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用于緩解疲勞的組合物及其制備方法與應用.pdf

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用于 緩解 疲勞 組合 及其 制備 方法 應用
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摘要
申請專利號:

CN201210485539.1

申請日:

20121123

公開號:

CN102920857B

公開日:

20131106

當前法律狀態:

有效性:

有效

法律詳情:
IPC分類號: A61K36/87,A61P39/00,A61K35/32,A61K31/185,A61K31/375,A61K31/355 主分類號: A61K36/87,A61P39/00,A61K35/32,A61K31/185,A61K31/375,A61K31/355
申請人: 天津鑄源健康科技集團有限公司,魯延達
發明人: 魯延達
地址: 301802 天津市寶坻區九園工業園1號路
優先權: CN201210485539A
專利代理機構: 北京海虹嘉誠知識產權代理有限公司 代理人: 張濤
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法律狀態
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CN201210485539.1

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法律狀態公告日:

法律狀態類型:

摘要

本發明公開了用于緩解疲勞的組合物及其制備方法與應用。本發明所提供的用于緩解疲勞的組合物,主要由下述重量份的原料制成:牛骨髓粉50份-80份和葡萄籽提取物2份-7份。本發明還提供了該組合物的制備方法及在制備緩解疲勞的藥物中的應用。經動物試驗證明,本發明所提的組合物具有緩解疲勞的功能,且具有生產工藝簡單,使用方便,副作用小等優點。

權利要求書

1.一種用于緩解疲勞的組合物,其特征在于:所述組合物主要由下述重量份的原料制成:牛骨髓粉50份-80份、葡萄籽提取物2份-7份和牛磺酸14份-45份。2.根據權利要求1所述的組合物,其特征在于:所述組合物是以牛骨髓粉、葡萄籽提取物和牛磺酸為活性成分,加上藥學上可接受的輔料或輔助性成分制成。3.一種用于緩解疲勞的組合物,其特征在于:所述組合物主要由下述重量份的原料制成:牛骨髓粉50份-80份、葡萄籽提取物2份-7份、牛磺酸14份-45份、維生素C2份-5份和維生素E3份-6份。4.根據權利要求3所述的組合物,其特征在于:所述組合物是以牛骨髓粉、葡萄籽提取物、牛磺酸、維生素C和維生素E為活性成分,加上藥學上可接受的輔料或輔助性成分制成。5.根據權利要求1-4中任一所述的組合物,其特征在于:所述牛骨髓粉為牦牛骨髓粉。6.根據權利要求2或4所述的組合物,其特征在于:所述葡萄籽提取物為葡萄籽水提取物或葡萄籽有機溶劑提取物。7.根據權利要求2或4所述的組合物,其特征在于:所述藥學上可接受的輔料或輔助性成分為麥芽糊精和二氧化硅。8.權利要求1-7中任一所述的組合物在制備緩解疲勞的藥物中的應用。

說明書

技術領域

本發明涉及組合物的制備方法與應用,尤其涉及用于緩解疲勞的組合物及其制備方法與應用。

背景技術

疲勞(Fatigue)是機體復雜的生理生化過程,1982年《第五屆國際運動生化會議》將疲勞的概念定義為:“機體生理過程不能將其機能持續在一特定水平或各器官不能維持其預定的運動強度”。由于活動引起機體生理生化改變而導致機體運動能力暫時降低的現象,被稱為體力疲勞。按疲勞發生部位不同,將疲勞分為中樞疲勞、神經肌肉接頭疲勞和肢體外周疲勞。引起生理疲勞的原因可以是作業強度過大,能量代謝率過高,連續作業時間過長,作業條件不良等。對身體不適、睡眠不足、工作不熟練的人來說,在上述情況下更易產生生理疲勞。在疲勞影響下,人的心率、氧氣消耗量、肌肉緊張程度等都與平常有所差別,因此,生理疲勞可用儀器進行較精確地測量。疲勞常與缺乏動力、興趣或過度心理緊張等有關;可能是由于生理因素,常與過度體力活動(含勞動與運動)、職業性有害因素的作用等有關。

中醫理論認為疲勞屬“虛”、“虛勞”等范疇,包括體勞、心勞和房勞。在狀態醫學中疲勞是機體各種復雜內在變化的外在表現,存在多組織、多器官、多系統、多層次的復雜變化并伴之以心理變化。體力疲勞亦稱運動性疲勞,其本質是過性臟腑功能下降或失調和精血不足,屬生理性、功能性、暫時性的整套系列變化。這種狀態紀實不采取任何措施,通過人體自身抗疲勞系統的自我調節,可以自行消除,因此其屬于生理性疲勞、健康性疲勞。體力性疲勞的發生較為復雜,除與所受的負荷強度和運動量密切相關外,還與運動者當時的生理、心理、年齡、環境、氣候、體質及飲食起居習慣等因素相關。中醫理論認為精(津)血為體力產生的物質基礎,它的化生和運動與中醫腎、脾、肝、心有密切關系,人的耐力也由此而生。

目前已批準緩解體力疲勞的產品有六百多個,可以歸為如下幾類。第一類是補虛類中藥,如人參、西洋參、黃芪、刺五加、紅景天、淫羊藿、枸杞子、黃精等,補虛藥通過調整機體的神經——內分泌系統,免疫系統,物質代謝過程,以提高機體工作能力;第二類是人體必需的維生素和微量元素,如維生素A、維生素B、維生素C、維生素E等;第三類是經藥理學和功能學證明具有緩體功能的原料,如牛磺酸、蜂王漿、輔酶Q10、蝙蝠蛾擬青霉菌粉、L-肉堿酒石酸鹽等。這些原料或者通過補充能量,提高機體功能,達到緩解體力疲勞之功效,或者通過清除體內自由基,加速體內代謝物質清除來達到解除疲勞的功效。

牦牛骨髓粉主要含有蛋白質。蛋白質是一切細胞的主要成分,是一類重要的營養素,它是由氨基酸構成的,它構成和修補機體組織,參與構成酶、激素、免疫蛋白、神經肽等含氮化合物。

維生素C在機體內有多種功能:參與蛋白質、脂肪和糖的氧化,是體內氫的傳遞體;參與細胞內的氧化-還原反應,對組織呼吸有很大的作用。

維生素E是6-羥基苯駢二氫吡喃的衍生物,該化合物結構中兩個部位是重要的,對氧化劑十分敏感,極易被氧化,從而可以保護其他物質的羥基等免遭氧化劑的損害,還可以保護多不飽和脂肪酸分子中的雙鍵不被氧化斷裂,所以人們常稱維生素為抗氧化劑。

牛磺酸是以一種β-氨基酸的亞磺酸類似物,具有調節細胞Ca2+穩定、維持細胞滲透壓、提高抗自由基損傷的能力、穩定機體內支鏈氨基酸濃度、保護心肌線粒體功能等廣泛生物學效益。

葡萄籽提取物又稱低聚原花青素,是從葡萄籽中提取的高效抗氧化劑,其抗氧化作用機理與維生素E相似,系由于其分子結構上存在的酚羥基能將氫原子提供給氧自由基和脂自由基,自由基本身轉變為非自由基,阻斷由自由基引起的生物膜上多不飽和脂肪酸的過氧化。

在現有的緩解疲勞的產品中,未見牦牛骨髓粉、維生素C、維生素E、牛磺酸、葡萄籽提取物組成的配方。

發明內容

本發明的一個目的是提供一種用于緩解疲勞的組合物。

本發明所提供的用于緩解疲勞的組合物,其特征在于:它主要由下述重量份的原料制成:牛骨髓粉50份-80份和葡萄籽提取物2份-7份。

所述組合物是以牛骨髓粉和葡萄籽提取物為活性成分,加上藥學上可接受的輔料或輔助性成分制成。

所述組合物主要由下述重量份的原料制成:牛骨髓粉50份-80份、葡萄籽提取物2份-7份和牛磺酸14份-45份。

所述組合物是以牛骨髓粉、葡萄籽提取物和牛磺酸為活性成分,加上藥學上可接受的輔料或輔助性成分制成。

所述組合物主要由下述重量份的原料制成:牛骨髓粉50份-80份、葡萄籽提取物2份-7份、牛磺酸14份-45份、維生素C?2份-5份和維生素E?3份-6份。

所述組合物是以牛骨髓粉、葡萄籽提取物、牛磺酸、維生素C和維生素E為活性成分,加上藥學上可接受的輔料或輔助性成分制成。

所述牛骨髓粉為牦牛骨髓粉。

所述葡萄籽提取物為葡萄籽水提取物或葡萄籽有機溶劑提取物。

所述藥學上可接受的輔料或輔助性成分為麥芽糊精和二氧化硅。

所述的組合物在制備緩解疲勞的藥物中的應用也屬于本發明的保護范圍。

經動物試驗證明,本發明所提的組合物具有緩解體力疲勞的功能。經口給予小鼠受試物75、750、2250mg/kg?BW?d,連續灌胃30d,與陰性對照組比較2250mg/kg?BW?d劑量組能延長小鼠負重游泳時間,減少小鼠游泳時血清尿素的產生,減少血乳酸的產生;750mg/kg?BW?d劑量組也能減少小鼠游泳時血清尿素及血乳酸的產生,與陰性對照組比較有顯著性差異(P<0.05),各劑量組對小鼠體重及肝糖原儲備均未見影響。同時毒理學檢測結果證明,該組合物經口急性毒性試驗LD50大于21.5g/kg?BW,根據急性毒性半數致死量分級屬于無毒級。小鼠微核、小鼠精子畸形試驗、Ames試驗均為陰性。30天喂養試驗對血常規、血生化指標、臟器指數級體重、增重、進食量、食物利用率等各項指標均未見不良影響。病理組織學觀察,肝、脾、腎、胃、十二指腸、睪丸、卵巢均未見有意義的病理改變。

具體實施方式

實施例1、制備緩解疲勞的組合物

該實施例中的牦牛骨髓粉和葡萄籽提取物可用下述方法制備得到,也可從商業途徑購買得到;麥芽糊精和二氧化硅可從商業途徑購買得到。

該實施例制備得到的組合物如下:

該實施例組合物的制備方法如下:

一、原料的制備

1、制備牦牛骨髓粉:

將牦牛鮮骨經清洗除雜、粗切、細切成小骨塊后高壓蒸煮,冷卻后分離出牛油,骨塊另行加工制作牦牛骨粉,骨湯經冷卻除雜、經均質機均質后進行真空濃縮,濃縮物經噴霧干燥后即得到牦牛骨髓粉。

2、制備葡萄籽提取物

(1)加入葡萄籽5倍重量的、溫度為95℃的水進行循環提取2次,每次2小時,得到提取液;

(2)提取液冷卻到38℃過大孔樹脂;

(3)用60%的乙醇洗脫大孔樹脂;

(4)將步驟(3)所得到的洗脫液回收乙醇后,在70℃下,濃縮、干燥;

(5)將步驟(4)所得的干燥物再用5倍95%的乙醇回流提取1次,每次2小時;

(6)提取液回收乙醇后,在70℃,濃縮、干燥,即得到葡萄籽提取物。

3、過篩:取上述制備得到的牦牛骨髓粉、葡萄籽提取物,再取麥芽糊精和二氧化硅,用漩渦振蕩篩(型號ZS-650)分別過60目篩,備用。

4、混合:將牦牛骨髓粉、葡萄籽提取物、麥芽糊精和二氧化硅倒入槽形混合機(CH-90型)進行混合,混合40分鐘,得到混合粉,即得到本發明的組合物。

5、填充:用膠囊自動填充機填充膠囊,規格為0.5g/粒。操作條件要求溫度18℃-26℃,相對濕度45%-65%。填充時進行裝量差異的檢查。

6、拋光:填充合格的膠囊置膠囊拋光機中進行拋光,去除表面藥粉。過篩、混合、填充和拋光等生產環境的空氣潔凈度要求30萬級,符合GB17405-1998要求。

實施例2、制備緩解疲勞的組合物

該實施例中的牦牛骨髓粉和葡萄籽提取物可用下述方法制備得到,也可從商業途徑購買得到;牛磺酸、麥芽糊精和二氧化硅可從商業途徑購買得到。

該實施例制備得到的組合物如下:

該實施例組合物的制備方法與實施例1相同。

實施例3、制備緩解疲勞的組合物

該實施例中的牦牛骨髓粉和葡萄籽提取物可用下述方法制備得到,也可從商業途徑購買得到;牛磺酸、維生素C、維生素E、麥芽糊精和二氧化硅可從商業途徑購買得到。

該實施例制備得到的組合物如下:

該實施例組合物的制備方法與實施例1相同。

實施例4、本發明的緩解疲勞的組合物功能評價

1材料和方法

1.1樣品:上述實施例1制備的組合物膠囊A1、A2和A3;實施例2制備的組合物膠囊B1、B2和B3;實施例3制備的組合物膠囊C1、C2和C3;牦牛骨髓粉D;葡萄籽提取物E;牛磺酸F。

1.2實驗動物:選用吉林大學白求恩醫學院動物實驗中心提供的ICR清潔級雄性小鼠,體重:18g~22g,生產許可證號:SCXK-(吉)2007-0003。小鼠基礎飼料由長春市億斯實驗動物技術有限責任公司提供,生產許可證號:SCXK-(吉)2010-0001。本清潔級動物室環境設施合格證號:吉動設字10-1005號,實驗動物使用許可證號:SYXK-(吉)2010-0011,為清潔級。

1.3劑量選擇:上述實施例1-3中制備得到的組合物膠囊、牦牛骨髓粉D、葡萄籽提取物E、牛磺酸F,推薦成人(體重以60kg計),每天攝入9粒,0.5g/粒,即,75mg/kg?BW?d,以日推薦成人攝入量的1、10、30倍設置灌胃劑量,即75、750、2250mg/kg?BW?d,分別取750、7500、22500mg成品加蒸餾水至200ml,蒸餾水作陰性對照組,該試驗不需設置糖對照組。各組小鼠灌胃量均為0.2ml/10g?BW?d,連續灌胃30d。

1.4儀器與試劑:游泳箱(50cm×50cm×40cm),電子天平、鉛皮、722分光光度計、秒表,血乳酸測試酶膜,尿素測定試劑盒,肝糖原試劑盒,日本東芝TBA-120FR型全自動生化分析儀,SBA-40C型生物傳感分析儀等。

1.5實驗方法與結果

1.5.1負重游泳試驗

末次給予受試物30min后,置小鼠在游泳箱中游泳,水深約30cm,水溫(25±1)℃,鼠尾根部負荷5%體重的鉛皮。記錄小鼠自游泳開始至死亡時間,作為小鼠游泳時間(min)。

結果:受試物對小鼠負重游泳時間及小鼠增重的影響見表1。

表1.受試物對小鼠負重游泳時間及小鼠增重的影響

P:各實驗組與陰性對照組比較????*:與陰性對照組比較P<0.05

由表1可見,經口給予小鼠不同劑量的受試物C130天,各實驗組小鼠增重與陰性對照組比較無顯著性差異(P>0.05),高劑量組游泳時間長于陰性對照組,且差異有顯著性(P<0.05),說明受試物能延長小鼠負重游泳時間而對小鼠增重無影響。

同時,從表1可見,經口給予受試物A1、A2、A3、B1、B2、B3、C1、C2和C3,小鼠負重游泳時間均明顯長于經口給予受試物D、E和F的小鼠;且B1、B2、B3的效果比A1、A2、A3好,C1、C2、C3的效果比B1、B2、B3好。

1.5.2血清尿素測定

末次給予30min,在溫度為(30±0.5)℃的水中游泳90min,休息60min摘眼球采血,取血清,進行尿素含量測定(試劑盒:深圳邁瑞生物醫療電子股份有限公司提供)。采用日本東芝TBA-120FR型全自動生化分析儀測定。

結果:受試物對小鼠血清尿素及小鼠增重的影響見表2。

表2.受試物對小鼠游泳后血清尿素及小鼠增重的影響

P:各實驗組與陰性對照組比較;*:與陰性對照組比較P<0.05;**:與陰性對照組比較P<0.01。

由表2可見,經口給予小鼠不同劑量的受試物C130天,各實驗組小鼠增重與陰性對照組比較無顯著性差異(P>0.05),高、中劑量組小鼠游泳后血清尿素低于陰性對照組,且與陰性對照組比較有顯著性差異(P<0.05),說明受試物具有抑制小鼠游泳后血清尿素升高的作用而對小鼠增重無影響。

同時,從表2可見,經口給予受試物A1、A2、A3、B1、B2、B3、C1、C2和C3,小鼠游泳后血清尿素均明顯低于經口給予受試物D、E和F的小鼠;且B1、B2、B3的效果比A1、A2、A3好,C1、C2、C3的效果比B1、B2、B3好。

1.5.3肝糖原測定

末次給予受試物30min處死小鼠取肝臟,經生理鹽水漂洗后用濾紙吸干,精確稱取肝臟75mg,每管加入225μl試劑盒提供的堿溶液,用薄膜封住管口,扎一透氣孔,沸水浴20min,冷卻后加入7.2ml蒸餾水,充分混勻,按試劑說明書操作加入顯色劑,(試劑盒:南京市建成生物工程研究所提供),沸水浴5min,用722分光光度計在620nm波長進行比色測定,按說明書提供的公式換算肝糖原。

結果:受試物C1對小鼠肝糖原含量及小鼠增重的影響見表3。

表3.受試物C1對小鼠肝糖原含量及小鼠增重的影響

P:各實驗組與陰性對照組比較

由表3可見,經口給予小鼠不同劑量的受試物C130天,各實驗組小鼠增重及肝糖原含量與陰性對照組比較無顯著性差異(P>0.05),說明受試物對增加肝糖原儲備及小鼠增重未見影響。

實施例1制備的組合物膠囊A1、A2和A3,實施例2制備的組合物膠囊B1、B2和B3,實施例3制備的組合物膠囊C2和C3,牦牛骨髓粉D,葡萄籽提取物E,牛磺酸F對小鼠肝糖原含量及小鼠增重與表3無顯著差異。

1.5.4血乳酸測定

末次給予受試物30min后采血20μl,再在溫度為(30±0.5)℃的中不負重游泳10min,分別于游泳后立即(游泳后0min)和游泳后休息20min各采血20μl,采用山東省科學院生物研究所生產的生物傳感分析儀測定以上三個時間點的血乳酸值。(溶血劑及測定液均由該所提供)。以上三個時間點血乳酸曲線下面積(計算公式見后)判斷結果。

結果:受試物C1對小鼠血乳酸值及小鼠體重的影響見表4和表5。

表4.給予受試物C1的小鼠游泳前、后及休息20min三個時間點血乳酸值

表5.受試物C1對小鼠三個時間點血乳酸曲線下面積及小鼠增重的影響

三個時間點血乳酸曲線下面積=5×(游泳前血乳酸值+3×游泳后0min血乳酸值+2×游泳后休息20min血乳酸值)

P:各實驗組與陰性對照組比較;*:與陰性對照組比較P<0.05;**:與陰性對照組比較P<0.01。

由表5可見,經口給予小鼠不同劑量的受試物30天,各實驗組小鼠增重與陰性對照組比較無顯著性差異(P>0.05),高、中劑量組小鼠游泳后三個時間點血乳酸曲線下面積有所降低,與陰性對照組比較有顯著性差異(P<0.05),說明受試物能夠抑制游泳時血乳酸的產生而對小鼠增重無影響。

實施例1制備的組合物膠囊A1、A2和A3,實施例2制備的組合物膠囊B1、B2和B3,實施例3制備的組合物膠囊C2和C3,牦牛骨髓粉D,葡萄籽提取物E,牛磺酸F對小鼠肝糖原含量及小鼠增重與表4和表5無顯著差異。

2.小結:

經口給予小鼠受試物75、750、2250mg/kg?BW?d,連續灌胃30d,與陰性對照組比較2250mg/kg?BW?d劑量組能延長小鼠負重游泳時間,減少小鼠游泳時血清尿素的產生,減少血乳酸的產生;750mg/kg?BW?d劑量組也能減少小鼠游泳時血清尿素及血乳酸的產生,與陰性對照組比較有顯著性差異(P<0.05),各劑量組對小鼠體重及肝糖原儲備均未見影響。由此判定受試物具有緩解體力疲勞功能。由此判定,本發明實施例1制備的組合物A1、A2和A3,實施例2制備的組合物B1、B2和B3,實施例3制備的組合物C1、C2和C3,均具有增強免疫力功能作用,且明顯好于受試物D、E和F。

以上數據的統計處理采用SPSS11.5統計軟件中單因素方差分析進行均值比較。方差齊時,各組間兩兩比較用LSD法;方差不齊時,各組間兩兩比較采用Tamhane法。

實施例5、本發明的緩解疲勞的組合物的毒理學評價

1急性毒性(經口LD50)試驗

目的:測定LD50,了解受試物的毒性強度、性質和可能的靶器官,為進一步進行毒性試驗的劑量和毒性觀察指標的選擇提供依據,并根據LD50進行毒性分級。

1.1材料和方法

樣品:上述實施例1制備的組合物膠囊,以膠囊內容物為受試物。

1.1.1劑量設置及受試物配制:試驗設21.50、10.00、4.64、2.15g/kg?BW四個劑量組,分別取26.88g、12.50g、5.80g、2.69g受試物溶于蒸餾水至50ml容量瓶混勻定容,采用經口灌胃方式給予受試物,各劑量組每次灌胃量為0.2ml/10g?BW,間隔4小時兩次灌胃,總灌胃量為0.4ml/10g?BW。

1.1.2實驗動物:清潔級ICR小白鼠40只,雌、雄各半,體重:18.0g~22.0g,

由吉林大學白求恩醫學院動物實驗中心提供,生產許可證號:SCXK-(吉)2007-0003,小鼠飼料由長春市億斯實驗動物技術有限責任公司提供,生產許可證號:SCXK-(吉)2010-0001,本清潔級實驗動物環境設施合格證,吉動設字10-1005,實驗動物使用許可證號:SYXK-(吉)2010-0011。

1.1.3試驗條件:飼養溫度20℃~22℃,相對濕度55%~65%。

1.1.4主要儀器:德國產Sartorius-BL610電子天平(d=0.1g);美國產ELECTRONIC?SCALE?T1000電子天平(d=0.1g)。

1.1.5試驗方法:采用霍恩氏法。

1.1.5.1將小鼠禁食16h(當日16點30分至次日8點30分),不限制飲水,按體重要求選用雌、雄小鼠各20只,稱重、染號、隨機分為四個劑量組,每組10只,雌、雄各半。

1.1.5.2灌胃后觀察14天,主要觀察小鼠的中樞神經系統及軀體運動有無改變姿勢、叫聲異常、運動失調等;自主神經有無瞳孔放大或縮小、流涎、流淚等;呼吸系統有無鼻涕、潮式呼吸等;胃腸系統有無氣脹,腹瀉或便秘等。并記錄出現中毒癥狀的時間。如果動物有死亡,記錄死亡數、死亡時間,對死亡動物做大體解剖,并在第14天稱量體重,計算增重。

1.2試驗結果:

表1-1.小鼠急性毒性試驗結果

1.2.1主要癥狀表現:試驗期間各組動物,未見中毒癥狀、死亡數為零。

1.2.2半數致死量,雌、雄性小鼠:LD50>21.5g/kg?BW。

1.3試驗結論:根據急性毒性半數致死劑量分級,該樣品屬無毒級。

2.微核試驗

目的:對受試物的遺傳毒性及是否有潛在致突變性進行篩選。

2.1材料和方法

2.1.1樣品:上述實施例1制備的組合物膠囊,以膠囊內容物為受試物。

2.1.2劑量設置及受試物配制:試驗設10.0、5.0、2.5g/kg?BW三個劑量組,分別取25.0g、12.5g、6.3g受試物溶于蒸餾水至50ml容量瓶混勻定容,另設陰性對照組(蒸餾水)、陽性對照組(環磷酰胺40mg/kg?BW:取200mg環磷酰胺加入生理鹽水至10ml充分混勻,稀釋10倍),采用間隔24h兩次經口灌胃法進行試驗,各組每次灌胃量為0.2ml/10g?BW。

2.1.3實驗動物:清潔級ICR小白鼠50只,雌、雄各半,體重:25.0g~30.0g,由吉林大學白求恩醫學院動物實驗中心提供,生產許可證號:SCXK-(吉)2007-0003,小鼠飼料由長春市億斯實驗動物技術有限責任公司提供,生產許可證號:SCXK-(吉)2010-0001,本清潔級實驗動物環境設施合格證,吉動設字10-1005,實驗動物使用許可證號:SYXK-(吉)2010-0011。

2.1.4試驗條件:飼養溫度20℃~22℃,相對濕度55%~65%。

2.1.5主要儀器:德國產Sartorius-BL610電子天平(d=0.1g);美國產ELECTRONIC?SCALE?T1000電子天平(d=0.1g);日本產Olympus—CH顯微鏡。

2.1.6試驗方法

2.1.6.1按體重要求選用雌、雄小鼠各25只,稱重、染號隨機分為5個劑量組,每組10只,雌、雄各半。

2.1.6.2于第二次灌胃后6h,頸椎脫臼處死小鼠,取股骨以小牛血清稀釋涂片,甲醇固定,Giemsa染色。在光學顯微鏡下,每只動物計數1000個嗜多染紅細胞(PCE),微核發生率以含微核的嗜多染紅細胞(PCE)千分率計,每只動物記數200個嗜多染紅細胞(PCE),計算嗜多染紅細胞(PCE)與成熟紅細胞(NCE)比值,并進行統計分析。

2.2試驗結果

表2-1.小鼠骨髓PCE微核試驗結果

經卡方檢驗,與陰性對照組比較,陽性對照組微核率有高度顯著性差異(P<0.01),各劑量組微核率無顯著性差異(P>0.05);經方差分析,各組動物PCE/NCE值無顯著性差異(P>0.05)。

2.3試驗結論:該樣品骨髓細胞微核試驗結果為陰性,各組動物未見細胞毒性作用。

3.精子畸形實驗

目的:對受試物的遺傳毒性及是否具有潛在致突變性進行篩選。

3.1材料和方法

3.1.1樣品:上述實施例1制備的組合物膠囊,以膠囊內容物為受試物。

3.1.2劑量設置及受試物配制:試驗設10.0、5.0、2.5g/kg?BW三個劑量組,分別取25.0g、12.5g、6.3g受試物溶于蒸餾水至50ml容量瓶混勻定容,另設陰性對照組(蒸餾水)、陽性對照組(環磷酰胺40mg/kg?BW:取200mg環磷酰胺加入生理鹽水至10mL充分混勻,稀釋10倍)。采用經口灌胃方式給予受試物,每日灌胃一次,連續5d。各組每次灌胃量為0.2mL/10g?BW。

3.1.3實驗動物:清潔級ICR小白鼠25只,雄性,體重:25.0g~35.0g,由吉林大學白求恩醫學院動物實驗中心提供,生產許可證號:SCXK-(吉)2007-0003,小鼠飼料由長春市億斯實驗動物技術有限責任公司提供,生產許可證號:SCXK-(吉)2010-0001,本清潔級實驗動物環境設施合格證,吉動設字10-1005,實驗動物使用許可證號:SYXK-(吉)2010-0011。

3.1.4試驗條件:飼養溫度20℃~22℃,相對濕度55%~65%。

3.1.5主要儀器:德國產Sartorius-BL610電子天平(d=0.1g);美國產ELECTRONIC?SCALE?T1000電子天平(d=0.1g);日本產Olympus-CH顯微鏡。

3.1.6試驗方法

3.1.6.1按體重要求選用雄性小鼠25只,稱重、染號隨機分為5個劑量組,每組5只。

3.1.6.2末次灌胃后第30d處死小鼠,取附睪制片,伊紅染色,每組計數5只動物,每只動物計數1000個結構完整的精子,計算畸變精子發生率,并進行統計分析。

3.2試驗結果

表3-1.小鼠精子畸形試驗結果

經Wilconson秩和檢驗,與陰性對照組比較,各劑量組精子畸形率與陰性對照組比較無顯著性差異(P>0.05),陽性對照組精子畸形率有高度顯著性差異(P<0.01)。

3.3試驗結論:該樣品精子畸形試驗結果為陰性。

4.Ames試驗

目的:檢測保健食品的誘變性,從而評價其致突變作用的可能性。

4.1樣品:上述實施例1制備的組合物膠囊,以膠囊內容物為受試物。

4.2溶劑:蒸餾水

4.3劑量設置及受試物配制:試驗設5000、1000、200、40、8μg/皿5個受試物劑量,取2.5g受試物加蒸餾水至50ml混勻即為5000μg/皿劑量,其余各受試物劑量1/5倍比遞減稀釋;上述受試液經滅菌(時間20min,溫度:121℃,壓力:0.103Mpa)后使用;另設未處理對照、溶劑對照、陽性對照。

4.4主要儀器設備:

YXQ-LS-50G型立式壓力蒸汽滅菌儀,上海博迅實業有限公司醫療設備廠產。

FSH-Ⅱ型勻漿器,江蘇金坊金城國勝實驗器械廠產。

DH-500A型電熱恒溫培養箱,上海基瑋試驗儀器設備有限公司產。

DK-600型電熱恒溫水浴箱,上海基瑋試驗儀器設備有限公司產。

METTLER?TOLEDO-AB204-N分析天平,上海產。

4.5測試菌株:采用四株鼠傷寒沙門氏菌突變型菌株TA97、TA98、TA100、TA102。為本實驗室鑒定、凍存,生物學性狀符合菌株要求。測試菌液濃度每毫升不少于1×109活菌數。

4.6S9活性鑒定:采用多氯聯苯(PCB)誘導的大鼠肝勻漿作為體外代謝活化系統。S9制成后,經無菌檢查,測定蛋白含量(Lowry法),每毫升蛋白含量不超過40mg為宜,并經間接致癌物(1,8-二羥基蒽醌50.0μg/皿及二氨基芴10.0μg/皿)鑒定其生物活性合格后儲存于深低溫或冰凍干燥,保存期不超過一年。

4.7陽性對照:非活化系統TA97、TA98、TA102為敵克松50.0μg/皿,TA100為疊氮鈉1.5μg/皿。活化系統TA97、TA98、TA100采用二氨基芴10.0μg/皿,TA102為1,8-二羥基蒽醌50.0μg/皿。

4.8測試方法:在頂層瓊脂中加入0.1ml試驗菌株增菌液、0.1ml受試物溶液,代謝活化時加入0.5ml?S9混合液,混勻后導入底層培養基平板上。在37℃培養48h,計數每皿回變菌落數。如果受試物的回變菌落數是自發回變菌落數2倍以上,并具有劑量-反應關系者則定為陽性。每個劑量做三個平行。整套試驗在相同條件下重復做兩次并分別統計。

4.9第一次試驗測試結果:

表4-1.第一次Ames試驗結果

4.10第二次試驗測試結果:

表4-2.第二次Ames試驗結果

4.11結論:本實驗條件下,上述實施例1制備的組合物膠囊Ames試驗結果為陰性。

5.30天喂養試驗

目的:在急性毒性試驗的基礎上,通過30天喂養試驗,進一步了解其毒性作用,觀察對生長發育的影響,并可初步估計最大未觀察到有害作用劑量。

樣品:上述實施例1制備的組合物膠囊,以膠囊內容物為受試物。

實驗動物

5.2.1來源:由吉林大學白求恩醫學院動物實驗中心提供的清潔級動物。

5.2.2品系:清潔級Wistar大白鼠,雌雄各40只,批準證號:SCXK-(吉)2007-0003。

5.2.3試驗始重:70.2g~78.0g

5.2.4飼養條件:本清潔級實驗動物環境設施合格證號,吉動設字10-1005,實驗動物使用許可證號:SYXK-(吉)2010-0011;溫度20℃~22℃,濕度55%~65%;基礎飼料由長春市億斯實驗動物技術有限責任公司提供,生產許可證號:SCXK-(吉)2010-0001。

5.3試驗方法:

動物購入后飼養3天,隨機分為對照組及三個受試物組,每組雌雄各10只。人體推薦服用量為4.50g/60kg?BW(體重按60kg計算),則成人每日攝入樣品量為相當于0.075g/kg?BW。最高劑量組以成人日攝入量的100倍計,即7.500g/kg?BW,中劑量組5.625g/kg?BW相當于成人攝入量的75倍,低劑量組3.750g/kg?BW,相當于成人攝入量的50倍。大鼠飼料攝入量按體重10%計算,高、中、低三個試驗組受試物含量依次為7.500%、5.625%、3.750%。由于高、中劑量組受試物在飼料中的比例大于5%,應在飼料中補充酪蛋白后進行30天喂養試驗,因基礎飼料中蛋白質含量22.4%,故高劑量組飼料增加0.56%含量的酪蛋白,中劑量組飼料增加0.14%含量的酪蛋白。將高、中、低三個試驗組受試物均勻摻入已補充酪蛋白的基礎飼料中(采用逐漸擴大、充分混勻、反復過篩的方法),對照組喂飼基礎飼料。大鼠單籠喂養,自由飲食,記錄大鼠進食量、體重,連續觀察30天。

5.4觀察指標:

5.4.1一般情況觀察:動物的一般表現、行為、中毒癥狀及死亡情況,每周稱一次體重、兩次攝入量,計算食物周利用率及總利用率。

5.4.2血液學指標及血液生化指標:于試驗第31天用1%戊巴比妥鈉生理鹽水溶液,按5ml/kgBW腹腔注射麻醉后,下腔靜脈采血(采血前16小時禁食),用日本產SYSMEX-XT1800i進行血液學指標檢測,采用東芝公司生產的TBA120型全自動生化分析儀測定血液生化指標:谷丙轉氨酶(Alt)、谷草轉氨酶(Ast)、尿素(Bun)、肌酐(Cr)、血糖(Glu)、總蛋白(Tp)、白蛋白(Alb)、膽固醇(Tc)、甘油三酯(Tg)。

5.4.3病理檢查:大體解剖、臟器絕對重量和相對重量(臟/體比值)、組織病理檢查(肝、腎、脾、胃、十二指腸、睪丸或卵巢)

5.4.4數據統計:試驗數據均采用SPSS11.5進行方差分析;方差齊時,各組間兩兩比較用LSD法;方差不齊時,各組間兩兩比較用Tamhane法。

5.5試驗結果:

5.5.1受試物對大鼠體重的影響:

表5-1受試物對大鼠體重的影響

由表5-1可見,各組動物生長活動正常。各劑量組動物體重與對照組比較,差異無顯著性(P>0.05)。

5.5.2受試物對大鼠食物利用率的影響:

表5-2受試物對大鼠各周進食量及食物利用率的影響

由表5-2可見給予受試物后,動物未出現拒食現象,各劑量組動物周食物利用率與對照組比較差異無顯著性(P>0.05)。

表5-3受試物對大鼠總食物利用率的影響

由表5-3可見各劑量組大鼠增重、進食量與對照組比較差異無顯著性(P>0.05)。

5.5.3血液學指標檢查結果:

表5-4受試物對大鼠血液的影響

由表5-4可見,各劑量組的血紅蛋白(HGB)、紅細胞(RBC)、白細胞(WBC)與對照組比較差異無顯著性(P>0.05)。

表5-5受試物對大鼠白細胞分類的影響

由表5-5可見,各劑量組的白細胞分類與對照組比較差異無顯著性(P>0.05)。

5.5.430天喂養試驗血液生化指標檢驗結果:

表5-6受試物對大鼠生化的影響

由表5-6可見,各劑量組的血糖(Glu)、尿素(Urea)、總蛋白(Tp)、白蛋白(Alb)、膽固醇(Tc)、谷丙轉氨酶(Alt)、肌酐(Cr)、甘油三酯(Tg)、谷草轉氨酶(Ast)與對照組比較差異無顯著性(P>0.05),且無劑量反應關系。

5.5.5受試物對大鼠臟器重量及臟體比的影響:

表5-7受試物對大鼠臟體比的影響

由表5-7可見,各劑量組與對照組比較差異無顯著性(P>0.05)。

5.5.6病理組織學檢查:

三個劑量組(分別為人體攝入量的100、75、50倍)與對照組雌性動物與雄性動物在實驗期內毛發光澤、粘膜紅潤,活動自如,排泄物無異常,各組間動物體重無明顯差異。大體剖檢觀察各組實驗動物臟器未見異常改變。高劑量組與對照組試驗雌、雄各20只動物的肝、脾、腎、胃、十二指腸、性腺(睪丸或卵巢)經病理學檢查均未見與受試物相關的病理改變,故對中、低劑量組動物未作組織病理學檢查。結果如下:

表5-8受試物30天喂養試驗肝臟病理學檢查結果

表5-9受試物30天喂養試驗脾臟病理學檢查結果

表5-10受試物30天喂養試驗腎臟病理學檢查結果

表5-11受試物30天喂養試驗胃及十二指腸病理學檢查結果

表5-12受試物30天喂養試驗睪丸病理學檢查結果

表5-13受試物30天喂養試驗卵巢病理學檢查結果

肝臟:呈暗紅色,質軟,表面光滑、平整,未見隆起及包塊。鏡下所見:對照組雌性2例,雄性3例,高劑量雌性1例,雄性2例可見肝匯管區炎細胞浸潤;其余被膜完整,未見增厚,肝小葉結構清晰,肝細胞索、肝竇排列整齊規則。肝細胞胞漿紅染,核居中,未見脂肪變性、出血和壞死改變。匯管區三管結構清楚可見,無明顯異常病理改變。其余肝組織結構高劑量組與對照組無明顯差異。

脾:鏡下所見:可清楚看到脾臟實質的紅髓、白髓及邊緣區三部分,被膜及脾小梁未見纖維結締組織增生,淋巴濾泡未見反應性增生,余無特別,為正常脾臟結構。高劑量脾臟結構與對照組相似。

腎臟:雙側腎臟等大似豆形,表面光滑平整,未見明顯增大與縮小。鏡下觀察:腎被膜光滑,腎小球在切片上呈圓形,腎皮質區腎小球未見明顯增大或萎縮、纖維化、變性等,毛細血管袢未見壞死,腎小球毛細血管未見擴張充血、管壁未見增厚。小管上皮完好,間質無炎細胞浸潤,為正常腎臟組織結構。其余動物腎臟一般結構均未發現異常改變。

胃:鏡下主要觀察胃粘膜。對照組雌性2例,雄性2例,高劑量組雌性2例,雄性1例可見胃固有層內少量嗜酸粒細胞浸潤,余為正常胃粘膜結構。胃壁可見四層結構,其中粘膜層最厚,上皮完好,胃體腺壁細胞、主細胞、頸粘液細胞、未分化細胞均清晰可見。壁細胞呈圓形或三角形,多為單核,胞漿嗜酸性。主細胞呈柱狀,胞漿嗜堿性。胃體粘膜各層未見炎細胞浸潤。胃底部主細胞、壁細胞清楚,其余胃粘膜結構高劑量與對照組無明顯差異。

十二指腸:鏡下主要觀察粘膜,粘膜表面可見大小不一的腸粘膜,呈葉片狀,粘膜上皮呈高柱狀,可見十二指腸腸腺,各層結構的細胞未見異常,為正常十二指腸組織結構,高劑量的十二指腸粘膜結構與對照組無明顯差異。

睪丸:鏡下觀察:曲細精管結構清晰,各級生精細胞形態正常,精子細胞清晰可見,支持細胞未見異常。睪丸間質未見出血、壞死、鈣化或精子肉芽腫形成。曲細精管內可見精原細胞、初級精母細胞、次級精母細胞、精子細胞和精子,為正常睪丸組織結構。高劑量的睪丸結構與對照組相似,未見異常。

卵巢:鏡下觀察:卵巢表面為扁平或立方細胞,皮質層內可見許多發育不同階段的卵泡,卵泡間為結締組織,髓質區由結締組織組成,含較多血管,高劑量與對照組的卵巢形態相似。5.7結論:

該樣品30天喂養試驗,一般情況觀察未見異常;大鼠增重、進食量、食物利用率、血液學指標、血液生化指標均未見不良影響;大體解剖、臟器絕對重量和相對重量(臟/體比值)、組織病理學觀察肝、脾、腎、胃、十二指腸、睪丸、卵巢均未見有意義的病理改變。

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