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一種抑菌抗病毒衛生巾.pdf

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一種 抗病毒 衛生巾
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摘要
申請專利號:

CN201310411623.3

申請日:

20130911

公開號:

CN103463671A

公開日:

20131225

當前法律狀態:

有效性:

有效

法律詳情:
IPC分類號: A61L15/32,A61L15/44 主分類號: A61L15/32,A61L15/44
申請人: 華南師范大學
發明人: 關燕清,劉俊明,蔡依含
地址: 510631 廣東省廣州市天河區中山大道西55號
優先權: CN201310411623A
專利代理機構: 廣州粵高專利商標代理有限公司 代理人: 陳衛
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法律狀態
申請(專利)號:

CN201310411623.3

授權公告號:

法律狀態公告日:

法律狀態類型:

摘要

本發明涉及女性用品領域,具體地,涉及一種抑菌抗病毒衛生巾。本發明提供一種抑菌抗病毒衛生巾,所述衛生巾的表面接枝有干擾素-α。接枝IFN-α的衛生巾具有抑菌抗病毒、生物安全性高的特征,能有效地減少因衛生巾的使用不當而引起的婦科疾病的發病率。

權利要求書

1.?一種抑菌抗病毒衛生巾,其特征在于,所述衛生巾的表面接枝有干擾素-α。2.?根據權利要求1所述的抑菌抗病毒衛生巾,其特征在于,所述干擾素-α是通過光化學固定技術接枝在衛生巾表面的。3.?根據權利要求2所述的抑菌抗病毒衛生巾,其特征在于,先將所述干擾素-α形成光活性干擾素-α,然后在紫外線的照射下,將光活性干擾素-α接枝在衛生巾表面。4.?根據權利要求3所述的抑菌抗病毒衛生巾,其特征在于,采用干擾素-α與(4-疊氮苯甲酸基)琥珀亞酰胺反應形成光活性干擾素-α。5.?根據權利要求4所述的抑菌抗病毒衛生巾,其特征在于,所述光活性干擾素-α的制備步驟如下:(1)往反應容器中加入(4-疊氮苯甲酸基)琥珀亞酰胺的DMF/PBS溶液,加入干擾素-α后再加入DMF/PBS溶液,其中干擾素-α與DMF/PBS溶液總體積的比例為1μg:1mL;(2)在3~5℃及閉光條件下,冰浴攪拌24~48h;(3)將產物在3~5℃下冷凍離心。6.?根據權利要求5所述的抑菌抗病毒衛生巾,其特征在于,所述(4-疊氮苯甲酸基)琥珀亞酰胺的DMF/PBS溶液中,(4-疊氮苯甲酸基)琥珀亞酰胺的濃度為6×10mg/mL~8×10mg/mL。7.?根據權利要求5所述的抑菌抗病毒衛生巾,其特征在于,所述冷凍離心的設定為:離心1h,暫停0.5h,循環6次,轉速4000rp/min。8.?根據權利要求1所述的抑菌抗病毒衛生巾,其特征在于,所述干擾素-α的濃度為5-100ng/cm。9.?根據權利要求1所述的抑菌抗病毒衛生巾,其特征在于,所述衛生巾為ABC品牌護墊或護舒寶品牌衛生巾。10.?根據權利要求9所述的抑菌抗病毒衛生巾,其特征在于,當所述衛生巾為ABC品牌護墊時,所述干擾素-α的濃度為5-10ng/cm;當所述衛生巾為護舒寶品牌衛生巾時,所述干擾素-α的濃度為50-100?ng/cm。

說明書

技術領域

本發明涉及女性用品領域,具體地,涉及一種抑菌抗病毒衛生巾。

背景技術

一、衛生巾的現狀。

衛生巾是婦女經期使用品,是一種高吸水性聚合物(SAPS),由于其具有良好的吸收性、不滲透性、柔軟、舒適、衛生、使用簡單、攜帶方便等優點,已取代傳統的衛生紙,被廣大婦女接受而成為必備的生理衛生用品。

通過調查發現,月經期間,細菌可逆行進入陰道,不注意經期衛生,濫用不潔衛生紙,致使外陰受不潔衛生紙和月經棉塞污染,病菌乘機滋生進犯。不少婦女受到婦科疾病的困擾。使用不合格的衛生巾,有38%的人患有嚴重的婦科疾病,73%的女性會在經期感到局部皮膚瘙癢、燒灼、灼痛,80%左右的女性用上不潔的衛生巾后,還會在經期出現高燒、頭痛、腹痛等癥狀。普通衛生巾連續使用2小時后,表層細菌總數可達107個/cm2。

市場上的各種抗菌劑,均會在一定程度上破壞細胞結構,損傷細胞,安全性不高、毒性及對皮膚和陰道粘膜的刺激都較大,缺乏穩定性。

二、重組人干擾素α

干擾素(interferon,IFN)是一種具有抗病毒作用、抗增殖和免疫調節功能的細胞因子。它在宿主天然免疫防御中起著重要的作用。根據受體復合物的不同,可將干擾素分為I、II、III型。I型干擾素包括13種IFN-α亞型,IFN-β、IFN-δ、IFN-κ、IFN-ω、IFN-τ;II型干擾素包括IFN-γ;III型干擾素包括IFN-λ或稱IL-28/29。干擾素經誘導產生后,通過與不同受體結合激發不同的信號轉導通路,進而刺激下游效應蛋白的產生,通過這些效應蛋白途徑最終發揮抗病毒作用。因此,干擾素目前在臨床中主要用于治療乙肝病毒(HBV)和丙肝病毒(HCV)感染,以及其他一系列病癥,如惡性腫瘤和多發性硬化癥等。

干擾素局部使用可使病變局部及其相鄰的正常組織細胞產生抗病毒蛋白(2’-5’寡腺苷酸合成酶,蛋白激酶,磷酸二腺酶等),阻斷病毒的復制;同時干擾素可提高自然殺傷細胞(NK細胞)對病毒的殺傷活性,增強單核巨噬細胞的吞噬功能,增強T細胞的殺傷作用和天然殺傷細胞的功能,從而達到抗病毒的作用。此外,干擾素的激素樣作用還可調節體內雌二醇和孕酮的水平,使宮頸分泌物減少,改善陰道內環境,也有利于阻斷病毒的復制。將抗病毒藥物以外用的方式應用于婦科,無耐藥性,使用方便,無明顯副反應,是近年藥物治療慢性宮頸炎比較滿意的藥物。

重組人干擾素α(recombinant?human?interferon,rh-IFN-α)是病毒感染和惡性腫瘤的重要治療藥物,臨床用于治療乙型肝炎、丙型肝炎、生殖器疣及皰疹等病毒性疾病,毛細胞白血病、粒細胞白血病等。

三、光化學固定技術。

光化學固定法是指利用紫外或可見光(200-800nm)將具有特定功能的分子或組分偶聯到材料表面的方法,其原理是利用帶有雙官能團(一般來說,其一為熱活性基團,另一為光活性基團)的光偶聯劑將生物活性化合物分子偶聯到材料表面來達到改性表面的目的]。其途徑通常分為兩類:(1)將目的分子與光偶聯劑上的熱活性基團進行化學反應,形成帶有光活性基團的衍生物,然后進行光化學反應使目的分子共價偶聯到高分子材料表面;(2)首先用光偶聯劑對高分子材料表面進行光化學處理,然后再通過光偶聯劑上的熱活性基團與目的分子發生反應。

光化學固定法可以提高高分子材料的表面性能而完全不影響材料的本體性質。光化學固定接枝技術能大大地降低目的涂層試劑在醫用高分子材料表面產生的無序交聯,這樣的改性表面比用其他表面涂層方法所得的表面有更顯著的特定活性。

光化學固定法比自由基、等離子等表面接枝反應有更多的優點:它在一分鐘內進行極快的反應;可以通過真正的“一步”過程形成穩定的碳、碳鍵;同時容易在普通的加工條件下使用(不使用真空或控溫儀器等復雜裝置);適用于幾乎所有的高聚物表面;能成功地固定各種類型的可溶的合成高分子和生物高分子;可以再“掩蔽曝光”條件下進行特定位點的接枝和多次涂層。

從上個世紀90年代初開始,國內外研究者對光化學固定法的研究已經有了很大發展。光化學固定法能將被接枝物質(如多肽、酶、生長因子、蛋白質等)接枝在生物醫用高分子材料表面,制備出具有各種活性、各種用途的的生物醫用材料。研究表明,光化學固定后生物醫用材料等的各種活性比游離的、空白的生物醫用材料明顯增強。

四、生物材料。

生物材料也稱為生物醫學材料,是指以醫療為目的,用于與生物組織接觸以形成功能的無生命的材料,如骨,它是一種具有良好的機械性能的,蛋白質和礦物質組合的納米復合材料。目前,生物材料主要包括醫用高分子材料、生物陶瓷、醫用金屬材料等。其中高分子材料主要應用在人體器官、醫療器械和藥物劑型三個方面:人工器官包括內臟和體外裝置;醫療器械應用在一般醫療及看護工具、麻醉即手術室用具、檢查及檢查室用具;藥物劑型主要應用在藥物的助劑和聚合物藥物的合成,主要方法是將高分子藥物,以惰性水溶性聚合物作分子載體,把具有藥性的高分子化合物,通過共價鍵或離子鍵與載體的測基連接,制成聚合物藥物。

發明內容

近年來,婦科疾病的發病率普遍增高,通過調查發現,這可能是由于月經期間,細菌可逆行進入陰道,不注意經期衛生,濫用不潔衛生紙,致使外陰受不潔衛生紙和月經棉塞污染,病菌乘機滋生進犯。衛生巾是婦女經期使用的生理衛生產品,具有良好的吸收性,被廣大婦女所接受。本發明的目的在于克服現有衛生巾容易被細菌病毒污染的缺陷,提供一種抑菌抗病毒衛生巾。

為了達到上述目的,本發明提供一種抑菌抗病毒衛生巾,其中所述衛生巾的表面接枝有干擾素-α(即IFN-α,特別為IFN-α2b)。接枝IFN-α的衛生巾具有抑菌抗病毒、生物安全性高的特征,能有效地減少因衛生巾的使用不當而引起的婦科疾病的發病率。

本發明首次將具有抗病毒作用的干擾素-α接枝在衛生巾表層材料上,得到一種新型生物材料。在使用衛生巾的同時,干擾素-α也發揮了作用,與其他干擾素膏劑或凝膠劑等相比,它是通過皮膚角質層接觸,可減少藥物進入血液循環,從而避免增加血藥濃度帶來的副作用。由于干擾素-α的抗病毒作用,大大地提升了衛生巾的安全性。

上述干擾素-α可以通過各種現有的方式接枝到衛生巾表面。由于光化學固定技術是本發明發現的較為成熟的實驗方法,所以,所述干擾素-α優選地是通過光化學固定技術接枝在衛生巾表面的。本發明主要從檢驗這種新型生物材料的抑菌和抗病毒能力為出發點。本發明首次將干擾素利用光化學固定技術固定在衛生巾表面制備成新型生物材料。

如上所述,可以通過多種途徑完成光化學固定。優選地,先將所述干擾素-α形成光活性干擾素-α,然后在紫外線的照射下,將光活性干擾素-α接枝在衛生巾表面。

光活性干擾素-α是指帶有光活性基團的干擾素-α,優選采用干擾素-α與N-(4-疊氮苯甲酸基)琥珀亞酰胺反應形成光活性干擾素-α。

在一個優選的實施方式中,所述光活性干擾素-α的制備步驟如下:

(1)往反應容器中加入N-(4-疊氮苯甲酸基)琥珀亞酰胺的DMF/PBS溶液,加入干擾素-α后再加入DMF/PBS溶液,其中干擾素-α與DMF/PBS溶液總體積的比例為1μg:1mL;

(2)在3~5℃及閉光條件下,冰浴攪拌24~48h;

(3)將產物在3~5℃下冷凍離心。

優選地,所述N-(4-疊氮苯甲酸基)琥珀亞酰胺的DMF/PBS溶液中,N-琥珀亞酰胺的濃度為6×10-3mg/mL~8×10-3mg/mL,更優選為7.68x10-3mg/mL。

優選地,所述冷凍離心的設定為:離心1h,暫停0.5h,循環6次,轉速4000rp/min。

本發明的進一步實驗發現,干擾素-α在生物材料表面的濃度對其抑菌抗病毒作用有一定影響。對于某些衛生巾品牌,需要控制適當的干擾素-α濃度才能達到良好的抗菌效果。因此所述干擾素-α的濃度優選為5-100ng/cm2。在該濃度下,幾乎所有接枝后的衛生巾都能達到較好的抑菌效果。

所述衛生巾可以是任何種類的衛生巾,其表層材料主要是聚丙烯或者聚乙烯。優選地,所述衛生巾為ABC品牌護墊或護舒寶品牌衛生巾。當所述衛生巾為ABC品牌護墊時,所述干擾素-α的濃度優選為5-10ng/cm2;當所述衛生巾為護舒寶品牌衛生巾時,所述干擾素-α的濃度優選為50-100?ng/cm2。

對于本發明形成的新型生物材料,我們先通過電鏡掃描觀察干擾素接枝在衛生巾表層的三維空間狀況,會發現在材料表層上會有白色顆粒物質附著,確定為干擾素顆粒。因為通過光化學固定技術接枝在材料表面的干擾素IFN-α含量相對較少,只有50ng,所以在材料表層并沒有大規模出現。同時在處理接枝后的材料時,我們采用PBS溶液沖洗材料,也清除了附著在材料上的雜質和其他物質。

在這種新型生物材料抑菌實驗的檢測中,我們采用淋球菌為實驗對象,并通過貼膜擴散法驗證抑菌能力的方法。這是因為淋球菌(n.gonorrhoeae)是一種人體寄生菌,常存在與陰道炎的膿性分泌物的白細胞中,是導致婦科疾病的細菌之一。貼膜實驗主要是通過將細菌污染與抗菌制品(新型生物材料)表面,使細菌與抗菌制品表面充分接觸,以測定其抑菌效果。從實驗結果會發現,對比空白組并隨著時間的增加,接枝干擾素的材料周圍菌落相對較少,證明具有一定的抑菌能力。在以往的報道中,并沒有報道出干擾素IFN-α2b具有抑菌能力,但是本實驗結論卻證實了這一點。關于干擾素IFN-α2b通過光化學固定在衛生巾后的抑菌機理由推測如下:干擾素IFN-α2b分子通過一定途徑進入細菌內,和微生物內的核糖亞單元分子片斷相互作用,破壞了細菌體內從DNA到RNA的轉錄,阻礙mRNA的密碼子的相互作用,導致細菌繁殖終止,達到抑菌目的。

IFN具有廣譜抗病毒、免疫調節等作用,IFN結合到細胞表面受體依靠促發和誘導多種抗病毒蛋白而發揮抗病毒作用,其中PKR、2’,5’-寡腺苷酸合成酶(2’,5’-OAS)、MxA、MxB等最為重要。MxA蛋白是I型干擾素誘導產生的分布于細胞質中的蛋白質,具有廣譜的抗病毒活性,對正黏病毒、副黏病毒等有敏感的抗病毒作用,而2’,5’-OAS則是選擇性地降解病毒mRNA而發揮抑制病毒的復制。另外Fulvia?Terenzi等人報道了P56蛋白也是由干擾素誘導產生的抗病毒蛋白。為此我們通過檢驗IFN誘導產生的P56蛋白、MxA蛋白和2’,5’-OAS這三種抗病毒蛋白,間接地檢測這種新型生物材料的抗病毒作用。

本發明已完成P56蛋白的檢驗,從免疫印跡的結果可以看出,兩組材料的空白組P56蛋白含量都相對較少,而添加了IFN-α2b處理后的蛋白含量則相對較多,并且固定組的蛋白含量比游離組的含量更多。我們從這組免疫印跡的結果中,不難推斷,把光活性IFN-α接枝在材料表面,作用于HeLa細胞,會誘導細胞產生P56蛋白,并且這種蛋白的含量比游離組處理的含量更多。在接下來的實驗中,會陸續檢驗所提取的蛋白,從而間接驗證這種新型生物材料的抗病毒作用。

綜上,本文所制備的新型生物材料,即通過光化學固定技術將IFN-α接枝在衛生巾表層的材料,不僅具有抑菌也具有抗病毒作用。這種新型生物材料的抑菌作用不同與市場的抗菌藥物,它能夠減少過度使用抗菌藥物而導致的三種危害,即:抗菌藥物的濫用導致大量耐藥菌的產生,使難治性感染越來越多,病菌感染的機會越來越大,治療感染性疾病的費用也越來越高,對人類的健康構成了嚴重威脅;抗菌藥物的廣泛使用,導致人類自身對細菌免疫力的下降;抗菌藥物品種繁多,應用面廣,由其引起的不良反應。這種新型生物材料也具備抗病毒的作用,這為一些患有婦科疾病的婦女,在使用衛生巾的時,為她們提供了治療的機會。并且這種抑菌和抗病毒的衛生巾,在使用期間,由于干擾素的存在,也大大地減少了細菌或病毒伺機感染人體的機會,對婦女月經期間提供了很好的安全保障。

附圖說明

圖1為光活性干擾素α的合成原理圖。

圖2為光活性干擾素α的紫外光譜圖。

圖3為光活性干擾素α的拉曼圖譜圖。

圖4為光固定生物材料的制備過程圖。

圖5A、圖5B為光固定生物材料的電鏡掃描圖。

圖6為貼膜法過程圖。

圖7A、圖7B為光活性IFN-α的抑菌能力檢測圖。

圖8為P56蛋白免疫印跡結果。

具體實施方式

以下實施例中使用的材料、試劑與儀器如下所示:

一、材料;ABC品牌護墊、護舒寶品牌衛生巾。

二、細胞株:人子宮頸癌細胞(HeLa細胞系)、人肝星狀細胞(HSC細胞系)、人卵巢癌細胞系(OVCAR細胞系)是從中山大學醫學院動物中心購買,經本實驗室傳代培養并保存。

三、主要試劑:重組人干擾素α1b?購自中山大學第三附屬醫院;淋球菌、TB培養基、新生小牛血清購自杭州四季青生物工程材料有限公司;培養基低糖DMEM、胰酶均為?GIBCO2BRI公司產品;24?孔組織培養聚苯乙烯基板為BIOFIL?公司產品;P56抗體為SAB公司產品。

四、儀器:Nikon?顯微鏡,日本Olympus公司光學倒置顯微鏡,Sigma32184?高速冷凍離心機,Thermo?CO2?培養箱,江蘇省金壇市醫療儀器廠78-1磁力攪拌器,HV-85高壓滅菌器,無菌操作臺,廣州科橋實驗技術設備有限公司恒溫水浴鍋等。

實施例1:光活性干擾素-α的制備及檢測

光活性干擾素α的合成原理如圖1所示。具體過程如下:首先按體積比4:1配制20mL的DMF/PBS溶液(量筒稱取后加入燒杯內),同時配制7.68x10-3mg/mL的N-(4-疊氮苯甲酸基)琥珀亞酰胺的DMF/PBS溶液。取高壓滅菌的棕色瓶,加入1mL的7.68x10-3mg/mL的N-(4-疊氮苯甲酸基)琥珀亞酰胺的DMF/PBS的溶液,加入5微克的IFN-α,加入4?mL的DMF/PBS溶液,反應總體積為5mL。在棕色廣口瓶內加入一個磁力攪拌子,放到裝冰水混合物的燒杯內,棕色瓶可用錫紙包裹(封口膠),控制溫度在4℃,將攪拌機放在泡沫箱內,在閉光條件下,冰浴攪拌48h。結束后,超濾藥物:將合成的藥物轉入5mL的超濾離心管內,4℃冷凍離心機,離1h,停0.5h,循環6次,4000rp/min。

對制備好的光活性干擾素α進行紫外光譜檢測和拉曼圖譜檢測。其結果如圖2和圖3所示。

從圖2的紫外光譜中可以看出N-(4-疊氮苯甲酸基)琥珀亞酰胺的紫外吸收峰在271nm處,干擾素-α的紫外吸收峰為210nm,而合成后的光活性干擾素-α的吸收峰為221nm處,其特征峰向橋聯劑的長波方向移動,說明N-(4-疊氮苯甲酸基)琥珀亞酰胺與干擾素-α反應后產生一種新物質,我們推斷,這種新物質,即為光活性的干擾素-α。

在圖3的拉曼圖譜中,N-(4-疊氮苯甲酸基)琥珀亞酰胺的疊氮基的伸縮峰在2055處,合成后光活性干擾素-α在2138附近出現該特征峰;另外對比干擾素-α和光活性干擾素-α,兩種藥物在1300和1460處具有相同的特征峰,其中1460處存在羧基特征峰,從這組數據中,也同樣說明光活性干擾素-α藥物合成。

實施例2:光固定化材料的制備與檢測

如圖4所示,將實施例1制備的光活性干擾素-α,在紫外線的照射下,接枝在干燥的生物材料(衛生巾)表面,這個過程中要注意避光。然后取樣用PBS洗滌,通過電鏡掃描圖檢測干擾素接枝在生物材料表面的情況,結果如圖5A和圖5B所示。

在圖5A的電鏡掃描圖中,圖a是空白ABC護墊材料,放大后的圖c可以直觀發現這種材料表面相對光滑;接枝光活性藥物后,圖b與圖d中能夠顯示出材料表面出現了納米級的白色小顆粒,并且從圖像中顯示了吸附在材料表面的狀況。同樣,圖5B的電鏡掃描圖中,圖a與圖c是空白組護舒寶衛生巾材料,其三維立體結構相對雜亂,但是材料表面額是很光滑無附著物。但是通過觀察圖b與圖d,仍然能夠發現其表面的白色顆粒附著物。?

由于光活性藥物用紫外接枝在材料表面后,需要用PBS沖洗數次才能夠進行實驗觀察,所以排除了藥物只是輕貼在材料表面的情況。

綜上所述,我們通過電鏡掃描圖,成功的檢驗了光活性干擾素已接枝在材料表面,為接下來的實驗,提供了必要的保證。以下實施例均使用實施例2得到的接枝有干擾素的生物材料。

實施例3:光固定干擾素-α材料抑菌能力的檢測(貼膜擴散法)

貼膜擴散法的過程如圖6所示。具體如下:對所有實驗用品進行高溫高壓滅菌處理,用接種環挑取經TM培養基平板純化后的淋球菌(約半環)置入無菌生理鹽水(2mL),用麥氏比濁管進行對比,稀釋為約105CFU/ml左右的菌懸液,用棉拭子均勻涂布于培養基表面,培養16h后,使用無菌鑷子將六個濃度的材料接枝面朝下放置TM培養基表層,相當于模擬體內有菌環境。作用10h后,將粘附有淋球菌的各組材料轉移至新的TM培養基,接枝面朝上,并在材料表面涂抹一層培養基,重新培養15h及24h后,拍照觀察各組材料表面菌落情況,其結果如圖7A、7B所示。

在圖7A、圖7B的a、c兩幅圖中,上面的材料為空白組、下面的材料為涂有干擾素的游離組實驗;而b、d兩幅圖中,上面的材料為接枝低濃度(5-10ng/cm2)的光活性干擾素的固定組,下面的材料為接枝高濃度(50-100?ng/cm2)的光活性干擾素的固定組。

根據實驗結果可以發現,15h處理后無論是采用是ABC護墊材料的空白組和游離組,或是采用護舒寶衛生巾材料空白組和游離組的周圍,都有白色渾濁聚集物,也就是有菌落產生。隨著時間的增加,24h后,其菌落開始生長蔓延。

而接枝光活性干擾素的材料周圍,情況會相對緩和一些。但是對比ABC護墊和護舒寶衛生巾兩組材料,仍然是有區別。ABC護墊在接枝低濃度的光活性干擾素后,材料周圍菌落產生不明顯;而護舒寶衛生巾在接枝低濃度的光活性干擾素,其周圍仍然有菌落產生,但是接枝了高濃度的光活性干擾素后,其材料周圍菌落則較少。造成這種現象的原因可能是由于兩組衛生巾材料不同,因此光活性藥物接枝后會產生不同的反應。

這組實驗的原理在于干擾素具有抑制菌類生長的作用。通過這個實驗,我們推斷,接枝了光活性的干擾素的材料相對于空白組,會有較好的抑菌能力,其干擾素抑菌活性沒有消失。

實施例4:光固定干擾素-α材料抗病毒能力的檢測

為了驗證接枝在材料表面的干擾素仍然具有抗病毒效果,主要采用檢驗抗病毒蛋白的產生,驗證其生物活性。這一組實驗選用HeLa細胞為實驗材料,通過與接枝干擾素的生物材料作用兩天,并與空白組和游離組進行對照,提取P56蛋白。P56蛋白是干擾素誘導細胞產生的一種抗病毒蛋白,通過對其進行免疫印跡檢測,可以間接驗證其抗病毒效果。

具體過程如下:

接枝光活性INF-α的材料對不同細胞的生長作用:首先把材料剪成小圓形,大小與24孔PSt板的孔類似,共剪32個。在其中的12個小圓形的材料上避光加入光活性的IFN-α。用錫紙包裹,放入4℃冰箱冷凍干燥。待其干燥后用普通紫外燈照射20min。照射之后去除錫紙,用PBS洗去未接枝上去的IFN-α,共洗10次,每次10min。同時準備長勢良好的HeLa細胞4瓶,胰酶消化后血清終止,制成細胞懸液。

取出清洗干凈的24孔PSt板(板先經過洗滌,泡酸過夜,泡酒精24h,以及無菌水潤洗)兩塊,在各個孔中加入小圓形的衛生巾材料。在加入之前,材料要泡75%酒精10min,并經過無菌水潤洗。其中,第一塊板的A1至B6孔加入的是空白的衛生巾材料(即材料未加IFN-α),C1至D6每孔加入衛生巾材料后,再加入70ng游離IFN-α。在第二塊板的A1至B6孔加入經70ng光活性IFN-α處理過的小圓形衛生巾材料,并依次做好標記。把吹打均勻的細胞懸液平均加入各孔中。培養48h后細胞計數。

蛋白質樣品提取:同樣藥物處理2d后,同上述方法從PSt培養板收集細胞轉移至1.5ml的塑料離心管中,用預冷PBS緩沖液洗滌2次,置于冰上。按比例每5×106個細胞加入150-200ml的WB裂解液(每1mlWB加入1mlPMSF和5mlDTT混勻后使用),懸浮置于冰上30min。充分裂解后,于?4℃下?12000rpm?離心10min。取上清于另一1.5?ml的塑料離心管中放于-20℃保存待測。采用考馬斯亮藍法測定各蛋白質樣品的濃度,并計算電泳上樣量。電泳上樣前將樣品置于沸水中煮5-10min使蛋白變性。

Western-blot分析:制備好分離膠和濃縮膠,按標記分別上樣,放入電泳槽,接通電源電泳分離。電泳完畢將膠取出,利用電傳導將蛋白對應的轉移到硝酸纖維素膜上。轉膜完畢加入封閉液過夜后加入用TBST稀釋的一抗溶液,室溫下孵育1-2h,用TBST漂洗兩次,每次10min;再用TBS漂洗一次,10min。同上述方法二抗孵育,漂洗后加入顯色液避光顯色。可以看到蛋白質條帶。

重復上述步驟,再進行HSC細胞系和OVCAR細胞系的細胞接板收板提蛋白工作。

從圖8的免疫印跡結果可以看出,兩組材料的空白組P56蛋白含量都相對較少,而添加了IFN-α處理后的蛋白含量則相對較多,并且固定組的蛋白含量比游離組的含量偏多些。我們從這組免疫印跡的結果中,不難推斷,把光活性IFN-α接枝在材料表面,作用于HeLa細胞,會誘導細胞產生P56蛋白,并且這種蛋白的含量比游離組處理的更多。

由此推斷,把IFN-α接枝在材料上,仍然會產生含量較多的抗病毒蛋白,接枝在材料的干擾素仍然具有抗病毒作用,并且比游離組的抗病毒效果好。

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