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2(4羥基苯亞胺基)5(3甲氧基4羥基苯亞甲基)4噻唑烷酮的制抗腫瘤藥應用.pdf

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羥基 胺基 甲氧基 甲基 噻唑 腫瘤 應用
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摘要
申請專利號:

CN201210439863.X

申請日:

20121106

公開號:

CN102920700A

公開日:

20130213

當前法律狀態:

有效性:

失效

法律詳情:
IPC分類號: A61K31/426,A61P35/00 主分類號: A61K31/426,A61P35/00
申請人: 山東大學
發明人: 閆兵,李麗文,周宏鈺,穆慶鑫,劉雪姣,孫海南,賈建博,張斌
地址: 250100 山東省濟南市歷城區山大南路27號
優先權: CN201210439863A
專利代理機構: 濟南金迪知識產權代理有限公司 代理人: 王緒銀
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法律狀態
申請(專利)號:

CN201210439863.X

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法律狀態公告日:

法律狀態類型:

摘要

本發明公開了化合物2-(4-羥基苯亞胺基)-5-(3-甲氧基-4-羥基苯亞甲基)-4-噻唑烷酮在制備抗橫紋肌肉瘤藥物中的應用;其中所述化合物在0.65μM即可引起胚胎型橫紋肌肉瘤RD細胞50%的存活抑制效果,并在5.0μM即引起顯著的RD細胞周期阻滯并誘導凋亡,而且該化合物對正常的成肌細胞LHCN-M2的毒性很低。預示本發明化合物有望成為橫紋肌肉瘤的主要類型胚胎型橫紋肌肉瘤的有效抗癌藥物,具有良好的開發應用前景。

權利要求書

1.2-(4-羥基苯亞胺基)-5-(3-甲氧基-4-羥基苯亞甲基)-4-噻唑烷酮在制備抗橫紋肌肉瘤藥物中的應用。?2.如權利要求1所述的應用,其特征在于:所述橫紋肌肉瘤是胚胎型橫紋肌肉瘤。?3.如權利要求1或2所述的應用,其特征在于:所述化合物2-(4-羥基苯亞胺基)-5-(3-甲氧基-4-羥基苯亞甲基)-4-噻唑烷酮能有效抑制橫紋肌肉瘤細胞生長IC濃度是0.65μM。?4.如權利要求1或2所述的應用,其特征在于:所述化合物2-(4-羥基苯亞胺基)-5-(3-甲氧基-4-羥基苯亞甲基)-4-噻唑烷酮能引起人體胚胎型橫紋肌肉瘤RD細胞顯著細胞周期阻滯和細胞凋亡的濃度為5.0μM。?

說明書

技術領域

本發明涉及一種噻唑烷酮衍生物在制備抗橫紋肌肉瘤藥物中的應用,尤其涉及一種2-(4-羥基苯亞胺基)-5-(3-甲氧基-4-羥基苯亞甲基)-4-噻唑烷酮在制備抗橫紋肌肉瘤藥物中的應用。?

背景技術

橫紋肌肉瘤發生率居軟組織肉瘤的第三位,分位胚胎型,腺泡型和多形性三種。其中,胚胎型橫紋肌肉瘤約占橫紋肌肉瘤的2/3比例,其多發于8歲前的兒童。由于橫紋肌肉瘤為肌肉細胞的癌變,這種細胞為全身性分布,所以身體各個部位都可發病,增加了它的治療難度。?

目前治療橫紋肌肉瘤的方法主要包括藥物化療、外科切除以及放射治療,但對于一些無法廣泛切除的橫紋肌肉瘤,只能依靠化療和放療的手段進行治療。臨床上用于治療胚胎型橫紋肌肉瘤的主要藥物是長春新堿和更生霉素。但治療效果不確定且治療同時也存在著嚴重的不良發應,需要開發新的療效穩定又毒副作用小的抗癌藥物。?

噻唑烷酮類化合物是一類重要的雜環類化合物。在已上市的藥物中,含有兩個羰基的噻唑烷二酮類化合物作為口服降血糖藥物。另外,研究發現2、4、5位含有羰基的噻唑烷酮類化合物具有抗菌抗感染抗病毒抗炎癥等多種生物效應。近年來,噻唑烷酮的抗癌活性也引起了人們的注意,其中以4-噻唑烷酮在抗腫瘤方面的研究較為廣泛。早期的研究報道,4-噻唑環核心結構的化合物具有明顯的選擇性殺死耐藥性癌細胞尤其是肺癌細胞,并誘導細胞凋亡,而對正常細胞無抑制損傷作用。然而,2-(4-羥基苯亞胺基)-5-(3-甲氧基-4-羥基苯亞甲基)-4-噻唑烷酮這個新型的噻唑烷酮衍生物在治療橫紋肌肉瘤方面的藥理作用研究和應用,經權威機構檢索查新,目前國內外尚未見報到。?

因此,研究和開發抗橫紋肌肉瘤的噻唑烷酮衍生物藥物具有極其重要的意義。?

發明內容

針對目前臨床對橫紋肌肉瘤治療需求,本發明的目的在于提供一個新型噻唑烷酮衍生物即2-(4-羥基苯亞胺基)-5-(3-甲氧基-4-羥基苯亞甲基)-4-噻唑烷酮在制備抗橫紋肌肉瘤藥物中的應用。?

本發明利用組合化學和藥物化學方法,合成了一類4-噻唑烷酮類化合物的衍生物,運用橫紋肌肉瘤細胞作為主要篩選模型,將所述化合物對人體胚胎型橫紋肌肉瘤RD細胞進行體外高通量篩選,得到了一個能夠有效降低RD細胞存活率的化合物2-(4-羥基苯亞胺基)-5-(3-甲氧基-4-羥基苯亞甲基)-4-噻唑烷酮。經研究證實該化合物能夠特異性抑制微管聚合和Dyrk1B激酶活性,從而引起RD細胞周期阻滯并誘導其凋亡,同時對正常的成肌細胞無明顯毒副作用。?

本發明所述噻唑烷酮類化合物2-(4-羥基苯亞胺基)-5-(3-甲氧基-4-羥基苯亞甲基)-4-噻唑烷酮的化學結構如通式(1)所示:?

本發明所述2-(4-羥基苯亞胺基)-5-(3-甲氧基-4-羥基苯亞甲基)-4-噻唑烷酮在制備抗橫紋肌肉瘤藥物中的應用;其中,所述橫紋肌肉瘤是胚胎型橫紋肌肉瘤。?

上述化合物能有效抑制橫紋肌肉瘤細胞生長,抑制細胞存活率IC50濃度優選是0.65μM。?

上述化合物能引起人體胚胎型橫紋肌肉瘤RD細胞顯著細胞周期阻滯和細胞凋亡的濃度最優選是5.0μM。?

為了更好的理解本發明的實質及本發明所述化合物的作用效果,下面結合2-(4-羥基苯亞胺基)-5-(3-甲氧基-4-羥基苯亞甲基)-4-噻唑烷酮的藥理實驗及結果,來進一步闡述其在抑制橫紋肌肉瘤細胞增殖、引起橫紋肌肉瘤細胞周期阻滯和誘導凋亡以及其對人體正常成肌細胞LHCN-M2的低毒效應中所具有的明顯作用。?

橫紋肌肉瘤細胞的制備:以常規方法培養橫紋肌肉瘤細胞(人體胚胎型橫紋肌肉瘤RD細胞),收集生長狀態良好的且處于對數期的細胞,備用。?

人體正常成肌細胞的制備:體外培養人體正常成肌細胞(LHCN-M2細胞),在傳代時需在皿底先鋪一層明膠,以有利于LHCN-M2細胞貼壁生長。收集生長狀態良好的且處于對數期的細胞,備用。?

采用細胞生物學和分子生物學方法進行如下實驗,以觀察2-(4-羥基苯亞胺基)-5-(3-甲氧基-4-羥基苯亞甲基)-4-噻唑烷酮(下文簡稱化合物1)對橫紋肌肉瘤細胞及正常成肌細胞的作用。?

1.定量分析化合物1對橫紋肌肉瘤RD細胞的藥效?

將RD細胞接種于96孔板中,經不同濃度(100、10、3、1、0.1、0.01μM)的化合物1處理48h后,分別用方法檢測細胞內的ATP含量來計算細胞存活率。存活率=(實驗組發光值)÷(對照組發光值)(以不含細胞的培養液為發光值測定空白背景),實驗結果表明化合物1作用于RD癌細胞,半數生長抑制濃度IC50為0.65μM(見圖1)。?

2.化合物1引起橫紋肌肉瘤RD細胞的周期阻滯,以抑制其正常增殖。收集對數期RD細胞,加入5.0μM化合物1,作用12h,24h后,用細胞周期試劑染色,以流式細胞術分析,結果發現化合物1對RD細胞在12h和24h時,都被阻滯在G2/M期且阻滯情況加重(見圖2)。?

3.化合物1誘導橫紋肌肉瘤RD細胞凋亡?

收集對數期RD細胞,加入5.0μM化合物1,作用12h、24h、48h后進行Annexin?V-FITC/PI染色,用流式細胞術分析,結果發現化合物1對RD細胞具有時間依賴性的凋亡誘導作用(見圖3a)。?

4.化合物1引起橫紋肌肉瘤RD細胞Caspase?3活性的升高?

收集對數期RD細胞,加入5.0μM化合物1,作用12h,24h后提取細胞總蛋白,并用Caspase?3活性檢測試劑盒檢測細胞總蛋白中Caspase?3的活性。結果發現化合物1對RD細胞具有時間依賴性的Caspase?3活性增強作用,說明化合物1引起的凋亡是Caspase3依賴的(見圖3b)。?

5.化合物1對人體正常成肌細胞LHCN-M2毒性較對RD癌細胞的大大降低。?

將LHCN-M2細胞接種于96孔板中,經不同濃度(100、10、3、1、0.1、0.01μM)的化合物1處理48h后,分別用方法通過檢測細胞內的ATP含量來計算細胞存活率。存活率=(實驗組發光值)÷(對照組發光值)(以不含細胞的培養液為發光值測定空白背景),實驗結果表明化合物1作用于正常成肌細胞LHCN-M2,半數生長抑制濃度IC50大于100μM(見圖4)。?

上述實驗數據經統計學處理,實驗數據以平均值±標準誤差表示。?

通過上述實驗及其結果,可以得到以下結論:?

本發明所述的化合物2-(4-羥基苯亞胺基)-5-(3-甲氧基-4-羥基苯亞甲基)-4-噻唑烷酮能在0.65μM即可引起橫紋肌肉瘤RD細胞50%的存活抑制效果,并引起RD細胞周期阻滯及誘導細胞凋亡,而且對正常成肌細胞LHCN-M2毒性很低,IC50大于100μM。上述結果預示2-(4-羥基苯亞胺基)-5-(3-甲氧基-4-羥基苯亞甲基)-4-噻唑烷酮有望在繼續開發后成為橫紋肌肉瘤的有效抗癌藥物,應用前景良好。?

附圖說明

圖1用檢測活性化合物2-(4-羥基苯亞胺基)-5-(3-甲氧基-4-羥基苯亞甲基)-4-噻唑烷酮作用于RD細胞的劑量效應。?

根據擬合曲線,計算出化合物抑制RD細胞存活的IC50為0.65±0.13μM。?

圖2流式細胞術檢測化合物2-(4-羥基苯亞胺基)-5-(3-甲氧基-4-羥基苯亞甲基)-4-噻唑烷酮引起RD細胞周期分布。?

其中,所用化合物濃度5.0μM,檢測時間分別為12h和24h。DMSO組為陰性對照組。標明了處于G2/M期的細胞在所有細胞中所占的比例,可以看出化合物1對RD細胞有明顯的G2/M期阻滯效應。?

圖3檢測2-(4-羥基苯亞胺基)-5-(3-甲氧基-4-羥基苯亞甲基)-4-噻唑烷酮誘導RD細胞發生細胞凋亡現象。?

a.用Annexin?V-FITC/PI雙染法通過流式細胞術檢測2-(4-羥基苯亞胺基)-5-(3-甲氧基-4-羥基苯亞甲基)-4-噻唑烷酮引起的RD細胞凋亡效應。其中,所用的化合物濃度為5.0μM,檢測時間為12h、24h、48h,縱坐標表示凋亡細胞在被測細胞群中的比例,DMSO為陰性對照組。?

b.用caspase?3檢測試劑盒,檢測經2-(4-羥基苯亞胺基)-5-(3-甲氧基-4-羥基苯亞甲基)-4-噻唑烷酮作用后的RD細胞中caspase?3的活性。其中,所用的化合物濃度為5.0μM,檢測時間為12h、24h,縱坐標表示caspase?3陰性對照相比的活性,DMSO為?陰性對照組。?

圖4用檢測活性化合物2-(4-羥基苯亞胺基)-5-(3-甲氧基-4-羥基苯亞甲基)-4-噻唑烷酮作用于正常成肌細胞LHCN-M2細胞的劑量效應。?

結果顯示,化合物抑制LHCN-M2細胞存活的IC50大于100μM。?

具體實施方式

合成化合物表征使用的儀器:紅外光譜,Nicolet380FTIR;LC/MS,Waters2795(Waters2996PDA監測器/MicromassZQ質量檢測器,C18柱,2.0μm×50mm);NMR譜:Bruker400MHzNMR光譜儀(溶劑MeOD);計算分子特性:TSAR軟件Accelrys(SanDiego,CA)以及PipelinePilotSciTegic(SanDiego,CA)。?

實施例1?

2-(4-羥基苯亞胺基)-5-(3-甲氧基-4-羥基苯亞甲基)-4-噻唑烷酮的制備?

按HCl:H2O(1:4)的比例配成鹽酸溶液。稱取60mmol硫氰酸銨溶于10mL鹽酸溶液中,加入40mmol對羥基苯胺,攪拌條件下加熱到85℃,混合物變澄清,反應12h后,TLC監測反應。反應結束后,將混合物冷卻到室溫,用10%鹽酸溶液萃取,得對羥基苯硫脲。?

將對羥基苯硫脲6.0mmol,無水乙酸鈉30mmol,加入到20mL乙醇中,攪拌條件下,加入氯代乙酸乙酯12mmol,然后在60℃下加熱6個小時,TLC檢測反應,反應結束后冷卻,出現沉淀。將反應液抽濾,固體用乙醇洗滌,再將沉淀混懸于水中,溶解未反應原料,再次抽濾,用乙醇洗滌。得到產物2-(4-羥基苯亞胺基)-4-噻唑烷酮。?

取2-(4-羥基苯亞胺基)-4-噻唑烷酮0.5mmol溶于3mL乙醇中,加入對3-甲氧基-4-羥基苯甲醛0.6mmol,哌啶100μL,60℃恒溫反應24小時。反應通過TLC監測,反應完畢后冷卻到室溫,在反應過程中有大量沉淀生成,經過分析表征,沉淀即為終產品。過濾,用乙酸乙酯,乙醇,石油醚依次進行洗滌,得到較純凈化合物2-(4羥基苯亞胺基)-5-(3-甲氧基-4-羥基苯亞甲基)-4-噻唑烷酮。?

產物為黃色粉末,ESI-MS:m/z?343.07(M+1)。?

實施例2?????方法測定2-(4-羥基苯亞胺基)-5-(3-甲氧基-4-羥基苯亞甲基)-4-噻唑烷酮對RD細胞存活半數抑制濃度?

在37℃含5%CO2的環境下,用DMEM/10%胎牛血清培養基培養人體胚胎型橫紋肌肉瘤RD細胞。將收集的對數期RD細胞接種于96孔板中,孵育24h。加入不同濃度(100、10、3、1、0.1、0.01μM)的2-(4-羥基苯亞胺基)-5-(3-甲氧基-4-羥基苯亞甲基)-4-噻唑烷酮孵育48h后,取出放置于室溫30min以上,使其冷卻至室溫。每孔分別加入?試劑100μL,將板震蕩2min,靜置10min等發光強度穩定。在酶標儀測定每孔的發光強度。根據發光強度計算存活率,存活率=(實驗組發光值)÷(對照組發光值)(以不含細胞的培養液為發光值測定空白背景)。?

實驗結果:2-(4-羥基苯亞胺基)-5-(3-甲氧基-4-羥基苯亞甲基)-4-噻唑烷酮抑制RD細胞存活的IC50為0.65±0.13μM(見圖1)。?

實施例3?

流式細胞儀測定2-(4-羥基苯亞胺基)-5-(3-甲氧基-4-羥基苯亞甲基)-4-噻唑烷酮對RD細胞周期分布影響?

取對數生長期的RD細胞,按20萬細胞數3mL培養基體積接種于60mm培養皿內。24小時后每2個培養皿分別加入DMSO和5.0μM的2-(4-羥基苯亞胺基)-5-(3-甲氧基-4-羥基苯亞甲基)-4-噻唑烷酮。培養DMSO和2-(4-羥基苯亞胺基)-5-(3-甲氧基-4-羥基苯亞甲基)-4-噻唑烷酮細胞,分別培養12h和24h后,在冰上消化細胞,收集細胞懸液,離心后用PBS洗滌2次。加入70%冰乙醇10毫升混懸,在-20℃過夜。離心細胞懸液,用PBS沖洗2次,細胞團加入200μL細胞周期試劑,避光室溫下染色30min。以DMSO組為陰性對照。?

結果表明:化合物2-(4-羥基苯亞胺基)-5-(3-甲氧基-4-羥基苯亞甲基)-4-噻唑烷酮能時間依賴性的將RD細胞阻滯在G2/M期(見圖2)。?

實施例4?

Annexin?V-FITC/PI雙染法檢測2-(4-羥基苯亞胺基)-5-(3-甲氧基-4-羥基苯亞甲基)-4-噻唑烷酮誘導RD細胞發生細胞凋亡?

取對數生長期的RD細胞,按20萬細胞數3ml培養基體積接種于60mm培養皿內,24小時后每2個培養皿分別加入DMSO和5.0μM化合物2-(4-羥基苯亞胺基)-5-(3-甲氧基-4-羥基苯亞甲基)-4-噻唑烷酮。孵育DMSO和化合物2-(4-羥基苯亞胺基)-5-(3-甲氧基-4-羥基苯亞甲基)-4-噻唑烷酮細胞,分別孵育12h、24h和48h后,在冰上消化細胞,收集細胞懸液,離心后用PBS洗滌2次。向細胞團加入AnnexinVbuffer400μL,混懸均勻后加入4μLAnnexin?V-FITC/4μL?PI,避光室溫染色10分鐘。以DMSO組為陰性對照。?

結果發現:化合物2-(4-羥基苯亞胺基)-5-(3-甲氧基-4-羥基苯亞甲基)-4-噻唑烷酮對RD細胞在48h有明顯的細胞凋亡誘導作用(見圖3a)。?

實施例5?

用Caspase?3/CPP32比色法試劑盒檢測2-(4-羥基苯亞胺基)-5-(3-甲氧基-4-羥基苯亞甲基)-4-噻唑烷酮引起RD細胞中Caspase?3活性的升高?

將用濃度為5.0μM的化合物2-(4-羥基苯亞胺基)-5-(3-甲氧基-4-羥基苯亞甲基)-4-噻唑烷酮和DMSO處理不同時間(12,24h)的RD細胞進行裂解,提取細胞總蛋白。每種處理方式的蛋白取100μg用細胞裂解液稀釋到50μL。每份分別加入50μL2X反應液(內含10mM?DTT),再加入4mM?DEVD-pNA底物,37度孵育1h,加入96孔板用吸光度酶標儀檢測,吸收波長設為400nm。DMSO組為陰性對照。?

結果顯示:化合物2-(4-羥基苯亞胺基)-5-(3-甲氧基-4-羥基苯亞甲基)-4-噻唑烷酮處理后的RD細胞在24h時Caspase?3活性有明顯的升高。從而進一步證明了2-(4-羥基苯亞胺基)-5-(3-甲氧基-4-羥基苯亞甲基)-4-噻唑烷酮對RD細胞的細胞凋亡誘導作用,且表明其誘導的細胞凋亡是Caspase?3依賴的(見圖3b)。?

實施例6?????方法測定2-(4-羥基苯亞胺基)-5-(3-甲氧基-4-羥基苯亞甲基)-4-噻唑烷酮對正常成肌細胞LHCN-M2存活半數抑制濃度?

在37℃含5%CO2的環境下,用含有68%DMEM,17%Medium?199,15%胎牛血清,1.4μg/mL硫酸鋅,0.03μg/mL維生素B12,2.5ng/mL肝細胞生長因子(HGF),10ng/mL成纖維細胞生長因子(bFGF)和50ng/mL地塞米松的培養液培養LHCN-M2細胞。收集對數期LHCN-M2細胞接種于96孔板中,孵育24h。加入不同濃度(100、10、3、1、0.1、0.01μM)的2-(4-羥基苯亞胺基)-5-(3-甲氧基-4-羥基苯亞甲基)-4-噻唑烷酮,孵育48h后,取出放置于室溫30min以上,使其冷卻至室溫。每孔分別加入試劑100μL,將板震蕩2min,靜置10min等發光強度穩定。在酶標儀測定每孔的發光強度。根據發光強度計算存活率,存活率=(實驗組發光值)÷(對照組發光值)(以不含細胞的培養液為發光值測定空白背景)。?

實驗結果表明:2-(4-羥基苯亞胺基)-5-(3-甲氧基-4-羥基苯亞甲基)-4-噻唑烷酮抑制LHCN-M2細胞的毒性很低,抑制細胞存活的IC50大于100μM.(見圖4)。?

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