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一種基于HEPA16肝癌細胞自噬小體DRIBBLES的B細胞疫苗及其制備方法.pdf

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一種 基于 HEPA16 肝癌 細胞 小體 DRIBBLES 疫苗 及其 制備 方法
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申請專利號:

CN201310395427.1

申請日:

20130902

公開號:

CN103463631A

公開日:

20131225

當前法律狀態:

有效性:

有效

法律詳情:
IPC分類號: A61K39/00,A61K39/39,C12N5/09,C12N5/0781,A61P35/00 主分類號: A61K39/00,A61K39/39,C12N5/09,C12N5/0781,A61P35/00
申請人: 東南大學
發明人: 王立新,曹萌
地址: 210096 江蘇省南京市四牌樓2號
優先權: CN201310395427A
專利代理機構: 南京蘇高專利商標事務所(普通合伙) 代理人: 柏尚春
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CN201310395427.1

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摘要

本發明公開了一種基于Hepa1-6肝癌細胞自噬小體-DRibbles的B細胞疫苗及其制備方法。本發明首次發現Hepa1-6肝癌細胞自噬小體-DRibbles作為一種具有佐劑功能的新型抗原載體,能夠活化B淋巴細胞產生特異性抗體并有效提呈抗原,免疫小鼠能誘導特異性的細胞和體液免疫應答。并首次以Hepa1-6肝癌細胞自噬小體-DRibbles誘導B細胞產生腫瘤特異性抗體并有效提呈腫瘤抗原。由于Hepa1-6肝癌細胞自噬小體-DRibbles是細胞自然外排成分,基于Hepa1-6肝癌細胞自噬小體-DRibbles的疫苗在提高了免疫應答能力的基礎上減少了對機體可能存在的危害,因此是一種非常有前景的新型抗原載體。

權利要求書

1.一種基于Hepa1-6肝癌細胞自噬小體-DRibbles的B細胞疫苗,其特征是這種B細胞疫苗含有Hepa1-6肝癌細胞自噬小體-Dribbles。2.一種如權利要求1所述的基于Hepa1-6肝癌細胞自噬小體-DRibbles的B細胞疫苗的制備方法,其特征是該方法按如下步驟制備:1)Hepa1-6肝癌細胞的培養:復蘇凍存的Hepa1-6肝癌細胞,用含10%(v/v)胎牛血清、100U/ml青霉素和100U/ml鏈霉素的RPMI-1640培養基,在37℃、5%(v/v)CO的恒溫培養箱中培養,每1~2天換液一次,常規0.25%(w/v)胰蛋白酶消化傳代;2)Hepa1-6肝癌細胞的處理:待步驟1)培養后的細胞待生長良好后,加入雷帕霉素、萬珂和氯化銨,雷帕霉素、萬珂和氯化銨的加入量分別為100nmol/L、200nmol/L和30mmol/L,干預Hepa1-6肝癌細胞16小時,誘導Hepa1-6肝癌細胞自噬小體-DRibbles;3)提取Hepa1-6肝癌細胞自噬小體-DRibbles:將步驟2)誘導后的細胞經離心得到沉淀,即為Hepa1-6肝癌細胞自噬小體-DRibbles;4)制備B細胞疫苗:4a)取野生C57BL/6小鼠頸椎脫臼法處死,用75%酒精浸泡5min,放于解剖板上充分暴露腹腔,分離脾臟放入PBS磷酸緩沖鹽中,用無菌磨載玻片將脾臟磨碎,經200目篩網濾過并收集脾臟單核細胞;4b)將步驟4a)收集的脾臟單核細胞以紅細胞裂解液裂解5min,PBS磷酸緩沖鹽洗滌,1000rpm離心10min,收獲脾臟單核細胞并制備成脾臟單核細胞懸液;4c)將CD43Dynabeads放入15ml離心管,用分離緩沖液洗滌;4d)取500ul4c)中洗滌過的dynabeads與4b)制備的單細胞懸液混勻中,室溫孵育25min;4e)加分離緩沖液,并吹打混勻dynabeads-脾細胞,放入磁場2min,上清液轉移至另一離心管;4f)重復步驟4e),收取上清,1000rpm離心10min,沉淀即為收獲的B細胞,之后RPMI-1640培養液重懸B細胞至2×10個/ml;4g)將制備好的B細胞與Hepa1-6肝癌細胞自噬小體-DRibbles混合孵育6小時,得基于Hepa1-6肝癌細胞自噬小體-DRibbles的B細胞疫苗。3.根據權利要求2所述的一種基于Hepa1-6肝癌細胞自噬小體-DRibbles的B細胞疫苗的制備方法,其特征在于,步驟3)中,提取Hepa1-6肝癌細胞自噬小體-DRibbles具體包含如下步驟:3a)將Hepa1-6肝癌細胞自噬小體-DRibbles及培養液倒入離心管中,低速離心1200rpm,10min;3b)將步驟3a)離心后的上清倒入超速離心管,高速離心12000rpm,30min,4℃;3c)將步驟3a)離心后沉淀的細胞用磷酸鹽緩沖液重懸,低速離心1200rpm,10min,將低速離心后的上清再次倒入另一超速離心管中,高速離心12000rpm,30min,4℃;3d)將步驟3b)和3c)兩次高速離心后得到的沉淀用磷酸鹽緩沖液重懸,合并,12000rpm高速離心30min,4℃;3e)棄步驟3d)得到的上清,沉淀即為Hepa1-6肝癌細胞自噬小體-DRibbles,將沉淀用磷酸鹽緩沖液重懸后分裝,凍存于-20℃,備用。

說明書

技術領域

本發明屬于腫瘤疫苗研制技術領域,具體涉及為一種基于Hepa1-6肝癌細胞自噬小體-DRibbles的B細胞疫苗及其制備方法。

背景技術

自噬(autophagy)是普遍存在的細胞生物學現象,是指胞漿組分及細胞器被包裹形成自噬小體(autophagosome),然后與溶酶體融合形成自噬溶酶體(autolysosome),最終實現胞內物質降解的過程。

大量研究結果顯示:采用自噬抑制劑(3-AM、wortmannin)、siRNA技術下調自噬相關基因(Atg12)等方法抑制腫瘤細胞的自噬,則明顯降低DC基于樹突狀細胞交叉提呈腫瘤抗原的免疫效果;反之,采用自噬誘導劑(rapamycin、NH4CL)、饑餓等方法誘導腫瘤細胞產生細胞自噬,則明顯增強DC交叉提呈的免疫效果----pAPC交叉提呈自噬小體源性抗原的效果明顯強于腫瘤細胞和可溶性蛋白。提示:腫瘤細胞的細胞自噬及其形成的自噬小體(autophagosome)與pAPC的抗原提呈有直接的關系,利用自噬小體的抗原呈遞功能可為腫瘤免疫治療提供一種新策略。因此,腫瘤細胞的自噬小體是腫瘤抗原的有效載體。

依據腫瘤免疫學的基本原理,細胞免疫應答在抗腫瘤免疫應答中起著主要作用,但大多數腫瘤細胞表面缺乏免疫共刺激分子,自身無法激活初始T細胞,必須依賴專職抗原提呈細胞(pAPC)通過交叉提呈(cross-presentation)方式提呈腫瘤抗原并誘導特異性T細胞應答。然而,在腫瘤發生發展過程中,腫瘤抗原不能有效呈遞給T細胞是導致免疫逃逸的重要原因。同時在荷瘤機體中,由于存在抗原遞呈細胞的功能低下甚至缺陷,可造成腫瘤細胞逃避機體的免疫監視,導致腫瘤的形成和發展。目前,基于樹突狀細胞(DC)的腫瘤疫苗被認為是最常見的腫瘤疫苗之一,已開展大量基礎研究和臨床試驗。然而,研究試驗中存在許多問題有待解決,包括DC來源、制備過程、DC的抗原負載、用量、使用頻度、免疫途徑和次數等,都大大的限制了DC的使用。如何更好的利用其他pAPC提呈腫瘤抗原成為目前關注的熱點。

B細胞除介導體液免疫外也是重要的pAPCs。B細胞表面組成型表達MHC?II類分子,白細胞介素-4刺激后表達增加;但必須通過抗原受體與抗原交聯并由Th細胞提供協助之后才能激活協同刺激分子的表達。在胸腺依賴抗原誘導的抗體產生中起重要作用。由于血液中B細胞在白細胞的比例達到20%-30%,并且易于分離、制備。因此,利用B細胞有效提呈抗原將極大的促進腫瘤疫苗的發展。

佐劑(Adjuvant)又稱免疫調節劑(Immuno-modulator)或免疫增強劑(Immune?potentiator),是指先于抗原或與抗原混合或同時注入動物體內,能非特異性地改變或增強機體對該抗原的特異性免疫應答,發揮輔助作用的一類物質。佐劑的種類繁多,其增強機體免疫應答的機理各不相同,可以增強抗原的免疫原性、免疫應答速度及耐受性,可調節抗體對抗原的親和性與專一性,可刺激細胞介導的免疫,可促進胃腸黏膜對疫苗的吸收。近來發現,Toll樣受體(Toll-like?receptors,TLRs)在B細胞活化以及B細胞作為pAPCs過程中也發揮重要的佐劑作用,特別是在決定B細胞對特異抗原是產生免疫激活還是免疫耐受時,病原體相關分子模式(Pathogen-associated?molecular?patterns,PAMPs)與TLRs結合產生的信號是重要的開關。TLR不但識別外源性PAMP(如LPS、肽聚糖、脂肽和CpG等),還可識別內源性損傷相關分子模式(damage-associated?molecular?patterns,DAMP),如熱休克蛋白(HSP90,HSP94),鈣網織蛋白(calreticulin),高遷移率族蛋白B1(HMGB1)等,在B細胞增殖分化、產生抗體及類別轉換等起調節作用。由于靶向腫瘤的蛋白及多肽的疫苗激發免疫應答的強度不夠。因此,如何有效地利用PAMP、DAMP等TLR配體對多肽腫瘤疫苗的佐劑效應,越來越受到人們的關注。

發明內容

技術問題:本發明所要解決的技術問題,是提供一種基于Hepa1-6肝癌細胞自噬小體-DRibbles的B細胞疫苗,及這種疫苗的制備方法。

技術方案:為解決上述技術問題,本發明采用的技術方案如下:

首先本發明提供一種基于Hepa1-6肝癌細胞自噬小體-DRibbles的B細胞疫苗,這種B細胞疫苗能夠提呈Hepa1-6肝癌細胞自噬小體-DRibbles所含有的腫瘤抗原。

本發明還提供這種基于Hepa1-6肝癌細胞自噬小體-DRibbles的B細胞疫苗的制備方法,方法按如下步驟制備:

1)Hepa1-6肝癌細胞的培養:

復蘇凍存的Hepa1-6肝癌細胞,用含10%(v/v)胎牛血清、100U/ml青霉素和100U/ml鏈霉素的RPMI-1640培養基,在37℃、5%(v/v)CO2的恒溫培養箱中培養,每1~2天換液一次,常規0.25%(w/v)胰蛋白酶消化傳代;

2)Hepa1-6肝癌細胞的處理:

待步驟1)培養后的細胞待生長良好后,加入雷帕霉素、萬珂和氯化銨,雷帕霉素、萬珂和氯化銨的加入量分別為100nmol/L、200nmol/L和30mmol/L,干預Hepa1-6肝癌細胞16小時,誘導Hepa1-6肝癌細胞自噬小體-DRibbles;

3)提取Hepa1-6肝癌細胞自噬小體-DRibbles:

將步驟2)誘導后的細胞經離心得到沉淀,即為Hepa1-6肝癌細胞自噬小體-DRibbles;

4)制備B細胞疫苗:

4a)取野生C57BL/6小鼠頸椎脫臼法處死,用75%酒精浸泡5min,放于解剖板上充分暴露腹腔,分離脾臟放入PBS磷酸緩沖鹽中,用無菌磨載玻片將脾臟磨碎,經200目篩網濾過并收集脾臟單核細胞;

4b)將步驟4a)收集的脾臟單核細胞以紅細胞裂解液裂解5min,PBS磷酸緩沖鹽洗滌,1000rpm離心10min,收獲脾臟單核細胞并制備成脾臟單核細胞懸液;

4c)將CD43Dynabeads(小鼠CD43陰選磁珠,英駿公司)放入15ml離心管,用分離緩沖液洗滌;

4d)取500ul4c)中洗滌過的dynabeads與4b)制備的單細胞懸液混勻中,室溫孵育25min;

4e)加分離緩沖液,并吹打混勻dynabeads-脾細胞,放入磁場2min,上清液轉移至另一離心管;

4f)重復步驟4e),收取上清,1000rpm離心10min,沉淀即為收獲的B細胞,之后RPMI-1640培養液重懸B細胞至2×106個/ml;

4g)將制備好的B細胞與Hepa1-6肝癌細胞自噬小體-DRibbles混合孵育6小時,得基于Hepa1-6肝癌細胞自噬小體-DRibbles的B細胞疫苗。

這種基于Hepa1-6肝癌細胞自噬小體-DRibbles的B細胞疫苗的制備方法,步驟3)中,提取Hepa1-6肝癌細胞自噬小體-DRibbles具體包含如下步驟:

3a)將Hepa1-6肝癌細胞自噬小體-DRibbles及培養液倒入離心管中,低速離心1200rpm,10min;

3b)將步驟3a)離心后的上清倒入超速離心管,高速離心12000rpm,30min,4℃;

3c)將步驟3a)離心后沉淀的細胞用磷酸鹽緩沖液重懸,低速離心1200rpm,10min,將低速離心后的上清再次倒入另一超速離心管中,高速離心12000rpm,30min,4℃;

3d)將步驟3b)和3c)兩次高速離心后得到的沉淀用磷酸鹽緩沖液重懸,合并,12000rpm高速離心30min,4℃;

3e)棄步驟3d)得到的上清,沉淀即為Hepa1-6肝癌細胞自噬小體-DRibbles,將沉淀用磷酸鹽緩沖液重懸后分裝,凍存于-20℃,備用。

有益效果:本發明首次發現提取自藥物處理的Hepa1-6肝癌細胞自噬小體-DRibbles,這種腫瘤細胞來源的自噬小體-DRibbles作為一種能夠交叉提呈抗原的新型載體,可募集更多的腫瘤抗原成分,同時其自身組織和結構特點可以作為佐劑誘導B細胞有效提呈腫瘤抗原并產生腫瘤特異性抗體,從而更有效地激發針對腫瘤的特異性T細胞應答,以清除腫瘤細胞。由于Hepa1-6肝癌細胞自噬小體-DRibbles是細胞天然外排成分,因此基于Hepa1-6肝癌細胞自噬小體-DRibbles的B細胞疫苗在提高免疫應答能力的基礎上減少了對機體可能存在的危害,是一種非常有前景的新型腫瘤疫苗。

附圖說明

圖1為電鏡觀察Hepa1-6肝癌細胞自噬小體-DRibbles的形態×10000。

圖2為Hepa1-6肝癌細胞自噬小體-DRibbles體外誘導B細胞增殖以及IgM類抗體的分泌(一)。

圖3為Hepa1-6肝癌細胞自噬小體-DRibbles體外誘導B細胞增殖以及IgM類抗體的分泌(二)。

圖4為Hepa1-6肝癌細胞自噬小體-DRibbles體內誘導B細胞產生特異性抗體(一)。

圖5為Hepa1-6肝癌細胞自噬小體-DRibbles體內誘導B細胞產生特異性抗體(二)。

圖6為Hepa1-6肝癌細胞自噬小體-DRibbles體內誘導B細胞產生特異性抗體(三)。

圖7為Hepa1-6肝癌細胞自噬小體-DRibbles體內誘導B細胞產生特異性抗體(四)。

圖8為Hepa1-6肝癌細胞自噬小體-DRibbles體內誘導B細胞產生特異性抗體(五)。

圖9為Hepa1-6肝癌細胞自噬小體-DRibbles體內誘導B細胞產生特異性抗體(六)。

圖10為Hepa1-6肝癌細胞自噬小體-DRibbles活化B細胞并介導特異性細胞免疫應答(一)。

圖11為Hepa1-6肝癌細胞自噬小體-DRibbles活化B細胞并介導特異性細胞免疫應答(二)。

圖12為Hepa1-6肝癌細胞自噬小體-DRibbles活化B細胞并介導特異性細胞免疫應答(三)。

圖13為Hepa1-6肝癌細胞自噬小體-DRibbles活化B細胞并介導特異性細胞免疫應答(四)。

圖14為Hepa1-6肝癌細胞自噬小體-DRibbles活化B細胞并介導特異性細胞免疫應答(五)。

圖15為Hepa1-6肝癌細胞自噬小體-DRibbles活化B細胞并介導特異性細胞免疫應答(六)。

圖16為B細胞/OVA+DRibbles刺激初始CD8+T細胞增殖分化及產生干擾素(一)。

圖17為B細胞/OVA+DRibbles刺激初始CD8+T細胞增殖分化及產生干擾素(二)。

圖18為B細胞/OVA+Hepa1-6肝癌細胞自噬小體-DRibbles對E.G7荷瘤小鼠的治療作用(一)。

圖19為B細胞/OVA+Hepa1-6肝癌細胞自噬小體-DRibbles對E.G7荷瘤小鼠的治療作用(二)。

圖20為HMGB1拮抗物對Hepa1-6肝癌細胞自噬小體DRibble活化B細胞的影響(一)。

圖21為HMGB1拮抗物對Hepa1-6肝癌細胞自噬小體DRibble活化B細胞的影響(二)。

圖22為HMGB1拮抗物對Hepa1-6肝癌細胞自噬小體DRibble活化B細胞的影響(三)。

圖23為HMGB1拮抗物對Hepa1-6肝癌細胞自噬小體DRibble活化B細胞的影響(四)。

圖24為TLR2拮抗物對Hepa1-6肝癌細胞自噬小體DRibble活化B細胞的影響(一)。

圖25為TLR2拮抗物對Hepa1-6肝癌細胞自噬小體DRibble活化B細胞的影響(二)。

具體實施方式

根據下述實施例,可以更好地理解本發明。然而,本領域的技術人員容易理解,實施例所描述的內容僅用于說明本發明,而不應當也不會限制權利要求書中所詳細描述的本發明。

實施例1:電鏡觀察Hepa1-6肝癌細胞自噬小體-DRibbles的形態

將提取好的Hepa1-6肝癌細胞自噬小體-DRibbles12000rpm高速離心使其沉淀并壓縮緊密,棄上清,Hepa1-6肝癌細胞自噬小體-DRibbles沉淀用2.5%(v/v)戊二醛固定,送電鏡室進行處理,上鏡觀察Hepa1-6肝癌細胞自噬小體-DRibbles的形態。

如圖1所示:電鏡下可見Hepa1-6肝癌細胞自噬小體-DRibbles為雙層膜結構的小體,平均直徑約為300nm-1μm(箭頭所指),證實有效募集了肝癌細胞的自噬小體。

實施例2:Hepa1-6肝癌細胞自噬小體-DRibbles體外誘導B細胞增殖以及IgM類抗體的分泌

1.Hepa1-6肝癌細胞自噬小體-DRibbles體外誘導B細胞增殖以及IgM類抗體的分泌

①Hepa1-6肝癌細胞自噬小體-DRibbles刺激B細胞增殖實驗

取C57/BL6小鼠脾細胞,用CD43陰選磁珠分離小鼠脾臟B細胞,5uM?CFSE標記B細胞。之后用10ug/ml?Hepa1-6肝癌細胞自噬小體-DRibbles、Hep1-6細胞裂解液及10ug/ml?LPS分別刺激CFSE標記的B細胞。5天后,1000rpm離心收集B細胞,流式細胞儀鑒定CFSE+B細胞的分裂及比例。

如圖2所示,Hepa1-6肝癌細胞自噬小體-DRibbles刺激的B細胞5天后,能促進31.6%的B細胞分裂,而細胞裂解液刺激B細胞僅能促進7.1%的B細胞分裂。說明和細胞裂解液相比,Hepa1-6肝癌細胞自噬小體-DRibbles能有效促進B細胞的增殖。

②Hepa1-6肝癌細胞自噬小體-DRibbles促進B細胞分泌IgM

取C57/BL6小鼠脾細胞,用CD43陰選磁珠分離小鼠脾臟B細胞,用10μg/ml?Hepa1-6肝癌細胞自噬小體-DRibbles、Hepa1-6細胞裂解液及10ug/ml?LPS分別刺激脾細胞、B細胞。72h后,1000rpm離心收集細胞培養上清液,ELISA鑒定細胞培養上清液中IgM的水平。

如圖3所示:和細胞裂解液相比,Hepa1-6肝癌細胞自噬小體-DRibbles刺激B細胞后,能有顯著提高細胞培養上清液中IgM的水平。說明Hepa1-6肝癌細胞自噬小體-DRibbles能有效促進B細胞分泌IgM。

實施例3:Hepa1-6肝癌細胞自噬小體-DRibbles體內誘導B細胞產生特異性抗體

在第1、2、3天用Hepa1-6肝癌細胞自噬小體-DRibbles經尾靜脈注射C57/BL6小鼠(30ug總蛋白/只),第七天眼眶采血,分離血清(-20℃冷凍保存)。

1.血清中IgM、IgG檢測(ELISA法)

①用anti-mouse?IgM或IgG(1:10000)包被96孔板,4℃過夜。

②用PBST(含0.5%吐溫的磷酸緩沖鹽PBS)洗板3次,每次3min。之后用2%的羊血清封閉液封閉,37℃,2h。

③PBST洗板3次。血清樣本按(1:500,1:1000,1:2000…)進行倍比稀釋,加入封閉好的96孔板內,37℃孵育1h。

④PBST洗板5次,加入HRP-antimouse-IgM或IgG(1:10000),37℃孵育1h。

⑤PBST洗板5次,加入TMB顯色液,37℃孵育15min。

⑥加入H2SO4終止液,450nm測定OD值。

如圖4、圖5所示,Hepa1-6肝癌細胞自噬小體-DRibbles尾靜脈注射小鼠能促進小鼠血清IgM和IgG的分泌。

2.用流式細胞術鑒定血清抗體腫瘤抗原特異性

①Ependorf管收集Hep1-6和B16F10細胞(1*106),1000rpm離心10min,棄培養液。

②5%羊血清封閉30min(4℃),PBS洗2次,每次10min。

③血清樣本按(1:500,1:1000,1:2000.….)進行倍比稀釋,加入封閉好的Ependorf管中,37℃孵育1h。

④磷酸緩沖鹽PBS洗2次,加入FITC標記的anti-mouse?IgM或IgG(1:1000),37℃孵育1h。

⑤磷酸緩沖鹽PBS洗2次,流式細胞儀鑒定。

如圖6、圖7所示,Hepa1-6肝癌細胞自噬小體-DRibbles尾靜脈注射誘導小鼠分泌的IgM和IgG能與Hepa1-6肝癌細胞特異性結合,而不能與B16F10細胞結合。說明Hepa1-6肝癌細胞自噬小體-DRibbles誘導的抗體具有Hepa1-6肝癌抗原特異性。

3.免疫熒光法鑒定血清抗體腫瘤抗原特異性

①Hep1-6和B16F10細胞接種于96孔培養板內,待細胞貼壁后,棄培養液,丙酮4℃固定細胞15min。

②5%羊血清封閉1h(4℃),PBST洗板三次,每次3min。

③血清樣本按(1:500,1:1000,1:2000….)進行倍比稀釋,加入封閉好的96孔板內,37℃孵育1h。

④PBST洗板5次,加入FITC-antimouse-IgM或IgG(1:1000),37℃孵育1h。

⑤PBST洗板5次,DAPI進行細胞核染色。

⑥PBS洗板3次,熒光顯微鏡下觀察。

如圖8、圖9所示,Hepa1-6肝癌細胞自噬小體-DRibbles尾靜脈注射誘導小鼠分泌的血清IgM和IgG能與Hepa1-6肝癌細胞膜特異性結合,而不能與B16F10細胞膜結合。說明Hepa1-6-DRibbles誘導的抗體具有Hepa1-6肝癌抗原特異性。

實施例4:Hepa1-6肝癌細胞自噬小體-DRibbles活化B細胞并介導特異性細胞免疫應答

1.Hepa1-6肝癌細胞自噬小體-DRibbles促進B細胞的活化

取C57/BL6小鼠脾細胞,用CD43陰選磁珠分離小鼠脾臟B細胞,用10ug/ml?Hepa1-6肝癌細胞自噬小體-DRibbles刺激B細胞。72h后,1000rpm離心收集B細胞,本別加入anti-mouse?H2-Kb,I-Ab,CD40,CD86等單克隆抗體染色(4℃,30min),PBS洗2次。流式細胞儀鑒定上述MHC分子及共刺激分子的表達情況。

如圖10所示:Hepa1-6肝癌細胞自噬小體-DRibbles刺激B細胞后,能有顯著上調MHC?Ⅰ、MHC?Ⅱ、CD40和CD86的表達。說明Hepa1-6肝癌細胞自噬小體-DRibbles能有效促進B細胞的活化。

2.B細胞提呈Hepa1-6肝癌細胞自噬小體-DRibbles抗原誘導T細胞應答

①Hepa1-6肝癌細胞自噬小體-DRibbles(30μg/ml)經腹股溝淋巴結免疫BALB/C及C57/BL6小鼠,7天后,取小鼠淋巴結細胞(圖11)。取野生型C57/BL6小鼠脾細胞,分離提取小鼠B細胞并與Hepa1-6肝癌細胞自噬小體-DRibbles共孵育6h,收集B細胞,PBS洗3次。Hepa1-6肝癌細胞自噬小體-DRibbles免疫BALB/C及C57/BL6小鼠淋巴結細胞分別與Hepa1-6肝癌細胞自噬小體-DRibbles、B細胞(與Hepa1-6肝癌細胞自噬小體-DRibbles預孵育)共培養72h,收集細胞培養上清,ELISA檢測干擾素-γ含量。

②取Hepa1-6肝癌細胞自噬小體-DRibbles免疫的C57/BL6小鼠淋巴結細胞,分離CD4+T細胞和CD8+T細胞。采用尾靜脈快速注射法,于實驗的第1天給C57/BL6小鼠注射Flt3-L質粒,劑量為2~6μg/只,10天后,按照相同方法及劑量注射GM-CSF質粒,5天后收獲小鼠脾臟細胞制備DC;分離提取野生型C57/BL6小鼠B細胞,將CD4+T、CD8+T細胞與B細胞、DC分別與按(1:1,1:0.3,1:0.1,1:0)不同比例混合,并加入10μg/ml?Hepa1-6肝癌細胞自噬小體-DRibbles共培養,72h后收集細胞培養上清,ELISA法檢測細胞培養上清中的干擾素-γ的含量。

3.ELISA法測定細胞培養上清中干擾素-γ和白細胞介素-4(eBioscience?ELISA?kit)

①按說明書要求稀釋捕獲抗體(capture?antibody),以100ml/孔量包被96孔板,4℃過夜;

②棄去孔中液體,洗滌液洗5次(每孔>250ml),每次1min,吸水紙上拍干;

③將5×的稀釋液稀釋至1×,每孔加入200ml,室溫封閉1h;

④棄去孔中液體,洗滌液洗5次.用1×的稀釋液按要求稀釋標準品,按需要每孔加入100ml,做倍比稀釋,以繪制標準曲線。每孔加入100ml細胞培養上清,室溫孵育2h;

⑤棄去孔中液體,洗滌液洗5次。每孔加入100ml檢測抗體(用1×稀釋液按要求稀釋),室溫孵育1h;

⑥棄去孔中液體,洗滌液洗5次。每孔加入100ml?HRP標記的親和素(用1×稀釋液稀釋按要求稀釋),室溫孵育30min;

⑦在棄去孔中液體,洗滌液洗7次。每孔加入100ml顯色液,室溫孵育15min;

⑧每孔加入50ml終止液;450nm測OD值。根據標準品濃度繪制標準曲線,計算樣品濃度。

如圖12、圖13、圖14、圖15所示:Hepa1-6肝癌細胞自噬小體-DRibbles能誘導C57/BL6和BALB/C淋巴結效應T細胞分泌INF-γ,而C57/BL6B細胞與DRibbles共孵育后僅能促進C57/BL淋巴結效應T細胞分泌INF-γ,不能促進BALB/C淋巴結效應T細胞分泌INF-γ。說明B細胞能攝取Hepa1-6肝癌細胞自噬小體-DRibbles并能遞呈DRibbles抗原給效應淋巴T細胞。B細胞與Hepa1-6肝癌細胞自噬小體DRibble、CD4+T或CD8+T細胞共孵育,能顯著促進CD4+T或CD8+T細胞分泌干擾素-γ。而B細胞與Hepa1-6肝癌細胞自噬小體DRibble及CD4+T細胞共孵育,僅能促進CD4+T細胞分泌少量白細胞介素-4.上訴結果表明B細胞能攝取并遞呈Hepa1-6肝癌細胞自噬小體-DRibbles抗原,并能誘導CD4+T細胞活化。

實施例5、Hepa1-6肝癌細胞自噬小體-DRibble的制備

1)Hepa1-6肝癌細胞的培養:

復蘇凍存細胞,用含10%(v/v)胎牛血清、100U/ml青霉素和100U/ml鏈霉素的RPMI-1640培養基,在37℃、5%(v/v)CO2的恒溫培養箱中培養,每1~2天換液一次,常規0.25%(w/v)胰蛋白酶消化傳代;

2)Hepa1-6肝癌細胞的處理:

待步驟1)培養后的細胞貼壁良好,密度適中后,加入雷帕霉素、萬珂和氯化銨,雷帕霉素、萬珂和氯化銨的加入量分別為100nmol/L、200nmol/L和30mmol/L,干預Hepa1-6肝癌細胞16小時,誘導Hepa1-6肝癌細胞自噬小體-DRibbles;

3)提取Hepa1-6肝癌細胞自噬小體-DRibbles:

將步驟2)誘導后的細胞經離心得到沉淀,即為Hepa1-6肝癌細胞自噬小體-DRibbles。

其中步驟3)中,提取Hepa1-6肝癌細胞自噬小體-DRibbles具體包含如下步驟:

3a)將Hepa1-6肝癌細胞自噬小體-DRibbles及培養液倒入50ml離心管中,低速離心1200rpm,10min;

3b)將步驟3a)離心后的上清倒入圓底超速50ml離心管,高速離心12000rpm,30min,4℃;

3c)將步驟3a)離心后沉淀的細胞用PBS重懸,低速離心1200rpm,10min,將低速離心后的上清再次倒入另一圓底超速50ml離心管中,高速離心12000rpm,30min,4℃;

3d)將步驟3b)和3c)兩次高速離心后得到的沉淀用PBS重懸,合并,12000rpm高速離心30min,4℃;

3e)棄步驟3d)得到的上清,沉淀即為Hepa1-6肝癌細胞自噬小體-DRibbles,將沉淀用1ml?PBS重懸后分裝,凍存于-20℃,備用。

實施例6、基于Hepa1-6肝癌細胞自噬小體-DRibbles的B細胞疫苗的制備

a)取野生C57BL/6小鼠頸椎脫臼法處死,用75%酒精浸泡5min,放于解剖板上充分暴露腹腔,分離脾臟放入PBS磷酸緩沖鹽中,用無菌磨載玻片將脾臟磨碎,經200目篩網濾過并收集脾臟單核細胞;

b)將步驟4a)收集的脾臟單核細胞以紅細胞裂解液裂解5min,PBS磷酸緩沖鹽洗滌,1000rpm離心10min,收獲脾臟單核細胞并制備成脾臟單核細胞懸液;

c)將CD43Dynabeads(Dynabeads?mouse?CD43,Invitrogen)放入15ml離心管,用分離緩沖液洗滌;

d)取500ul4c)中洗滌過的Dynabeads與4b)制備的單細胞懸液混勻中,室溫孵育25min;

e)加分離緩沖液,并吹打混勻dynabeads-脾細胞,放入磁場2min,上清液轉移至另一離心管;

f)重復步驟4e),收取上清,1000rpm離心10min,沉淀即為收獲的B細胞,之后RPMI-1640培養液重懸B細胞至2×106個/ml;

g)將制備好的B細胞與Hepa1-6肝癌細胞自噬小體-DRibbles混合孵育6小時,得基于Hepa1-6肝癌細胞自噬小體-DRibbles的B細胞疫苗。

實施例7、基于Hepa1-6肝癌細胞自噬小體-DRibbles的B細胞疫苗對腫瘤的治療作用

純化分離OT-I小鼠的CD8+T細胞作為OVA特異性初始CD8+T細胞,以負載含有模式抗原OVA的(OVA+)DRibbles小鼠B細胞作為pAPC體外刺激OT-I/CD8+T細胞,并以OVA+DRibbles單獨刺激、B細胞/Lysate(OVA+)、DCs/OVA+DRibbles作為對照,流式細胞儀檢測顯示(圖16):B細胞/OVA+DRibbles能有效刺激初始CD8+T細胞增殖分化;隨后以負載DRibbles?B細胞作為pAPC免疫小鼠,并以B細胞、DCs/DRibbles作為對照,收獲免疫小鼠淋巴細胞,再以DRibbles直接體外刺激,ELISA檢測刺激細胞培養上清中干擾素-g顯示(圖17),B細胞/DRibbles免疫能誘導免疫應答;同時,以皮下接種E.G7細胞建立了小鼠皮下瘤模型,以淋巴結(首次免疫)+尾靜脈注射(2次追加免疫)方式實施B細胞/DRibbles免疫,結果顯示(圖18、圖19):B細胞/DRibbles免疫對小鼠淋巴瘤有一定的治療效果。上述實驗結果提示:B細胞/DRibbles疫苗能誘導初始CD8+T細胞應答并對實體瘤具有一定的治療作用。

實施例8、基于Hepa1-6肝癌細胞自噬小體-DRibbles的B細胞疫苗對TLR的作用

如何發揮TLR的配體對TLR的佐劑作用是腫瘤疫苗研究的熱點。我們首次發現腫瘤細胞自噬小體表面帶有TLR2的配體HMGB1,通過對HMGB1阻斷,會大大降低自噬小體對B細胞活化的佐劑作用(圖20、圖21、圖22、圖23)。進而我們又用TLR2的封閉抗體進行阻斷實驗,其結果也是大大降低自噬小體對B細胞活化的佐劑作用(圖24、圖25)。上述結果提示我們:我們提取的腫瘤疫苗自噬小體除了是抗原的有效載體之外,還具備佐劑的功能。其表面的HMGB1是激活TLR2通路的有效配體。

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本文標題:一種基于HEPA16肝癌細胞自噬小體DRIBBLES的B細胞疫苗及其制備方法.pdf
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