,α1耗盡誘導的Src激活能夠產生下游通路。發明人也注意到FAK在細胞運動性的調控中起關鍵作用并且上皮細胞中α1的耗盡影響緊密連接的形成和細胞運動性。從而,發明人現在認為α1耗盡和隨后FAK的激活在細胞遷移的調控中的作用是重要的。

烏本苷誘導的信號轉導似乎通過Src的激活啟動。因為烏本苷使用Na+/K+-ATP酶·Src復合體作為功能性受體,所以發明人現在認為Src的烏本苷誘導的激活應該與Src-相互作用的Na+/K+-ATP酶庫的大小相關。實際上,發明人發現烏本苷對Src激活的作用與Na+/K+-ATP酶的細胞水平反相關。盡管烏本苷誘導A4-11細胞中Src的適度激活,但是它不能激活PY-17細胞中的Src。因為需要Src將烏本苷信號傳遞到許多下游效應物,所以本文的實施例進一步表明a/K-ATP酶·Src復合體是烏本苷引起蛋白質信號級聯的唯一受體。這得到下面觀察的進一步支持。首先,用大鼠α1挽救PY-17細胞恢復了烏本苷對Src和ERK1/2的作用。其次,因為所挽救的細胞表達烏本苷不敏感的大鼠α1,所以需要高得多的烏本苷濃度來刺激AAC-19細胞中的Src和隨后刺激ERK1/2(圖18)。第三,發明人已經開發了用于操作細胞Na+/K+-ATP酶的有用的方案,其允許進一步表征Na+/K+-ATP酶的信號傳導性質。第四,這些新的發現表明Na+/K+-ATP酶是重要的受體,其能夠通過蛋自激酶傳遞烏本苷信號。第五,因為Src活躍地參與細胞生長的控制,本文的發明人現在表明需要再次檢查Na+/K+-ATP酶介導的對Src的抑制和烏本苷引發的對Src激活是否在癌癥生物學中起重要作用的問題。

實施例III

在圖19A-D中顯示了與Src相互作用并抑制Src的Na+/K+-ATP酶中特定結構域的進一步作圖。結果顯示含有57個氨基酸的ND1結合Src。圖19A顯示了Na+/K+-ATP酶α1和CD3結構域的方案。圖19B顯示了ND1的氨基酸序列[SEQIDNO.1][LTQNRMTVAHMWSDNQIHEADTTENQSGVSFDKTSATWLALSRIAGLCNRAVFQANQ].

圖l9C顯示了使用GST標記的α1截短物和His-Src的體外結合測定法。

圖l9D顯示了該肽在不同物種和不同同種型的Na/K-ATP酶中是保守的[SEQIDNO.2-33]。

實施例IV

圖2OA-C中顯示了與Na+/K+-ATP酶相互作用的Src中的特定結構域的進一步作圖。結果表明含有54個氨基酸的KD1結合Na+/K+-ATP酶。圖20A顯示了Src和其激酶結構域的示意性結構。圖20B顯示了來自Src的KD1肽與Na+/K+-ATP酶結合。[SEQIDNO:34]ILRLEVKLGQGCFGEVWMGTWNGTTRVAIKTLKPGTMSPEAFLQEAQVMKKLRHE].

圖20C顯示了使用GST標記的Src截短物和純化的Na+/K+-ATP酶的體外結合測定法。

實施例V

活性測定法證實ND1和KD1參與Src的Na+/K+-ATP酶介導的調控。圖21顯示Na+/K+-ATP酶的GST-NDl抑制Src活性并且該抑制效果可以被Src的GST-KDl競爭。

圖22A-B顯示ND1有效阻斷活細胞中的Src活性。ND1、ND和CD3降低LLC-PK1細胞中的Src磷酸化。圖22A顯示LLC-PK1細胞用YFP-標記的ND1、ND和CD3瞬時轉染24小時。細胞然后在RIPA緩沖液中裂解并探測pY418。也將YFP瞬時轉染到LLC-PK1細胞中作為對照。圖22B顯示了來自三個實驗的定量數據。*p<0.05。

實施例VI

NDl也抑制前列腺癌細胞(DU145)生長。圖23顯示YFP-NDl終止人前列腺癌細胞(DU145)生長。用Lipofectamine2000將2.0μgpYFP-C1或pYFP-Cl-NDl質粒轉染到LLC-PK1細胞中。48小時后,用臺盼藍染色來計數細胞數。

實施例VII

鑒定P3作為有效的Src抑制劑:ND1的作圖已經鑒定了來自ND1的20個氨基酸的肽(P-3)抑制Src。圖24A-B表明來自ND1的肽3顯著抑制Src活性。圖24A顯示了P3肽序列[SEQIDNO:2].(SATWLALSRIAGLCNRAVFQ)

圖24B顯示了當純化的Src與P-3肽在37℃溫育20分鐘并加入2mMATP額外溫育5分鐘時的結果。通過加入5X上樣緩沖液終止反應。探測pY418來測量Src激活。

圖28顯示了增強大分子的細胞膜滲透性的肽(TAT和AP)的序列。

TAT或AP與P3的綴合使得細胞膜可滲透:圖29A顯示了TAT或AP綴合的Src肽抑制劑(TAT-P3或AP-P3)的序列。圖29B顯示了新肽在體外抑制Src。圖29C顯示FITC綴合的TAT-P3被靶向至細胞膜。圖29D顯示向DU145細胞加入TAT-P3或AP-P3抑制細胞生長。

盡管本發明已經參考多種和優選的實施方案進行了描述,但是本領域技術人員應當理解可以進行多種改變并且等同方案可以替代其要素而不背離本發明的基本范圍。另外,可產生許多修改使具體的條件或材料適應本發明的教導而不脫離其基本范圍。因此,本發明旨在不限于預期用于實施本發明的本文公開的具體實施方案,而是本發明將包括落入權利要求范圍內的所有實施方案。

優選的實施方式

1.調控Src和其下游信號傳導通路的方法,其包括Src和Na+/K+-ATP酶之間的結合。

2.誘導烏本苷引起的信號轉導的受體,其包含Na+/K+-ATP酶/Src或Src家族激酶的復合體。

3.靶標,其包含Na+/K+-ATP酶和Src或Src家族激酶之間的相互作用位點。

4.藥物組合物,其用于調控涉及控制細胞生長、運動性、活性氧(ROS)的產生、por-膠原合成和肌肉收縮的多種信號傳導通路,所述組合物包含一種或多種Src和Src家族激酶抑制劑或激活劑。

5.項目4的組合物,其包含一種或多種肽或肽片段,其抑制或刺激Na+/K+-ATP酶的信號傳導功能并且不抑制Na+/K+-ATP酶的離子泵功能。

6.項目4的組合物,其中所述抑制劑不直接與ATP競爭。

7.包含Na+/K+-ATP酶或Src序列的Src抑制劑或激活劑,其干擾Src和Na+/K+-ATP酶之間的相互作用,通過與ATP類似物不同的機理發揮作用,并且是通路(Na+/K+-ATP酶)特異性的。

8.治療組合物,其包含至少一種項目7的肽Src抑制劑或激活劑。

9.開發小分子的方法,所述小分子模擬項目7的肽抑制劑或激活劑,通過與ATP類似物不同的機理發揮作用,并且是通路(Na+/K+-ATP酶)特異性的。

10.包含Na+/K+-ATP酶的信號轉導物,其介導與癌細胞生長、心臟纖維質生成、缺血/再灌注損傷、肌肉收縮或尿毒癥心肌病有關的一種或多種信號傳導通路。

11.包含在Src或Na+/K+-ATP酶α1亞基中發現的功能結構域的組合物,其中Na+/K+-ATP酶介導的對Src的抑制是由于所述α亞基或其他P型ATP酶的α亞基的N結構域和Src激酶結構域之間的相互作用。

12.項目11的組合物,其包含ND1肽,或其片段。

13.來自ND1的肽,其足夠結合Src以及其他Src家族激酶,包括但不限于Lyn,和抑制它們的活性。

14.來自Src激酶結構域(KDl)或其他Src家族激酶的類似結構域的肽,其能夠與Na+/K+-ATP酶結合并通過競爭Src的結合基序而有效激活Na+/K+-ATP酶抑制的Src。

15.肽,其用于激活或抑制Na+/K+-ATP酶通路特異性Src或Src家族激酶。

16.包含肽或其片段的Src抑制劑和/或激活劑,所述肽或其片段靶向i)與Na+/K+-ATP酶或者Src特異相互作用而不是競爭ATP結合,和ii)提供Src活性的通路特異性調節的區域。

17.各Src家族激酶的同種型特異性Src抑制劑和/或激活劑,所述激酶包括具有序列或其片段的激酶,其中使用也結合該激酶結構域的Na+/K+-ATP酶的一個或多個α亞基開發所述序列或其片段。

18.小分子,其包含項目16的同種型特異性Src抑制劑和/或激活劑。

19.用于大規模和高通量篩選的快速篩選測定法,其包括Na+/K+-ATP酶和至少一種Src或Src家族激酶之間的相互作用。

20.治療蛋白激酶相關的疾病狀態的方法,該方法包括對需要其的受試者施用治療有效量的至少一種項目3或4的組合物。

21.項目19的方法,其中所述疾病狀態涉及使用Src或Src家族激酶作為效應物的非受體酪氨酸激酶或者受體酪氨酸激酶。

22.項目19的方法,其中所述疾病狀態涉及包含Src的細胞酪氨酸激酶。

23.項目19的方法,其中所述疾病狀態包括癌癥或者腎臟或心血管相關的疾病。

24.物質的組合物,其包含:a)具有5到50個氨基酸長度的肽,該肽包含選自任一種如本文所述的肽序列的基序和b)第一種可檢測的部分,其中所述第一種可檢測的部分與該肽結合。

25.組合物,其包含圖19B中所示的序列[SEQIDNO1]或者基于該序列開發。

26.組合物,其包含圖20B中所示的序列[SEQIDNO34]或者基于該序列開發。

27.組合物,其包含圖24A中所示的肽序列[SEQIDNO2]或者基于該肽序列開發。

28.組合物,其包含Na+/K+-ATP酶和Src或Src家族激酶之間相互作用的結構信息或者基于該信息開發。

29.小分子Src抑制劑或激活劑,其被開發以靶向Na+/K+-ATP酶和Src或Src家族激酶之間的相互作用或基于該相互作用開發。

30.Src抑制劑或激活劑,其基于NA+/K+-ATP酶或其他P-ATP酶和Src或Src家族激酶之間的相互作用開發。

31.開發鑒定的Na+/K+-ATP酶/Src受體復合體的激動劑或拮抗劑的方法。

32.組合物,其包含基于Na+/K+-ATP酶/Src復合體開發的激動劑或拮抗劑。

33.治療組合物,其包含至少一種項目32的激動劑或拮抗劑。

34.對培養的細胞中操作細胞Na+/K+-ATP酶的方法,其包括用A4siRNA表達載體轉染細胞,從而降低克隆的細胞中Na/K-ATP酶的表達。

35.至少部分沉默培養的細胞中內源α1的表達的方法,其包括用A4siRNA表達載體轉染細胞,從而降低克隆的細胞中α1的表達。

36.耗盡內源Na+/K+-ATP酶而不需要使用烏本苷以迫使表達轉染的Na+/K+-ATP酶的方法,其包括使用A4siRNA以沉默來自希望的物種,包括人和豬的細胞中的α1表達。

37.包含GST-NT(氨基酸殘基6-90)[SEQIDNO51]的表達載體。

38.包含GST-CD2(氨基酸殘基152-288)[SEQIDNO52]的表達載體。

39.包含GST-CD3(氨基酸殘基350-785)[SEQIDNO53]的表達載體。

40.包含GST-H+/K+-CD3[SEQIDNO54]的構建體。

41.包含GST-SERCA-CD3[SEQIDNO55]的構建體。

42.基于siRNA的測定法,其經配置以測定Na+/K+-ATP酶的量和性質的改變對基礎的和烏本苷刺激的Src活性的影響。

43.用于測定外源的/突變的α1的信號傳導功能的α1耗盡細胞,該細胞通過用α1表達載體轉染敲減的細胞來制備,所述載體中A4siRNA靶向的序列被沉默突變,其中外源α1被敲入并且α1的表達被恢復,不僅總的細胞Na+/K+-ATP酶蛋白,而且Na+/K+-ATP酶活性都被恢復。

參考文獻

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