• / 20
  • 下載費用:30 金幣  

一種卵巢早衰非人哺乳動物模型的制備方法及其應用.pdf

關 鍵 詞:
一種 卵巢 早衰 非人 哺乳動物 模型 制備 方法 及其 應用
  專利查詢網所有資源均是用戶自行上傳分享,僅供網友學習交流,未經上傳用戶書面授權,請勿作他用。
摘要
申請專利號:

CN201210189504.3

申請日:

20120608

公開號:

CN103463629B

公開日:

20160309

當前法律狀態:

有效性:

有效

法律詳情:
IPC分類號: A61K39/00,A61K38/22,A61K49/00,A61P15/18,C07K14/72,C12N15/12 主分類號: A61K39/00,A61K38/22,A61K49/00,A61P15/18,C07K14/72,C12N15/12
申請人: 上海市計劃生育科學研究所
發明人: 孫兆貴,王健,石燕,郁琳,朱燕,蔣雅紅
地址: 200032 上海市徐匯區斜土路2140號
優先權: CN201210189504A
專利代理機構: 上海一平知識產權代理有限公司 代理人: 趙向輝;祝蓮君
PDF完整版下載: PDF下載
法律狀態
申請(專利)號:

CN201210189504.3

授權公告號:

法律狀態公告日:

法律狀態類型:

摘要

本發明提供了一種卵巢早衰非人哺乳動物模型及其制備方法,所述動物模型在篩選卵巢早衰治療藥物中的應用以及篩選卵巢早衰治療藥物的方法,和三種合成多肽以及包含所述多肽的藥物組合物。本發明的非人哺乳動物模型簡便易得,能夠用于研究性成熟前卵巢早衰的治療以及特異治療藥物的篩選。

權利要求書

1.一種卵巢早衰的非人哺乳動物模型的制備方法,其特征在于,利用衍生自FSHR的免疫原,免疫非人雌性哺乳動物得到所述卵巢早衰的非人哺乳動物模型,所述衍生自FSHR的免疫原包括選自下組的多肽:(a)序列如SEQIDNO:1、SEQIDNO:2、SEQIDNO:3或SEQIDNO:4所示的多肽。2.如權利要求1所述的方法,其特征在于,與正常的哺乳動物相比,所述哺乳動物模型血液中的雌二醇水平有統計學顯著的降低和/或FSH水平有統計學顯著的升高和/或所述哺乳動物模型的后代窩仔數有統計學顯著的降低。3.如權利要求1所述方法制備的卵巢早衰非人哺乳動物模型在篩選卵巢早衰治療藥物中的應用,其中,所述應用是非治療目的。4.一種篩選卵巢早衰治療藥物的方法,其特征在于,所述方法包括以下步驟:(a)將待測物質給予權利要求1或2所述方法制備的卵巢早衰非人哺乳動物模型;和(b)檢測所述動物模型中的雌二醇或FSH水平;如果與給予待測物質前的對照動物模型相比,給予待測物質的非人哺乳動物模型中所述雌二醇有統計學顯著的升高和/或FSH濃度有統計學顯著的降低,則待測物質是卵巢早衰治療藥物,其中,所述方法是非治療目的。5.一種多肽,其特征在于,所述多肽選自下組:(a)序列如SEQIDNO:2、SEQIDNO:3或SEQIDNO:4所示的多肽。6.權利要求5所述的多肽在制備藥物中的用途。7.一種藥物組合物,其特征在于,所述藥物組合物包含權利要求5所述的多肽以及藥學上可接受的載體。8.如權利要求7所述的藥物組合物,其特征在于,所述藥物組合物是疫苗組合物或避孕藥。9.權利要求5所述的多肽在制備模型動物的用途,其特征在于,所述模型動物是卵巢早衰非人哺乳動物模型。10.一種多核苷酸,其特征在于,所述多核苷酸編碼權利要求5所述的多肽。

說明書

技術領域

本發明涉及動物模型領域。更具體地說,本發明涉及性成熟前卵巢早衰動物模型的制備以及它們在卵巢早衰藥物開發中的應用。

背景技術

FSH是一種異二聚體糖蛋白,由腺垂體合成分泌,直接參與調控卵巢功能,包括卵泡發育與性激素的合成分泌,其調節作用通過卵泡顆粒細胞上FSH受體(FSHR)信號轉導途徑介導[1]。FSHR是一種典型的G蛋白偶聯受體,與FSH結合后,通過G蛋白介導的腺苷環化酶-環磷酸腺苷(cAMP)信號級聯反應,促進顆粒細胞中芳香化酶的合成,進而促進雌激素的合成分泌。人FSHR是由695個氨基酸(大鼠692個氨基酸)組成的一條肽鏈,其氨基末端17個氨基酸為疏水性信號肽,緊接著是由349個氨基酸(大鼠348個氨基酸)組成的胞外區,是識別結合FSH的區域;然后是由264個氨基酸組成的含有7個跨膜螺旋結構的跨膜區;最后是由羧基末端65個氨基酸(大鼠63個氨基酸)組成的胞內區,為信息傳遞所必需[2、3]。在卵泡發育過程中,顆粒細胞膜上的FSHR數量保持相對的恒定,如果FSHR功能被抑制,卵泡因發育障礙而發生異常閉鎖,從而導致卵巢功能的減退。

卵巢早衰(POF)[4]的主要臨床特征之一是患者血液中FSH水平的異常升高,提示POF患者卵巢組織對FSH的敏感性降低或消失。已有基于人群的研究證實,FSHR基因突變會導致遺傳性卵巢早衰[5]。現有技術中僅僅研究了在實驗動物體內誘導FSHR抗體對雄性小鼠生育力的影響以及遺傳修飾的POF小鼠模型[6、7]。

因此,本領域急需能夠用于研究POF且簡便易得的哺乳動物模型。

發明內容

本發明的目的在于提供一種雌性非人哺乳動物模型以及所述模型在性成熟前卵巢早衰的治療和特異治療藥物的篩選中的應用。

在第一方面,本發明提供卵巢早衰的非人哺乳動物模型的制備方法,該方法利用衍生自FSHR的免疫原,免疫非人雌性哺乳動物得到所述卵巢早衰的非人哺乳動物模型。

在優選的實施方式中,所述衍生自FSHR的免疫原包括選自下組的多肽:

(a)序列如SEQIDNO:1、SEQIDNO:2、SEQIDNO:3或SEQIDNO:4所示的多肽;

(b)包含(a)所限定的序列經過1-5個氨基酸殘基的取代、缺失或添加而形成的序列,且具有(a)所限定的多肽功能的由(a)衍生的多肽。

在優選的實施方式中,所述多肽包含(a)所限定的序列經過1-3個氨基酸殘基的取代、缺失或添加而形成的序列,且具有(a)所限定的多肽功能。

在優選的實施方式中,所述非人哺乳動物是嚙齒類動物或靈長類動物;在另一優選的實施方式中,所述非人哺乳動物是小鼠、大鼠、豚鼠、家兔或猴,優選大鼠。

在優選的實施方式中,所述免疫通過口服、含服、噴霧、經鼻腔、經皮等方式實施。

在優選的實施方式中,所述免疫進行一次或多次;優選進行三次。

在優選的實施方式中,與正常的非人哺乳動物相比,所述非人哺乳動物模型血液中的雌二醇水平有統計學顯著的降低和/或FSH水平有統計學顯著的升高和/或所述非人哺乳動物模型的后代窩仔數有統計學顯著的降低。

在優選的實施方式中,所述雌二醇水平有統計學顯著的降低是指與正常非人哺乳動物相比,所述非人哺乳動物模型血液中的雌二醇水平降低50%以上,優選50-90%,更優選70-80%。

在優選的實施方式中,所述FSH水平有統計學顯著的升高是指與正常非人哺乳動物相比,所述非人哺乳動物模型血液中的FSH水平升高20%以上,優選20%-50%,更優選30-40%。

在優選的實施方式中,所述后代窩仔數有統計學顯著的降低是指與正常非人哺乳動物相比,所述非人哺乳動物模型的窩仔數降低50%以上,優選50-90%,更優選70-80%。

在第二方面,本發明提供第一方面所述方法制備的卵巢早衰非人哺乳動物模型在篩選卵巢早衰治療藥物中的應用。

在第三方面,本發明提供篩選卵巢早衰治療藥物的方法,所述方法包括以下步驟:

(a)將待測物質給予第一方面所述方法制備的卵巢早衰非人哺乳動物模型;和

(b)檢測所述動物模型中的雌二醇或FSH水平;

如果與給予待測物質前的對照動物模型相比,給予待測物質的非人哺乳動物模型中所述雌二醇有統計學顯著的升高和/或FSH濃度有統計學顯著的降低,則待測物質是卵巢早衰治療藥物。

在優選的實施方式中,所述給予方法是口服、含服、噴霧或經皮給藥。

在第四方面,本發明提供一種多肽,所述多肽選自下組:

(a)序列如SEQIDNO:2、SEQIDNO:3或SEQIDNO:4所示的多肽;

(b)包含(a)所限定的序列經過1-5個氨基酸殘基的取代、缺失或添加而形成的序列,且具有(a)所限定的多肽功能的由(a)衍生的多肽。

在優選的實施方式中,所述多肽包含(a)所限定的序列經過1-3個氨基酸殘基的取代、缺失或添加而形成的序列,且具有(a)所限定的多肽功能。

在第五方面,本發明提供第四方面所述的多肽在制備藥物中的用途。

在優選的實施方式中,所述藥物用于影響FSH與FSHR結合;和/或

所述藥物用于治療卵巢早衰疾病;和/或

所述藥物是避孕藥。

在另一優選的實施方式中,所述的卵巢早衰疾病是因FSHR異常免疫反應所導致的,而所述藥物通過中和FSHR抗體而起治療作用。

在第六方面,本發明提供藥物組合物,所述藥物組合物包含第四方面所述的多肽以及藥學上可接受的載體。

在優選的實施方式中,所述藥物組合物是疫苗組合物或避孕藥。

在第七方面,本發明提供第四方面所述的多肽在制備模型動物的用途,所述模型動物是卵巢早衰非人哺乳動物模型。

在第八方面,本發明提供一種多核苷酸,所述多核苷酸編碼第四方面所述的多肽。

應理解,在本發明范圍內中,本發明的上述各技術特征和在下文(如實施例)中具體描述的各技術特征之間都可以互相組合,從而構成新的或優選的技術方案。限于篇幅,在此不再一一累述。

附圖說明

圖1顯示了標注出胞外區的FSHR氨基酸序列。其中,下劃線標記的氨基酸為重組表達蛋白(13-333aa)(SEQIDNO:1),紅色標記的氨基酸(1-17aa)為信號肽序列,藍色標記單獨氨基酸為合成肽序列(17-27aa(SEQIDNO:2)、182-194aa(SEQIDNO:3)、207-219aa(SEQIDNO:4)),均處于完整FSHR蛋白分子的胞外區。

圖2顯示了純化重組蛋白rFSHR經SDS/PAGE分離的考馬斯亮藍染色結果。其中M為蛋白分子量Marker(SM0671);泳道1-2為純化的重組蛋白his-rFSHR;泳道3-4為純化的重組蛋白GST-rFSHR;泳道5-6為BSA蛋白標準品。

圖3顯示了經純化的重組蛋白的Westernblotting驗證。照片A為兔抗FSHR多克隆抗體檢測結果;照片B為鼠抗his單克隆抗體檢測結果;照片C為兔抗GST多克隆抗體檢測結果。其中,泳道M為蛋白分子量Marker(SM0671);泳道1為純化的重組蛋白his-rFSHR;泳道2為純化的重組蛋白his-rFSHR;泳道3為純化的重組蛋白GST-rFSHR;泳道4為純化的重組蛋白GST-rFSHR。

圖4顯示了大鼠皮下免疫三次后血清抗體滴度水平隨日齡的變化。重組蛋白組以His-rFSHR為免疫原;合成肽組以三段合成肽混合物偶聯于KLH作為免疫原;佐劑對照組為僅僅皮下注射相應劑量的佐劑作為大鼠免疫的對照;三組均用GST-rFSHR作為包被抗原檢測血清抗體滴度。

圖5顯示了幼年大鼠經FSHR免疫后卵巢對促性腺激素的反應性。其中Con為空白對照;PMSG為未經免疫處理的同齡大鼠經過PSMG處理后的卵巢反應,作為免疫影響PMSG反應性的對照;rFSHR+PMSG為顯示FSHR免疫反應對卵巢PMSG反應的影響的實驗組。縱坐標表示卵巢重量,或者大鼠體重。各組之間進行t檢驗,發現rFSHR+PMSG組的卵巢的反應性,相對PMSG組(p=0.000)和Con組(p=0.027)均差異顯著(p<0.01)。

圖6顯示了經過FSHR免疫的大鼠抗血清特異結合于卵母細胞-復合體。利用FSHR免疫原常規免疫大鼠,獲得免疫血清。通過常規熒光免疫檢測,觀察其中的特異抗體對大鼠卵母細胞-卵丘復合體上FSHR的識別情況。其中圖片A為不加抗血清的免疫對照;B為佐劑組大鼠的血清;C為合成多肽作為免疫原的大鼠抗血清;D為以重組表達His-FSHR為免疫原的大鼠抗血清。

具體實施方式

發明人經過廣泛而深入的研究,人工制備了大鼠FSHR的重組多肽和三個人工合成多肽,出乎意料地發現通過皮下免疫后能獲得血液中含有高水平FSHR抗體的大鼠,大鼠血液中FSHR抗體可以和卵巢顆粒細胞上的FSHR特異結合,導致其對FSH反應性降低,進而引發大鼠出現卵巢早衰的癥狀;發明人還出乎意料地發現本發明的多肽還能與自身FSHR抗體特異性結合,從而降低自身FSHR抗體的水平,進而用于治療FSHR異常免疫反應導致的卵巢早衰等疾病。在此基礎上完成了本發明。

哺乳動物

本文所用的術語“哺乳動物”指非人雌性哺乳動物,包括嚙齒類動物和靈長類動物。在具體的實施方式中,所述非人哺乳動物是小鼠、大鼠、豚鼠、家兔或猴。在優選的實施方式中,所述非人哺乳動物包括大鼠和小鼠。在更優選的實施方式中,所述非人哺乳動物是大鼠。

模型動物的制備方法

本發明通過對FSHR分子結構的生物信息學分析,克隆其胞外區片段,構建原核表達質粒進行表達純化,并合成三段可能與配體FSH結合的多肽。

用所得重組蛋白rFSHR和人工合成多肽主動免疫雌性非人哺乳動物后,該動物的血液中產生高滴度水平的抗體,進而檢測到該動物的動情周期紊亂、發情期縮短、血液FSH水平上升、而血液雌激素水平降低。所述動物血液中FSHR抗體可以和卵巢顆粒細胞上的FSHR特異結合,導致其對促性腺激素的反應性降低,進而引發卵巢早衰癥狀的出現,從而得到卵巢早衰的動物模型。

在具體的實施方式中,所述免疫可進行一次或多次。在優選的實施方式中,所述免疫進行三次。

模型動物的用途

本發明的動物模型可用于研究哺乳動物的性成熟前卵巢早衰,確定治療方案并用于特異治療藥物的篩選。

本發明的多肽

本發明所用的術語“多肽”具有本領域普通技術人員熟知的含義。

在優選的實施方式中,本發明的多肽包括序列如SEQIDNO:1、SEQIDNO:2、SEQIDNO:3或SEQIDNO:4所示的多肽。

本發明的多肽還包括所包含的序列是SEQIDNO:IDNO:1、SEQIDNO:2、SEQIDNO:3或SEQIDNO:4所示序列經過1-5個氨基酸殘基,優選1-3個氨基酸殘基的取代、缺失或添加而形成的序列,且具有所需功能的衍生多肽。

本領域普通技術人員知道,一般在多肽的非必要區域改變少數個氨基酸殘基基本上不會改變生物活性,即,適當替換氨基酸得到的序列并不影響其活性(可參見Watson等,MolecularBiologyofTheGene,第四版,1987,TheBenjamin/CummingsPub.Co.P224)。本領域技術人員不難實施這種替換并且能確保所得分子的生物活性不改變。

在本發明中,優選的“衍生多肽”指與上述多肽的氨基酸序列(如SEQIDNO:2、3或4)相比,有至多5個,較佳地至多3個,更佳地至多2個,最佳地至多1個氨基酸被性質相似或相近的氨基酸所替換而形成多肽。這些保守性變異多肽最好根據下表進行氨基酸替換而產生。

最初的殘基 代表性的取代 優選的取代 Ala (A) Val;Leu;Ile Val Arg (R) Lys;Gln;Asn Lys Asn (N) Gln;His;Lys;Arg Gln Asp (D) Glu Glu Cys (C) Ser Ser Gln (Q) Asn Asn Glu (E) Asp Asp Gly (G) Pro;Ala Ala His (H) Asn;Gln;Lys;Arg Arg Ile (I) Leu;Val;Met;Ala;Phe Leu Leu (L) Ile;Val;Met;Ala;Phe Ile Lys (K) Arg;Gln;Asn Arg

Met(M) Leu;Phe;Ile Leu Phe(F) Leu;Val;Ile;Ala;Tyr Leu Pro(P) Ala Ala Ser(S) Thr Thr Thr(T) Ser Ser Trp(W) Tyr;Phe Tyr Tyr(Y) Trp;Phe;Thr;Ser Phe Val(V) Ile;Leu;Met;Phe;Ala Leu

本發明還提供了編碼本發明多肽的多核苷酸。術語“編碼多肽的多核苷酸”可以是包括編碼此多肽的多核苷酸,也可以是還包括附加編碼和/或非編碼序列的多核苷酸。

因此,本文所用的“含有”,“具有”或“包括”包括了“包含”、“主要由……構成”、“基本上由……構成”、和“由……構成”;“主要由……構成”、“基本上由……構成”和“由……構成”屬于“含有”、“具有”或“包括”的下位概念。

本發明多肽的用途

本發明的多肽能在哺乳動物體內產生FSHR抗體,從而能抑制哺乳動物中FSHR的功能,進而用作避孕藥。

對于具有自身FSHR抗體的哺乳動物而言,本發明的多肽不會重復引發免疫應答,但卻仍能與自身FSHR抗體結合,因此,本發明的多肽還能中和FSHR異常免疫反應導致的血液FSHR抗體,即,降低自身抗體的濃度,進而通過中和FSHR異常免疫反應導致的血液FSHR抗體來治療FSHR異常免疫反應導致的卵巢早衰等疾病。

本發明的優點:

1.本發明的人工合成多肽能夠在大鼠體內產生高滴度水平的特異性抗FSHR抗體,進而觀察大鼠發情周期、血液FSH及雌激素水平的變化情況。本發明的哺乳動物模型制備方法簡便,得到的動物模型能夠用于研究性成熟前卵巢早衰的治療以及特異治療藥物的篩選;

2.本發明的多肽可抑制哺乳動物中FSHR的功能,從而可用作避孕藥;

3.本發明的多肽還能中和FSHR異常免疫反應導致的血液FSHR抗體,從而可以治療FSHR異常免疫反應導致的卵巢早衰等疾病。

下面結合具體實施例,進一步闡述本發明。應理解,這些實施例僅用于說明本發明而不用于限制本發明的范圍。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法,通常按照常規條件,或按照制造廠商所建議的條件。除非另外說明,否則百分比和份數按重量計算。

本發明所用的具體材料與方法

1.實驗動物與飼養條件

SPF級4周齡SD雌性大鼠,體重45±5g,購自上海西普爾-必凱實驗動物有限責任公司(許可證號碼:SCXK(滬)2008-0016)。飼養于上海市計劃生育科學研究所嚙齒類實驗動物房。飼養環境溫度控制在24±2℃,相對濕度40-50%,飼喂顆粒料,自由飲水。

2.主要試劑

各種限制性內切酶、DNA連接酶、逆轉錄酶(D2680A)及高保真酶(DR010)均購自Takara公司;離心柱型質粒小抽試劑盒及PCR產物回收試劑盒購自北京天為時代生物公司;DH5α感受態及DE3感受態購自上海萊楓生物公司;兔抗FSHR多克隆抗體購自上海滬尚生物科技公司;兔抗GST和beta-actin多克隆抗體購自上海康為世紀公司;HRP標記的羊抗兔-IgG(H+L)二抗及Trizol購自Invitrogen公司;ELISA檢測用TMB(貨號860336)購自Sigma公司,HRP標記的驢抗兔-IgG(H+L)及HRP標記的驢抗大鼠-IgG(H+L)二抗購自PTG公司;蛋白分子量Marker(SM0671)購自上海麥約爾生物技術有限公司;弗氏佐劑購自Sigma公司,FSH測定ELISA試劑盒購自上海逸峰生物科技有限公司。質粒pET-28a(+)(購自Novagen公司,美國)和pGEX4T-3(購自AmeshamPharmaciaBiotech公司,美國)均為本實驗室保存。

3.大鼠主動免疫用FSHR抗原的制備

3.1大鼠FSHR胞外區片段的重組表達與抗原制備

用Trizol試劑提取SD大鼠卵巢組織總RNA,分光光度計測定A260和A280。取1μg總RNA為模板,按42℃,30min的反應條件反轉錄為cDNA(逆轉錄酶購自Takara公司),72℃維持10min滅活逆轉錄酶,冰浴3min后cNDA產物于-20℃保存。以自行設計的rFSHR引物:正向引物F,5’GGTGGATCCTTTCTCTGCCAAGACAGCAA3’(SEQIDNO:5);反向引物,5’GATCTCGAGTTTGGTGAGCAGGTCACATC3’(SEQIDNO:6),擴增FSHR胞外區片段,對應13-333位氨基酸殘基。取1μL以上cDNA為模板,用高保真酶(DR010,Takara公司)通過PCR獲取目標cDNA片段,反應條件為:98℃,15sec;[98℃,10sec;60℃,15sec;72℃,40sec]30個循環;72℃,10min;4℃,10min。PCR反應產物經1.2%瓊脂糖電泳分離獲取rFSHR片段,用限制性內切酶BamHI和XhoI雙酶切,接入載體pGEX4T-3或pET-28a(+)質粒,構建重組表達質粒,經DNA序列測定,核實構建的質粒序列及閱讀框正確。

測序正確的重組表達質粒(pGEX4T-3-rFSHR-ECD和pET-28a(+)-rFSHR-ECD)轉化大腸桿菌DE3感受態菌,以表達FSHR的保外區段(ECD)的GST或His標記的融合蛋白。當細菌濃度達到A600為0.8-1.0,加IPTG至終濃度1mmol/L誘導表達4h,以獲取最佳的表達量。然后于4℃,6000rpm離心10min,收集菌體以備分離重組表達蛋白。

每克濕菌體加入5ml裂解緩沖液(50mMTris-HCl(pH8.0),100mMNaCl,1mMEDTA,0.1mMPMSF)重懸收集的菌體,冰上超聲(寧波新芝生物科技股份有限公司),按超聲20s,間隔40s,循環20次,功率維持在約200w,以裂解菌體。經4℃,10000g離心10min,取沉淀以獲取包涵體。包涵體經洗滌,用含7M尿素的裂解液重懸,冰上超聲,離心取包涵體的裂解上清液。加入6×上樣緩沖液,于沸水中煮5min,離心去除沉淀物。

利用制備電泳,自包涵體裂解液分離重組蛋白。將經0.25M的KCl浸染顯示的蛋白條帶切下后裝入處理好的透析袋中,加入6ml生理鹽水,置于DNA電泳槽中,以0.1×蛋白電泳緩沖液電泳,恒定電壓100V,電泳約3h,以游離重組蛋白。電泳完畢,取出透析袋內蛋白凝膠,保留其中的液體,對600ml緩沖液(5mMTris-Cl(pH8.0),0.9%NaCl,0.1mMPMSF)透析3次,每次2h,以去除蛋白溶液中的電泳液等成分。經透析的重組蛋白溶液,通過超濾濃縮,以作為免疫或檢測用抗原。獲取的重組蛋白經SDS-PAGE電泳鑒定,并參照蛋白標準,經考馬斯亮藍染色后定量。獲取的重組蛋白His-rFSHR作為免疫原,而GST-rFSHR作為檢測抗原。

3.2FSHR配體結合部位免疫原性多肽預測與合成

利用BepiPred1.0Server軟件,預測獲得可能具有免疫原性的3條多肽:(1)C-17DSKVTEIPTDL27(SEQIDNO:2);(2)182NLSDNNNLEELPN194-C(SEQIDNO:3);(3)C-207DISRTKVHSLPNH219(SEQIDNO:4)。為了下一步免疫,多肽片段在合成時在氨基末端或羧基末端加入甲硫氨酸(含-SH)。各多肽委托北京康為世紀生物科技有限公司合成,以與載體蛋白KLH連接作為免疫原,與BSA連接作為檢測抗原。

4.SD大鼠免疫程序

取雌性SD大鼠,于28日齡進行初次免疫免疫。將抗原用生理鹽水稀釋,與等體積的佐劑混合,充分乳化,注射體積為150μl/只,腹部皮下多點注射主動免疫。在不同的時間節點免疫,共3次。初次免疫使用完全弗氏佐劑,抗原劑量為500μg蛋白/只大鼠。第2次免疫于初次免疫后第14天,即42日齡進行,改用不完全弗氏佐劑,抗原劑量為200μg蛋白/只;第3次免疫于第2次免疫后第10天,52日齡進行,佐劑和劑量同2次免疫。

5.ELISA檢測血清FSHR抗體滴度

于第3次免疫后1周,即59日齡時,經舌下靜脈取血0.1ml,37℃溫育1h,4℃靜置過夜,1500rpm、4℃離心30min分離血清,用于抗體滴度檢測。每經過7天取血1次,監測抗體水平變化情況,持續6周。

重組表達的GST融合蛋白GST-rFSHR,經純化,溶于包被液,配成10μg/ml的終濃度,按每孔100μl蛋白溶液,加入96孔酶標板(上海萃華生物科技有限公司),放入濕盒,于4℃包被過夜,棄去包被液,PBS-Tween20洗滌3次,完成抗原包被。加入封閉液200μl/孔,37℃溫育1h。棄去封閉液,加入PBS-Tween20洗滌液200μl/孔,搖床輕輕搖動3min后,甩干洗滌液,在草紙上拍干,洗滌3次,以除去未能結合的抗原蛋白;每孔加已稀釋的待測抗大鼠血清100μl/孔,放入濕盒,于37℃溫育1h,同時以適當稀釋的兔源抗大鼠FSHR兔多抗作為陽性對照。經過常規洗滌后,分別用過氧化物酶標的驢源抗大鼠IgG(H+L)多抗(PTG公司)和過氧化物酶標的驢源抗兔IgG(H+L)多抗(PTG公司)作為二抗,檢測實驗大鼠血清中的抗FSHR抗體和陽性對照的兔源抗FSHR抗體的濃度。添加二抗溶液,于37℃溫育反應1h,經過洗滌,加入底物進行顯色反應。每孔加入100μl新鮮配制的底物溶液(取9.8ml磷酸-檸檬酸溶液,pH5.0,依次加入0.2ml的5mg/mlTMB,和10μl30%(V/V)H2O2,混勻即刻使用),再置于濕盒中,于37℃溫育20min。每孔加50μl反應中止液,即2M硫酸終止反應。用酶標儀ELx-800(BIO-TEKinstrumentsInc.)測定A450值,以計算抗體滴度。將抗體滴度定義為實驗組和陰性對照組(未免疫血清)光吸收比值≥2.0時最大的血清稀釋倍數。

6.rFSHR主動免疫大鼠血清抗體對卵母細胞-卵丘復合體FSHR的識別

頸椎脫臼法處死5周齡的雌性SD大鼠,取出卵巢,解剖鏡下分離卵丘復合體。用口吸管吸取卵丘復合體,放入200μl含4%多聚甲醛的96孔板(圓底)中,室溫固定40min,然后將卵丘復合體轉移至200μl透膜液(含0.3%BSA、0.1%TritonX-100的PBS)中4℃過夜,使抗體容易透過細胞膜進入顆粒層細胞和卵細胞內。透膜后的卵丘復合體經三次洗滌(洗滌液:0.01%TritonX-100的PBS)后,轉移至200μl封閉液(0.3%BSA、150mM甘氨酸的PBS)中,在37℃條件下,封閉40min;然后加入200μl用封閉液按1:50稀釋的大鼠抗血清中,37℃下,孵育40min。大鼠抗血清一抗結合后的卵丘復合體,經洗滌液洗滌三次后,加入200μl用封閉液按1:50稀釋FITC-羊抗大鼠IgG(H+L)(PTG公司,SA00003-11)二抗中,37℃條件下,在暗盒中孵育40min,然后經洗滌三次后,轉移至200μlDAPI染液中,室溫條件下染5min;洗滌三次,將卵丘復合體用抗熒光淬滅封片液(上海碧云天生物技術有限公司,P0173-3)封片,共聚焦顯微鏡下觀察。

7.動情周期檢測和發情期血液激素水平檢測

第3次免疫后第7周,即從約100日齡開始,陰道涂片檢查大鼠動情周期。每日早上8:30,翻起大鼠尾巴,露出陰道口,用滅菌的圓頭玻璃棒,輕輕插入陰道10毫米處,順時針緩慢轉動一圈,慢慢將玻璃棒抽出,將黏液均勻涂在已加滅菌水的載玻片上。一般涂片檢查持續3個周期以上,計算發情的頻率。接下來,檢查到發情期的當日上午10:30左右,在大鼠舌下靜脈取血1.2ml,分離血漿用于FSH、雌激素及孕激素水平的測定。

利用雌二醇和孕酮診斷試劑盒(電化學發光法,德國羅氏診斷有限公司),按照試劑盒使用說明書,在羅氏2010電化學發光免疫分析儀上測定大鼠血漿E2和P4濃度。血漿FSH水平,通過ELISA試劑盒(上海逸峰生物科技有限公司)檢測,參照說明書,在酶標儀ELx-800(BIO-TEKinstrumentsInc.)上測定。血漿E2,P4和FSH測定的批內和批間變異系數均<10%。

8.His-rFSH免疫幼年大鼠后卵巢對促性腺激素的反應性檢測

取周齡21日齡雌性SD大鼠分成3組。其中重組蛋白免疫組和免疫對照組分別為6只和4只,另取4只同齡大鼠作為空白對照。重組蛋白組進行免疫,第一次使用完全佐劑,免疫原his-rFSHR劑量為200μg蛋白/只大鼠,第二次免疫(4周齡,28日齡)使用不完全弗氏佐劑,免疫原劑量為200μg蛋白/只大鼠。第二次免疫后第3天(31日齡)上午舌下取血0.1ml,ELISA檢測抗血清滴度。重組蛋白組6只(滴度均高于8000倍稀釋度)。同時取4只大鼠作為對照組。于32日齡的下午13:00,腹腔注射PMSG(寧波第二激素廠)15IU/大鼠[8-10],注射后24h(33日齡)頸椎脫臼法處死分離卵巢,解剖鏡下觀察卵巢卵泡情況,稱量大鼠體重和卵巢重量。

9.rFSHR主動免疫雌性大鼠生育力的檢測

取第3次免疫后血清針對FSHR的抗體維持高滴度,至94日齡,陰道涂片查發情周期,發情期(10:30am)取血測定激素水平,然后與正常的成年雄性大鼠交配,觀察生育后代的情況。記錄窩仔數,出生后28日仔鼠平均體重,仔鼠性別比(以雌性數目作為100,求得男性的相當值,作為性別比),妊娠天數,母鼠體重(分娩后28日)。

10.統計學分析方法

觀察和檢測各指標,記錄有關的數據,以各指標作為變量,FSHR主動免疫實驗組和佐劑對照的數據,填入Excel表格中。然后把有關數據導入SPSS18.0統計軟件(SPSSInc.,Chicago,IL),繪制有關柱狀圖和獲得有關表格。根據數據類型和分布情況,選擇t檢驗或Mann-WhitneyU檢驗,獲得均值和標準差,以及顯著性指標p值。差異顯著性水平選擇p<0.05。

實施例

實施例1.針對FSHR胞外區的免疫原的制備

我們克隆大鼠FSHR胞外區的對應cDNA序列,構建細菌重組表達質粒,分別表達大鼠FSH受體(rFSHR)胞外區段的重組蛋白GST-rFSHR和his-rFSHR。在DE3表達菌中大鼠FSH受體(rFSHR)的重組蛋白GST-rFSHR和his-rFSHR主要以包涵體形式表達,經過洗滌包涵體、制備型電泳切膠及在超濾管中超濾純化,SDS/PAGE和考馬斯亮藍染色驗證,獲得足夠量并且純度較高的蛋白(圖2)。同時,分別用標簽抗體(兔抗GST多克隆抗體和小鼠抗his單克隆抗體)和特異性的兔抗FSHR多克隆抗體對純化蛋白進行了westernblot驗證(圖3)。同時,通過抗原反應性預測,3段多肽序列,通過化學合成獲得各段肽,與KLH偶聯作為免疫抗原,與BSA偶聯作為檢測抗原。各種合成肽的抗原經過純化,SDS/PAGE電泳檢測檢測發現呈現單一條帶,適合進行動物免疫和抗體檢測。

實施例2.ELISA檢測免疫大鼠抗血清中的FSHR抗體滴度

大鼠免疫3次后7天舌下靜脈取血約0.1ml,分離抗血清。酶標板用純化的蛋白GST-rFSHR包被,每孔抗原含量為1μg。檢測主動免疫大鼠血清的抗體滴度。合成肽組和佐劑對照組以1:200稀釋倍比開始,重組蛋白組從1:2000稀釋倍比開始,通過免疫檢測反應的A450值測定,計算相應血清的抗體滴度。連續檢測測六周的血清抗體滴度,發現抗血清滴度水平維持在相當高的水平。由圖-5可見,52日齡最后一次免疫后,重組蛋白免疫組血清抗體滴度的維持在1/520000;而合成肽免疫組的抗體滴度維持在1/10000左右,持續至日齡94天,而佐劑對照組的血清滴度大約在1/200的較低水平。

實施例3.rFSHR主動免疫大鼠血清抗體識別卵母細胞-卵丘復合體FSHR

由圖6可以看出,經過針對FSHR人工免疫,在大鼠的血清中產生的抗體可以在離體情況下與卵母細胞-卵丘復合體結合。不添加抗血清,則沒有熒光出現,表明抗體反應熒光檢測系統可以特異呈現FSHR抗體和細胞上FSHR的結合(圖6,圖片A)。佐劑免疫對照組,可能天然含有少量FSHR抗體,呈現少量的熒光(圖6,圖片B)。合成肽抗原免疫重組的熒光出現明顯的熒光,但相對重組蛋白抗原免疫熒光信號較弱(圖6,圖片C)。重組表達蛋白作為免疫原來源的抗血清,產生的熒光最強,表明其中抗體的效價更高(圖6,圖片D)。

實施例4.檢測重組FSHR胞外區主動免疫對大鼠動情周期與血液激素水平的影響

從表1可以看出,28日齡大鼠經過三次以重組His-rFSHR作為免疫原的免疫過程后,檢測大鼠的動情周期和血液激素水平,發現發情頻率和血液孕酮(P4)水平與佐劑對照組比較變化差異不顯著,而雌激素(E2)和FSH濃度和對照比較,均出現顯著的差異(p<0.05)。其中,發情頻率的均值略有降低,P4水平略有升高;E2水平顯著降低,而FSH水平顯著升高。

表1.重組蛋白免疫對雌性大鼠動情周期和血液激素水平的影響

注:*標注表示重組蛋白免疫組和對照組間的比較通過t檢驗差異顯著(p<0.05)。

實施例5.檢測rFSHR主動免疫對卵巢的PMSG反應性的影響

從表2可以看出,21周齡的大鼠經過rFSHR免疫后,觀察其卵巢重量相應促性腺激素PMSG刺激出現的變化,發現與未經免疫的對照組比較,卵巢重量呈現顯著變小;同時大鼠體重伴隨顯著降低。同時,rFSHR免疫大鼠雖然體重較輕(p=0.027),但是經PMSG刺激的卵巢重量與空白對照組相比顯著升高(p=0.006)。

表2.FSHR免疫21周齡大鼠后卵巢對促性腺激素的反應性的影響

注:*標注表示重組蛋白免疫組PMSG和佐劑免疫對照注射PMSG組的比較通過t檢驗差異顯著(p<0.01)。

實施例6.檢測FSHR作為免疫原主動免疫對雌性大鼠生育力的影響

雌性大鼠經過3次免疫,母鼠血液中維持高水平的FSHR抗體。于94日齡,同成年雄鼠交配,生育后代在這種情況下,與正常的成年雄性大鼠交配,生育后代的窩仔數與對照比較,呈現顯著降低;而出生后28日仔鼠平均體重,仔鼠性別比,妊娠天數,母鼠體重等均沒有差異顯著性,如表3。

表3重組蛋白免疫對雌性大鼠生殖后代的影響

注:*標注表示重組蛋白免疫組和對照組間比較通過t檢驗獲得p值,假設方差相等,雙邊截尾。灰色標記出呈現顯著差異的指標(p<0.01)。

結論

無論合成肽抗原還是重組表達抗原都能夠引起實驗動物產生高水平血清抗體。在本研究中,合成肽和重組蛋白免疫后的抗血清,以GST-rFSHR為包被抗原檢測,合成肽組滴度(約1萬倍稀釋)低于重組蛋白組(約50萬倍稀釋);以合成肽-BSA為包被抗原,合成肽組抗血清滴度可達5萬到20萬(結果未顯示),達到較高水平,而重組蛋白組抗血清僅對三段合成肽中其中某一片段產生較低水平滴度(約1萬倍稀釋)。

Ghosalkar等用合成的大鼠285-309多肽免疫雄兔,抗血清能與大鼠卵巢的顆粒細胞結合,Lindau-Shepard等的研究顯示針對人FSHR的單抗可以識別天然FSHR。在我們的研究中,針對大鼠蛋白序列的重組表達蛋白His-rFSHR和合成肽,能夠通過皮下免疫,生成高水平的抗體,其能夠結合大鼠卵泡顆粒細胞上自然狀態的FSHR,并且重組蛋白組中顯示抗體結合量的免疫熒光強度高于合成肽組。

免疫大鼠導致高滴度的血清抗體生成,與佐劑對照組比較,發現血液中E2水平顯著降低,而FSH水平顯著升高,這與卵巢早衰的實驗室檢查結果一致。說明我們通過人工免疫反應,可以導致大鼠出現與臨床卵巢早衰激素變化類似的變化。

孕馬血清促性腺激素(PMSG),也稱馬絨毛膜促性腺激素,由妊娠早期母馬子宮內膜杯狀結構所分泌。PMSG是糖蛋白激素中唯一而獨特的促性腺激素,同一分子中具有黃體生成素(LH)和促卵泡生成素(FSH)兩種促性腺激素的活性,主要用于促進母畜卵巢卵泡發育、成熟。在本研究中,通過檢測卵巢對促性腺激素PMSG的反應性,我們發現經過免疫的大鼠卵巢對PMSG反應性減弱。說明免疫反應產生的針對FSHR胞外區段的抗體可以結合卵巢顆粒細胞上的FSHR,阻礙其與外源性促性腺激素PMSG結合,阻礙PMSG促進顆粒細胞增殖,結果導致卵巢體積與對照相比明顯變小。進而,卵巢的顆粒細胞因為FSHR的功能障礙而導致卵泡發育出現障礙,影響其產生卵母細胞的數量和質量,引起雌性大鼠生育力下降。

總之,我們通過人工制備大鼠的FSHR免疫原,通過皮下免疫,獲得血液中含有高水平FSHR抗體的大鼠。其中的抗體可以和卵巢顆粒細胞上的FSHR結合,導致其對FSH反應性降低,進而引發大鼠出現卵巢早衰的癥狀。

在本發明提及的所有文獻都在本申請中引用作為參考,就如同每一篇文獻被單獨引用作為參考那樣。此外應理解,在閱讀了本發明的上述講授內容之后,本領域技術人員可以對本發明作各種改動或修改,這些等價形式同樣落于本申請所附權利要求書所限定的范圍。

參考文獻

[1]LevalletJ,PakarinenP,HuhtaniemiIT.Follicle-stimulatinghormoneligandandreceptormutations,andgonadaldysfunction.ArchMedRes,1999,30(6):486-94.

[2]GromollJ,PekelE,NieschlagE.Thestructureandorganizationofthehumanfollicle-stimulatinghormonereceptor(FSHR)gene.Genomics,1996,35(2):308-11.

[3]TaoYX,MizrachiD,SegaloffDL.ChimerasoftheratandhumanFSHreceptors(FSHRs)identifyresiduesthatpermitorsuppresstransmembrane6mutation-inducedconstitutiveactivationoftheFSHRviarearrangementsofhydrophobicinteractionsbetweenhelices6and7.MolEndocrinol,2002,16(8):1881-92.

[4]VegettiW,MarozziA,ManfrediniE,etal.Prematureovarianfailure.MolCellEndocrinol,2000,161(1-2):53-7.

[5]Christin-MaitreS,VasseurC,PortnoiMF,etal.Genesandprematureovarianfailure.MolCellEndocrinol,1998,145(1-2):75-80.

[6]JagarlamudiK,ReddyP,AdhikariD,etal.Geneticallymodifiedmousemodelsforprematureovarianfailure(POF).MolCellEndocrinol,315(1-2):1-10.

[7]YangLH,LiJT,YanP,etal.Follicle-stimulatinghormonereceptor(FSHR)-derivedpeptidevaccineinducedinfertilityinmicewithoutpathologicaleffectonreproductiveorgans.ReprodFertilDev,23(4):544-50.

[8]張春燕,劉麗均,芮榮.不同劑量孕馬血清促性腺激素(PMSG)對未成年大鼠超數排卵效果與質量的影響.《中國比較醫學雜志》,2007,17(6):338-40.

[9]YANGJGZ,SUNZG,TSOJiaKe.Ratoocytesinearlytertiaryfolliclescanattainappropriatematurationincombinationculturesystem.ActaBiolExpSin,2005,38(5):432-40.

[10]PopovaE,KrivokharchenkoA,GantenD,etal.ComparisonbetweenPMSG-andFSH-inducedsuperovulationforthegenerationoftransgenicrats.MolReprodDev,2002,63(2):177-82.

關于本文
本文標題:一種卵巢早衰非人哺乳動物模型的制備方法及其應用.pdf
鏈接地址:http://www.rgyfuv.icu/p-6973819.html
關于我們 - 網站聲明 - 網站地圖 - 資源地圖 - 友情鏈接 - 網站客服 - 聯系我們

[email protected] 2017-2018 zhuanlichaxun.net網站版權所有
經營許可證編號:粵ICP備17046363號-1 
 


收起
展開
山东11选5中奖结果走势图