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3甲基1苯基2吡唑啉5酮與2莰醇組合物的新用途.pdf

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甲基 苯基 吡唑 組合 用途
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摘要
申請專利號:

CN201110230461.4

申請日:

20110812

公開號:

CN102920697B

公開日:

20150819

當前法律狀態:

有效性:

有效

法律詳情:
IPC分類號: A61K31/4152,A61K31/045,A61P9/00 主分類號: A61K31/4152,A61K31/045,A61P9/00
申請人: 江蘇先聲藥物研究有限公司
發明人: 楊士豹,李天立,陳榮
地址: 210042 江蘇省南京市玄武區玄武大道699號-18
優先權: CN201110230461A
專利代理機構: 代理人:
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法律狀態
申請(專利)號:

CN201110230461.4

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法律狀態公告日:

法律狀態類型:

摘要

本發明涉及3-甲基-1-苯基-2-吡唑啉-5-酮與2-莰醇組合物在心臟驟停后腦復蘇中的應用。

權利要求書

1.3-甲基-1-苯基-2-吡唑啉-5-酮與2-莰醇組合物在制備治療心臟驟停藥物中的應用,所述組合物中3-甲基-1-苯基-2-吡唑啉-5-酮與2-莰醇的質量比選自8:1~2:1。2.3-甲基-1-苯基-2-吡唑啉-5-酮與2-莰醇組合物在制備用于心臟驟停后腦復蘇藥物中的應用,所述組合物中3-甲基-1-苯基-2-吡唑啉-5-酮與2-莰醇的質量比選自8:1~2:1。3.3-甲基-1-苯基-2-吡唑啉-5-酮與2-莰醇組合物在制備用于心肺復蘇藥物中的應用,所述組合物中3-甲基-1-苯基-2-吡唑啉-5-酮與2-莰醇的質量比選自8:1~2:1。4.根據權利要求1-3中任一項所述的應用,其特征在于所述組合物中3-甲基-1-苯基-2-吡唑啉-5-酮與2-莰醇的質量比選自8:1或4:1或2:1。5.根據權利要求1-3中任一項所述的應用,其特征在于所述組合物中3-甲基-1-苯基-2-吡唑啉-5-酮與2-莰醇的質量比選自4:1或2:1。6.根據權利要求1-3中任一項所述的應用,其特征在于所述組合物中3-甲基-1-苯基-2-吡唑啉-5-酮與2-莰醇的質量比為4:1。7.根據權利要求1-3中任一項所述的應用,其特征在于所述2-莰醇為(+)-2-莰醇。8.根據權利要求1-3中任一項所述的應用,其特征在于所述2-莰醇為(-)-2-莰醇。

說明書

技術領域

本發明涉及3-甲基-1-苯基-2-吡唑啉-5-酮與2-莰醇組合物在心臟驟停后腦復蘇中的應用。

背景技術

心臟驟停(cardiac?arrest)是指心臟射血功能的突然終止。心臟驟停發生后,由于腦血流中斷,10秒左右患者即可出現意識喪失,經及時救治可獲存活,否則將發生生物學死亡,罕見自發逆轉者。心臟驟停是心臟性猝死的直接原因。

心臟性猝死(sudden?cardiac?death)是指急性癥狀發作后1小時內發生的以意識突然喪失為特征的、由心臟原因引起的自然死亡。無論是否有心臟病,死亡的時間和形式未能預料。北京市的流行病學資料顯示,心臟性猝死的男性年平均發病率為10.5/10萬。女性為3.6/10萬。減少心臟性猝死對降低心血管死亡率有重要意義。

心臟驟停發生后,大部分患者將在4~6分鐘內開始發生不可逆腦損害,隨后經數分鐘過度到生物學死亡。心臟驟停發生后立即實施心臟復蘇和盡早除顫,是避免發生生物學死亡的關鍵。心臟復蘇成功后死亡的最常見的原因是中樞神經系統的損傷,其他常見原因有繼發感染、低心排血量及心律失常復發等。

心臟復蘇后的處理原則和措施包括維持有效的循環和呼吸功能,特別是腦灌注,預防再次心臟驟停,維持水、電解質和酸堿平衡,防治腦水腫、急性腎衰竭和繼發感染等,其中重點是腦復蘇,開始有關提高長期生存和神經功能恢復治療。

腦復蘇是心肺復蘇(cardiopulmonary?resuscitation,CPR)最后成功的關鍵。在缺氧狀態下,腦血流的自主調節功能喪失,腦血流的維持主要依賴于腦灌注壓,任何導致顱內壓升高或體循環平均動脈壓降低的因素均可減低腦灌注壓,從而進一步減少腦血流。對昏迷患者應維持正常的或輕微增高的平均動脈壓,降低增高的顱內壓,以保證良好的腦灌注。

3-甲基-1-苯基-2-吡唑啉-5-酮,又稱依達拉奉,其結構式為:

依達拉奉分子式為C10H10N2O,分子量為174.19,CAS號為89-25-8。依達拉奉目前在臨床上作為一種腦保護劑,清除自由基,抑制脂質過氧化,從而抑制腦細胞、血管內皮細胞、神經細胞的氧化損傷。大鼠在缺血/缺血再灌注后靜脈給予依達拉奉,可阻止腦水腫和腦梗塞的進展,并緩解所伴隨的神經癥狀,抑制遲發性神經元死亡。

2-莰醇的分子式為C10H18O,分子量154.25。2-莰醇包括(+)-2-莰醇和(-)-2-莰醇。(+)-2-莰醇和(-)-2-莰醇的結構式如下所示。

發明內容

本發明的目的是提供一種依達拉奉與2-莰醇藥物組合物在心臟驟停后腦復蘇中的應用。所述依達拉奉與2-莰醇配合使用時具有增強或協同作用的效果,可以提高使用效果。

本發明中依達拉奉與2-莰醇的質量比為10∶1~1∶2,優選為8∶1~1∶1。質量比進一步的優選自8∶1或7∶1或6∶1或17∶3或21∶4或5∶1或4∶1或19∶6或3∶1或18∶7或7∶3或17∶8或2∶1或13∶7或16∶9或3∶2或14∶11或11∶9或13∶12或1∶1;再進一步的優選為選自8∶1或4∶1或2∶1;更加進一步的優選自4∶2或2∶1;最優選為4∶1。

本發明中所述的2-莰醇的純度不低于96.0%,優選地為不低于98.0%,更優選地為不低于99.0%。

本發明中所述的2-莰醇可以為消旋的2-莰醇,也可以為(+)-2-莰醇或(-)-2-莰醇;優選為(+)-2-莰醇或(-)-2-莰醇。所述的(+)-2-莰醇的純度不低于96.0%,優選地為不低于98.0%,更優選地為不低于99.0%。所述的(-)-2-莰醇的純度不低于96.0%,優選地為不低于98.0%,更優選地為不低于99.0%。本發明中所述的2-莰醇最優選的為純度不低于99.0%的(+)-2-莰醇。

本發明中的藥物組合物施用方式優選以注射劑形式給藥,包括但不限于皮內注射、皮下注射、肌內注射、靜脈注射、脊椎腔內注射、動脈內注射;優選靜脈注射。

注射劑由治療有效量的藥物組合物、溶劑、附加劑及容器所組成。所述附加劑是為了保證注射劑的安全、有效和穩定。“治療有效量”是實現治療益處例如在患有疾病的對象中阻止疾病、或預防性阻止或防止疾病的發作的化合物的量。治療有效量,可以是在某種程度上緩解對象中的疾病或病癥的一種或多種癥狀、使與疾病或病癥相關或是其病因的一種或多種生理或生物化學參數部分或完全恢復正常、和/或降低疾病或病癥的發作可能性的量。

藥物組合物溶于溶劑,可以使得依達拉奉與2-莰醇更好地混合。所述溶劑可以選用水、水溶性有機溶劑、或者水溶性有機溶劑與水的混合物。常用的水溶性有機溶劑主要有醇類溶劑、醚類溶劑、酮類溶劑等。本發明中優選水、水溶性有機溶劑與水的混合物。常用的醇類溶劑有乙醇、異丙醇、乙二醇、丙二醇等;常用的醚類溶劑有乙二醇單乙基醚、乙二醇單丁基醚等;常用的酮類溶劑有丙酮、N-甲基-2-吡咯烷酮。本發明中水溶性有機溶劑優選使用丙二醇。

含有本發明中藥物組合物的注射劑也可以以即用即配的方式來制造。即,可以這樣使用:制得含有藥物組合物、附加劑(可選地)的固體,在使用前溶解于無菌的溶劑中。

心臟驟停后導致腦血流中斷,大部分患者將在4~6分鐘內開始發生不可逆腦損害。本發明中利用大鼠四動脈阻斷(4VO)致全腦缺血模型模擬心臟驟停后導致腦血流中斷,以及心肺復蘇后的再灌流。

本發明對大鼠全腦缺血模型分別給予依達拉奉、(+)-2-莰醇、不同質量比依達拉奉/(+)-2-莰醇組合物。通過檢測海馬CA1區病理損傷、氧化-抗氧化指標、腦線粒體呼吸功能、血腦屏障通透性等,表明依達拉奉與(+)-2-莰醇藥物組合物在心臟驟停后腦復蘇中具有良好的效果。所述依達拉奉與2-莰醇藥物組合物配合使用時具有增強或協同作用的效果,可以提高使用效果。

附圖說明

圖1:實施例3中各組大鼠腦海馬CA1區病理損傷;A,假手術組;B,模型組;C,依達拉奉組;D,(+)-2-莰醇組;E,復方(2∶1)組;F,復方(4∶1)組;G,復方(8∶1)組。(每張圖片中大、小兩圖放大倍數分別為×400,×40)

下面以實施例的方式對本發明作進一步說明,給出本發明的實施細節,但是并不是旨在限定本發明的保護范圍。

具體實施方式

實施例1溶液配制

模型組注射液:稱取9克氯化鈉溶于500mL注射用水,加入80mL?1,2-丙二醇,再用注射用水稀釋至1000mL。

(+)-2-莰醇注射液:稱取0.8g(+)-2-莰醇,溶于80ml?1,2-丙二醇,用注射用水稀釋至1000mL。

復方(2∶1)注射液:稱取1.67g依達拉奉和0.83g(+)-2-莰醇,溶于80ml?1,2-丙二醇,用注射用水稀釋至1000mL。

復方(4∶1)注射液:稱取2.0g依達拉奉和0.5g(+)-2-莰醇,溶于80ml?1,2-丙二醇,用注射用水稀釋至1000mL。

復方(8∶1)注射液:稱取2.22g依達拉奉和0.28g(+)-2-莰醇,溶于80ml?1,2-丙二醇,用注射用水稀釋至1000mL。

依達拉奉注射液為市售藥品;商品名:必存;規格:10mg/5mL;生產單位:南京先聲東元制藥有限公司;批準文號:國藥準字H20031342。

實施例2大鼠四動脈阻斷(4VO)致全腦缺血模型的制備

雄性SD大鼠(240-280g),稱重。大鼠購至北京維通利華實驗動物技術有限公司,合格證號:SCXK(京)2006-0009。手術前、后常規飼養,室溫保持23-25℃,自由進食、進水。

麻醉:10%水合氯醛溶液400mg/kg,腹腔注射,至翻正反射消失。

腹位固定,剪開頭部正中皮膚,沿中線分開背闊肌和斜方肌,以第1頸椎橫突為標志,分離暴露翼小孔,用電凝針(0.2mm)插入翼小孔,熱灼閉塞雙側椎動脈。然后背位固定,切開頸前區皮膚2-3cm,沿氣管兩側分離雙側頸總動脈,埋線備用,縫合切口。

24h后,乙醚麻醉,重新打開頸前切口,用微動脈夾夾閉雙側頸總動脈,迅速解開固定,此為缺血期;20min后撤去雙側動脈夾,此為再灌流期。

缺血達到以下標準,即夾閉雙側頸總動脈10s內,大鼠出現意識喪失,角膜反射和翻正反射消失,可見大鼠四肢上舉,雙側瞳孔散大,眼球呈灰白色,身體可呈角弓反張,并在20min缺血期內,意識和上述反射均未恢復者,視為手術成功,方可實施再灌流及治療給藥。在缺血期死亡或僅出現昏睡以及在整個實驗過程中出現抽搐的大鼠均被廢棄。

假手術組的大鼠,不進行雙側椎動脈電凝,也不夾閉雙側頸總動脈,其余操作相同。

實施例3依達拉奉、(+)-2-莰醇及其不同組方對4VO大鼠再灌注72h腦海馬CA1區病理損傷的影響

大鼠按照實施例2中所述方法制備全腦缺血模型后,將手術成功的大鼠即刻隨機分至模型組及各給藥組,并給予相應藥物。

其中模型組給予模型組注射液;依達拉奉組給予依達拉奉注射液(按每千克體重給予3mg依達拉奉給藥);(+)-2-莰醇組給予(+)-2-莰醇注射液(按每千克體重給予0.8mg(+)-2-莰醇給藥);復方(2∶1)組給予復方(2∶1)注射液(按每千克體重給予依達拉奉和(+)-2-莰醇組合物0.75mg給藥);復方(4∶1)組給予復方(4∶1)注射液(按每千克體重給予依達拉奉和(+)-2-莰醇組合物0.75mg給藥);復方(8∶1)組給予復方(8∶1)注射液(按每千克體重給予依達拉奉和(+)-2-莰醇組合物0.75mg給藥)。

連續給藥3天,每天1次,于再灌注72小時麻醉,4%多聚甲醛灌注固定,取腦,置于多聚甲醛中后固定3d以上。常規脫水,石蠟包埋,背部海馬位置切取5μm厚組織切片,焦油紫染色。光鏡下對海馬CA1區相同部位進行拍照。

參照Kato2分級方法,于光學顯微鏡下對海馬CA1區組織學改變進行分級,標準如下:0級,無神經元死亡;1級,散在神經元死亡;2級,成片神經元死亡;3級,幾乎全部的神經元死亡。取雙側平均等級作為統計值。

高倍鏡(×400)下計數海馬CA1區相同部位(整張照片上)細胞膜完整、胞核飽滿、核仁清晰的錐體細胞數目,計算雙側海馬單位長度椎體神經元個數,取平均數為神經元密度(neuronal?density,ND)。

形態學焦油紫染色顯示,假手術組大鼠腦海馬CA1區無明顯損傷,錐體細胞排列整齊致密,形態完整,胞核大而圓,染色較淺,核仁深染,清晰。模型組大鼠海馬CA1區有明顯組織損傷,6只大鼠均表現為神經元大量缺失,殘存的神經細胞呈缺血性改變,為瘦長形,核固縮深染,核仁消失,或核消失,僅見細胞輪廓,即典型的遲發性神經元壞死。依達拉奉組、(+)-2-莰醇組、復方(2∶1)組、復方(4∶1)組大鼠腦海馬CA1區神經元的形態及數量均有不同程度的改善,復方(8∶1)組作用不明顯。復方(4∶1)組作用最佳。

于光鏡下(×400),對每組動物的腦海馬CA1區進行病理分級及神經元計數(以整張照片計),結果表明,假手術組大鼠神經元分級均為0級,模型組大鼠腦海馬CA1區神經元多為大片損傷或缺失,病理分級為2-3級,依達拉奉組、(+)-2-莰醇組、復方(2∶1)組、復方(4∶1)組動物病理損傷有不同程度的減輕,分級多為1-2級,復方(4∶1)組作用最佳。結果見表1。

表1依達拉奉及其復方對4VO大鼠腦海馬CA1區病理分級及神經元密度的影響

??組別 ??n ??病理分級 ??神經元密度 ??假手術組 ??4 ??0 ??69±1.5 ??模型組 ??5 ??2.8±0.2### ??7.2±4.1### ??依達拉奉組 ??7 ??2±0.4* ??31.5±11.6* ??(+)-2-莰醇組 ??6 ??1.9±0.5* ??29.4±10.9* ??復方(2∶1)組 ??5 ??2.3±0.5 ??32.4±14.1* ??復方(4∶1)組 ??7 ??1.3±0.3*** ??41±10.1** ??復方(8∶1)組 ??4 ??2.5±0.5 ??15.3±9.1

與假手術組相比,###P<0.001;與模型組相比,*P<0.05,**P<0.01。

實施例4依達拉奉、(+)-2-莰醇及其不同組方對全腦缺血再灌腦氧化-抗氧化指標的影響

大鼠按照實施例2中所述方法制備全腦缺血模型后,將手術成功的大鼠即刻隨機分至模型組及各給藥組,并給予相應藥物。于再灌注24h時處死動物,取腦勻漿,用來測生化指標。SOD、GSH-px、MDA、MPO、NO及蛋白定量試劑盒購自南京建成生化試劑有限公司。

其中模型組給予模型組注射液;依達拉奉組給予依達拉奉注射液(按每千克體重給予3mg依達拉奉給藥);(+)-2-莰醇組給予(+)-2-莰醇注射液(按每千克體重給予0.8mg(+)-2-莰醇給藥);復方(2∶1)組給予復方(2∶1)注射液(按每千克體重給予依達拉奉和(+)-2-莰醇組合物0.75mg給藥);復方(4∶1)組給予復方(4∶1)注射液(按每千克體重給予依達拉奉和(+)-2-莰醇組合物0.75mg給藥);復方(8∶1)組給予復方(8∶1)注射液(按每千克體重給予依達拉奉和(+)-2-莰醇組合物0.75mg給藥)。

大鼠腦組織中丙二醛(malonaldehyde;malondialdehyde,MDA)測定

實驗原理:過氧化脂質降解產物中的丙二醛可與硫代巴比妥酸縮合,形成紅色產物,在532nm處有最大吸收峰。

檢測方法:按照試劑盒說明書進行。100℃水浴15分鐘,冰浴終止反應,540nm處測定吸收值。四乙氧基丙烷溶液為標準參照,作標準曲線,通過得到的回歸方程求出MDA含量(nmol/mg)。

大鼠腦組織超氧化物歧化酶(superoxide?dismutase,SOD)活性的測定

實驗原理:通過黃嘌呤及黃嘌呤氧化酶反應系統產生超氧陰離子自由基,后者氧化羥胺形成亞硝酸鹽,在顯色劑的作用下呈現紫紅色。當被測樣品中含有SOD時,對超氧陰離子自由基有專一性的抑制作用,使形成的亞硝酸鹽減少。

檢測方法:勻漿方法同上,勻漿液充分混勻后,按試劑盒說明書進行SOD活性檢測。每毫克組織蛋白在1ml反應液中SOD抑制率達50%時所對應的值為一個亞硝酸鹽單位。

大鼠腦組織髓過氧化物酶(MPO)的檢測

實驗原理:中性白細胞中存在有髓過氧化物酶,每個細胞所含的酶的量是一定的,約占細胞干重的5%,該酶具有使過氧化氫還原的能力,利用這一特點可以分析酶的活力,并定量測定中性白細胞的數目。通過供氫體鄰連茴香胺供氫后生成黃色化合物,在460nm處通過比色測定此產物的生成量,從而推算出MPO的活力及H2O2減少的量和白細胞的數目。

檢測方法:勻漿方法同上,勻漿液充分混勻后,按試劑盒說明書進行髓過氧化物酶活性的檢測。

大鼠腦組織中NO的檢測

腦組織中NO的含量以Griess法測定。吸取腦組織勻漿上清50μl于96孔板中,加入等量的Griess試劑。混合液于室溫避暗孵育10min,測定540nm的吸光度。NO的濃度通過標準曲線計算得到。

大鼠腦組織谷胱甘肽過氧化物酶(glutathion?peroxidase;glutathione?peroxidase, GSH-Px)的檢測

實驗原理:谷胱甘肽過氧化物酶促進過氧化氫與還原型谷胱甘肽反應,通過測定還原型谷胱甘肽的消耗測定酶的活性。

檢測方法:勻漿方法同上,勻漿液充分混勻后,按試劑盒說明書進行谷胱甘肽過氧化物酶活性的檢測。

檢測結果

由表2可見,四動脈阻斷后24h,大鼠腦組織中的MDA、SOD、MPO、NO水平均呈現一定程度升高(P<0.05,P<0.01),可能系氧化應激的結果;依達拉奉及其復方于再灌后即刻給藥能夠不同程度地降低MDA、SOD、MPO、NO、GSH-px的這種應激性升高,對GSH-px的作用不明顯。依達拉奉組、(+)-2-莰醇組、復方(2∶1)組、復方(4∶1)組、復方(8∶1)組給藥能夠降低大鼠4VO后24h腦組織中MDA及NO含量,調節SOD至接近正常水平。表明藥物具有明顯抗氧化作用。

表2依達拉奉及其復方對4VO大鼠腦中MDA、SOD、MPO、NO、GSH-px的影響

??組別 ??n ??MDA ??SOD ??MPO ??NO ??GSH-px

??(nmol/gPro) ??(U/gPro) ??(nmol/gPro) ??(ug/gPro) ??(U/gPro) ??假手術組 ??8 ??10.02±1.58 ??5.55±0.57 ??0.026±0.014 ??1.75±0.11 ??15.95±6.26 ??模型組 ??8 ??20.50±3.17## ??7.71±0.89# ??0.051±0.014## ??3.92±1.01### ??11.40±3.29# ??依達拉奉 ??8 ??10.88±6.27** ??5.35±0.81** ??0.025±0.008*** ??2.05±0.47*** ??12.30±2.02 ??(+)-2-莰醇 ??7 ??13.10±2.82** ??5.16±0.85** ??0.035±0.016 ??2.05±1.71** ??10.04±1.85 ??復方(2∶1) ??7 ??11.41±4.4** ??5.12±0.80** ??0.038±0.008 ??1.91±0.50*** ??9.33±3.92 ??復方(4∶1) ??8 ??11.1±2.78** ??5.05±1.09** ??0.030±0.008** ??2.08±0.63*** ??11.30±1.85 ??復方(8∶1) ??8 ??15.87±7.16* ??5.27±1.36** ??0.035±0.015 ??2.41±0.72* ??12.13±3.27*

與假手術組相比,#P<0.05,##P<0.01;與模型組相比,*P<0.05,**P<0.01。

實施例5依達拉奉、(+)-2-莰醇及其不同組方對全腦缺血再灌后腦線粒體呼吸功能的影響

大鼠按照按照實施例2中所述方法制備全腦缺血模型后,將手術成功的大鼠即刻隨機分至模型組及各給藥組,并給予相應藥物。于再灌注24h時處死動物,取腦勻漿,用來測線粒體呼吸功能。蛋白定量試劑盒購自南京建成生化試劑有限公司。

其中模型組給予模型組注射液;依達拉奉組給予依達拉奉注射液(按每千克體重給予3mg依達拉奉給藥);(+)-2-莰醇組給予(+)-2-莰醇注射液(按每千克體重給予0.8mg(+)-2-莰醇給藥);復方(2∶1)組給予復方(2∶1)注射液(按每千克體重給予依達拉奉和(+)-2-莰醇組合物0.75mg給藥);復方(4∶1)組給予復方(4∶1)注射液(按每千克體重給予依達拉奉和(+)-2-莰醇組合物0.75mg給藥);復方(8∶1)組給予復方(8∶1)注射液(按每千克體重給予依達拉奉和(+)-2-莰醇組合物0.75mg給藥)。

腦線粒體提取

大鼠斷頭處死,迅速取出腦組織,稱重。置于預冷的小燒杯中,用冰冷的分離緩沖液沖洗3次,剝去血管,去除淤血,用小剪刀將腦組織剪成碎塊。將腦組織轉入玻璃勻漿器中,加入分離緩沖液10ml/g組織,手動勻漿10次。所得勻漿液以700g離心10min;取上清以10000g,離心10min,所得沉淀即為線粒體。以分離緩沖液將所得沉淀洗滌一次(離心10000g,10min)。將線粒體沉淀懸于分離緩沖液中,調整蛋白濃度為20-25mg/ml。蛋白濃度采用普利萊BCA檢測試劑盒檢測。腦線粒體極易老化,操作應迅速,整個過程保證在40min內完成。勻漿時應使用較松的勻漿器,上下均勻勻漿,并且勻漿動作要輕柔,盡量避免出現氣泡,否則極易造成提取的腦線粒體受損,整個線粒體制備過程均在4℃進行。

線粒體呼吸功能測定

取新鮮的線粒體懸液,采用Clark氧電極法測定線粒體呼吸活性。反應總體積1.0ml,反應溫度30℃。調節氧電極,校正100%氧(蒸餾水放置過夜或連續攪拌30min)和0%氧(加入亞硫酸鈉,將氧氣全部消耗)。將線粒體呼吸緩沖液1.0ml加入反應池中孵育2min,以空氣飽和,然后加入線粒體蛋白1mg。1~2min后,依次加入外源反應底物(10mM谷氨酸鈉和5mM蘋果酸的混合物或者10mM琥珀酸鈉),出現2態呼吸。加入250μM?ADP,出現3態呼吸,反應足夠長時間,待ADP完全消耗后線粒體進入4態呼吸)。觀察并記錄氧濃度曲線。計算線粒體氧化磷酸化參數:ADP/O、V3、V4、RCR和OPR。

線粒體氧化磷酸化參數計算

1)ADP/O比值ADP/O=ADP(nmol)/O(nmol)

ADP代表每次反應中所加入的ADP量(nmol);O代表加入ADP后線粒體氧化磷酸化所消耗的氧原子。

2)III態呼吸速率V3=O(nmol)/t(min)/protein(mg)

V3為3態呼吸速率,線粒體中加入底物及ADP測定的線粒體呼吸速率。其中O代表線粒體所消耗的氧原子量;t表示時間;protein為反應體系中所加入的線粒體蛋白量。

3)IV態呼吸速率V4=O(nmol)/t(min)/protein(mg)

V4為4態呼吸速率,指ADP耗竭時線粒體的最小呼吸速率。其中O代表線粒體所消耗的氧原子量;t表示時間;protein為反應體系中所加入的線粒體蛋白量。

4)呼吸控制指數RCR=V3/V4

呼吸控制指數(Respiration?Control?Rate,RCR)為加入ADP時(3態)的呼吸速率與ADP耗竭后(4態)的呼吸速率之比。

5)氧化磷酸化效率OPR=V3×ADP/O

氧化磷酸化效率(Oxidative?Phosphorylation?Rate,OPR)以單位時間內單位線粒體蛋白合成的ATP量表示,單位為nmol?ATP/min/mg?protein。

依達拉奉、(+)-2-莰醇及其不同組方對4VO大鼠腦線粒體呼吸鏈I?ADP/O、RCR、 V3、V4、OPR的影響

表3依達拉奉及其復方對4VO大鼠腦線粒體呼吸鏈I?ADP/O、RCR、V3、V4、OPR的影響

??組別 ??n ??ADP/O ??RCR ??V3 ??V4 ??OPR ??假手術組 ??9 ??2.18±0.23 ??4.16±0.35 ??121.5±21.59 ??30.6±5.45 ??233.55±52.88 ??模型組 ??6 ??1.57±0.31## ??3.66±0.53## ??86±16.73## ??24.55±5.8# ??137.44±20.27##

??依達拉奉組 ??6 ??1.81±0.06* ??3.53±0.30 ??139.98±12.68** ??39.86±4.57** ??252.71±16.81** ??(+)-2-莰醇組 ??6 ??2.0±0.082** ??3.78±0.41 ??106.78±13.27** ??29.33±4.48* ??208.62±27.04** ??復方(2∶1)組 ??6 ??2.04±0.21** ??3.57±0.29 ??148.38±20.53** ??43.57±4.76** ??301.87±34.49** ??復方(4∶1)組 ??6 ??1.92±0.16** ??3.75±0.23 ??137.51±31.42** ??36.49±8.11** ??257.29±48.41** ??復方(8∶1)組 ??6 ??1.69±0.25 ??3.71±0.36 ??144.47±14.6** ??39.32±5.5** ??228±50.88**

與假手術組相比,#P<0.05,##P<0.01;與模型組相比,*P<0.05,**P<0.01。

從表3中可以看出依達拉奉組、(+)-2-莰醇組、復方(2∶1)組及復方(4∶1)組均能顯著提高線粒體呼吸鏈I的ADP/O和OPR;復方(8∶1)組能夠提高OPR但對ADP/O影響不明顯;所有組對呼吸鏈I的RCR沒有明顯提高。

依達拉奉及其組方對全腦缺血大鼠腦線粒體呼吸鏈ⅡADP/O、RCR、V3、V4、OPR 的影響

表4依達拉奉及其配方對全腦缺血大鼠腦線粒體呼吸鏈ⅡADP/O、RCR、V3、V4、OPR的影響

??組別 ??n ??ADP/O ??RCR ??V3 ??V4 ??OPR ??假手術組 ??9 ??1.29±0.076 ??2.24±0.24 ??110.61±18.91 ??54.51±8.26 ??133.38±31.79 ??模型組 ??6 ??0.97±0.12## ??1.94±0.23# ??84.80±11.29## ??50.88±6.75 ??77.34±6.95## ??依達拉奉組 ??6 ??1.16±0.08* ??1.98±0.11 ??131.39±4.37** ??66.47±1.78** ??154.02±3.61** ??(+)-2-莰醇組 ??6 ??1.2±0.04** ??2.16±0.2 ??91.51±10.55 ??46.33±3.3 ??111.51±15.11** ??復方(2∶1)組 ??6 ??1.06±0.07* ??2.02±0.10 ??163.73±10.08*** ??81.49±4.55** ??194.46±17.68** ??復方(4∶1)組 ??6 ??1.10±0.11* ??2.16±0.20 ??146.46±27.18*** ??38.22±7.94** ??121.54±11.3** ??復方(8∶1)組 ??6 ??1.05±0.11* ??1.97±0.14 ??126.06±5.40** ??62.73±3.38** ??132.01±19.98**

與假手術組相比,#P<0.05,##P<0.01;與模型組相比,*P<0.05,**P<0.01。

從表4中可以看出依達拉奉組、(+)-2-莰醇組、復方(2∶1)組、復方(4∶1)組、復方(8∶1)組均能顯著提高線粒體呼吸鏈II的ADP/O和OPR;各組對呼吸鏈II的RCR有一定改善的趨勢,但作用不顯著。

實施例6依達拉奉、(+)-2-莰醇及其不同組方對對全腦缺血再灌后血腦屏障通透性的影響

大鼠按照按照實施例2中所述方法制備全腦缺血模型后,將手術成功的大鼠即刻隨機分至模型組及各給藥組,并給予相應藥物,每日給藥1次,連續給藥3次。

其中模型組給予模型組注射液;依達拉奉組給予依達拉奉注射液(按每千克體重給予3mg依達拉奉給藥);(+)-2-莰醇組給予(+)-2-莰醇注射液(按每千克體重給予0.8mg(+)-2-莰醇給藥);復方(2∶1)組給予復方(2∶1)注射液(按每千克體重給予依達拉奉和(+)-2-莰醇組合物0.75mg給藥);復方(4∶1)組給予復方(4∶1)注射液(按每千克體重給予依達拉奉和(+)-2-莰醇組合物0.75mg給藥);復方(8∶1)組給予復方(8∶1)注射液(按每千克體重給予依達拉奉和(+)-2-莰醇組合物0.75mg給藥)。

于末次給藥后尾靜脈注射伊文思藍(EB)0.3ml(1%,溶于生理鹽水)。于再灌注72h將動物麻醉,用生理鹽水對大鼠進行心臟灌流,以除去未結合的染料,斷頭處死,迅速取腦,分成左右兩側半腦,分別稱重,左半腦于105℃干燥24h后稱取干重,用于檢測腦水腫。右半腦稱重后以7.5%(w/v)三氯乙酸(TCA)勻漿(2ml/g腦濕重)。勻漿液于12000g,4℃,離心20min,取200μl上清液于微孔板中,于620nm處測定吸光度,以EB系列濃度溶液制作標準曲線,進行EB定量。結果以μg?EB/g腦濕重表示。腦水腫百分比以(左半腦濕重-左半腦干重)/左半腦濕重×100%表示。

大鼠在4VO后72h,腦含水量及腦組織中伊文思藍含量均有顯著升高,表明4VO致血腦屏障破壞及腦水腫,而且伊文思藍滲漏增加,依達拉奉及其復方各給藥組對腦含水量及腦組織中伊文思藍含量無明顯影響,各給藥組之間無顯著差異,說明各組方藥物對血腦屏障通透性的影響不明顯。結果見表5。

表5依達拉奉對4VO大鼠腦含水量及伊文思藍含量的影響

與假手術組相比,#P<0.05,##P<0.01。

實施例7不同濃度依達拉奉組方對全腦缺血再灌腦氧化-抗氧化指標的影響

大鼠按照實施例2中所述方法制備全腦缺血模型后,將手術成功的大鼠即刻隨機分至模型組及各給藥組,并給予相應藥物。于再灌注24h時處死動物,取腦勻漿,用來測生化指標。檢測方法參照實施例4。

其中模型組給予模型組注射液;依達拉奉組給予依達拉奉注射液(按每千克體重給予3mg依達拉奉給藥);低濃度復方組給予復方(4∶1)注射液(按每千克體重給予依達拉奉和(+)-2-莰醇組合物0.375mg給藥);中濃度復方組給予復方(4∶1)注射液(按每千克體重給予依達拉奉和(+)-2-莰醇組合物0.75mg給藥);高濃度復方組給予復方(4∶1)注射液(按每千克體重給予依達拉奉和(+)-2-莰醇組合物1.5mg給藥);

由表6可見,4VO后24h,大鼠腦組織中的MDA、SOD、MPO、NO水平均呈現一定程度升高(P<0.05,P<0.01),可能系氧化應激的結果;依達拉奉及復方依達拉奉各給藥組于再灌后即刻給藥能夠不同程度地降低MDA、SOD、MPO、NO的這種應激性升高,表現出一定量效關系的趨勢,對GSH-px作用不明顯。

表6依達拉奉對4VO大鼠腦中MDA、SOD、MPO、NO的影響

與假手術組相比,#P<0.05,##P<0.01;與模型組相比,*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001。

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