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一種抑制魚鱗片形成的方法.pdf

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一種 抑制 魚鱗 形成 方法
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摘要
申請專利號:

CN201310329623.9

申請日:

20130731

公開號:

CN103380753A

公開日:

20131106

當前法律狀態:

有效性:

失效

法律詳情:
IPC分類號: A01K61/00 主分類號: A01K61/00
申請人: 上海海洋大學
發明人: 鮑寶龍,姚文杰,呂耀平,張莉君
地址: 201306 上海市浦東新區臨港新城滬城環路999號
優先權: CN201310329623A
專利代理機構: 上海三和萬國知識產權代理事務所(普通合伙) 代理人: 侯佳猷
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法律狀態
申請(專利)號:

CN201310329623.9

授權公告號:

法律狀態公告日:

法律狀態類型:

摘要

本發明公開了一種抑制魚鱗片形成的方法,包括L-苯丙氨酸浸泡魚的方法、鱗片形成的活體檢測方法、鱗片形成的硬骨染色檢測方法。在本發明中,通過采用L-苯丙氨酸抑制堿性磷酸酶AKP的活力,從而進一步影響魚鱗片的鈣化形成。本發明采用的L-苯丙氨酸對魚體無毒害,因而能夠為生命科學研究服務,制備無鱗片的魚。

權利要求書

1.一種抑制魚鱗片形成的方法,包括以下步驟:(1)準備用于浸泡幼魚的藥物:選取L-苯丙氨酸作為浸泡藥物,溶于水配置成5mmol-100mmol濃度備用,(2)藥物浸泡:將幼魚浸泡養殖于前述步驟配置的含有L-苯丙氨酸的水溶液中一段時間,(3)測量檢測魚鱗片形成情況。2.根據權利要求1所述的方法,其特征在于,步驟(1)中,所述L-苯丙氨酸的濃度為10mmol。3.根據權利要求1所述的方法,其特征在于,所述幼魚浸泡養殖時間為從幼魚孵化后20天到孵化后60天。4.根據權利要求1所述的方法,其特征在于,所述幼魚為斑馬魚、青鳉鯉魚、鰱魚、青魚或草魚。5.根據權利要求1所述的方法,其特征在于,所述幼魚為孵化5-20天的鱗片尚未形成的幼魚。6.根據權利要求1所述的方法,其特征在于,所述步驟(3)檢測魚鱗片形成方法包括測量幼魚體長、活體檢測魚鱗片形成或硬骨染色檢測。7.根據權利要求6所述的方法,其特征在于,所述測量幼魚體長方法為:將魚置于培養皿中,在顯微鏡下測量體長。8.根據權利要求6所述的方法,其特征在于,所述活體檢測魚鱗片形成方法為鈣黃素活體染色方法,具體包括如下步驟:(1)將魚依照體型大小放入適當大小的容器中,將容器中的水分吸干,然后加入0.2%的鈣黃素,加入的鈣黃素染色液需淹沒魚身,避光條件下染色10分鐘;(2)將染完的鈣黃素染色液吸出;再加水至容器中,將鈣黃素染色液洗凈(3)重復步驟(2)2-3次,直至看不到容器中鈣黃素染色液的熒光黃綠色為止;(4)洗凈后即可將魚放置在熒光顯微鏡下以活體做觀察;且染色后的魚可以保有熒光1-2天。9.根據權利要求6所述的方法,其特征在于,所述硬骨染色檢測魚鱗片形成方法為茜素紅染色方法,具體包括如下步驟:(1)將魚在4%福爾馬林中固定;(2)用ddH2O漂洗4%福爾馬林固定的標本30min,重復3次;(3)將魚浸泡在1%KOH中,滴加1%的H2O2,強光下照射除去大部分色素;(4)用胰蛋白酶消化液消化直至頭部肌肉組織透明;用1%KOH漂洗幾次后浸泡在該溶液中;(5)滴加幾滴茜素紅溶液進行染色直至魚變成深紅色,;(6)將染色的魚依次浸泡1%KOH︰甘油體積比為:3︰1、1︰1、1︰3的混合溶液中,最后保存在含有少許麝香草酚或不含麝香草酚的甘油。

說明書

技術領域

本發明涉及一種抑制魚鱗片形成的方法,具體涉及用L-苯丙氨酸浸泡幼魚抑制魚鱗片形成的方法。

背景技術

大多數硬骨魚類的體表均覆蓋有鱗片(例如盾鱗、骨鱗),同鰭條和牙齒一樣,都屬于皮膚骨骼組織。作為模式動物的斑馬魚和青鳉體表同樣覆蓋鱗片,其鱗片從尾部向前依次形成。鱗片的形成與體長十分相關,其在8.1mm時首片鱗片鈣化完成,在9.2mm時,鱗片全部鈣化。斑馬魚、青鳉等作為生命科學研究領域的模式動物,其體表鱗片的存在不利于對神經、骨骼等各種內部器官發育的活體觀察和研究;沒有鱗片的斑馬魚和青鳉魚,有利于開展此相關領域的研究。

L-苯丙氨酸是一種必需氨基酸,是一種重要的食品添加劑——甜味劑阿斯巴甜的主要原料,在醫藥行業主要用于氨基酸輸液和氨基酸類藥物。同時其可影響甲狀腺激素和毛發、皮膚的黑色素。

發明內容

本發明的所需要解決的技術問題在于提供一種抑制魚鱗片形成的方法,在不改變其他發育事件的前提下抑制魚鱗片的形成,為研究魚體內部器官生長發育提供大量的實驗材料。

為了解決上述的技術問題,本發明提供的抑制魚鱗片形成的方法,包括以下步驟:

(1)浸泡藥物的準備:選取L-苯丙氨酸作為浸泡藥物,溶于水溶液配置成5mmol-100mmol濃度備用,

(2)藥物浸泡:將幼魚浸泡養殖于前述步驟配置的含有L-苯丙氨酸的水溶液中一段時間,

(3)測量檢測魚鱗片形成情況。

優選的,步驟(1)中,所述L-苯丙氨酸的濃度為10mmol。

優選的,所述幼魚浸泡養殖時間為從幼魚孵化后20天到孵化后60天。

優選的,所述幼魚為斑馬魚、青鳉、鰱魚、青魚或草魚。

優選的,所述幼魚為孵化5-20天的鱗片尚未形成的幼魚。

優選的,所述步驟(3)檢測魚鱗片形成方法包括測量幼魚體長、活體檢測魚鱗片形成或硬骨染色檢測。

優選的,所述測量幼魚體長方法為:將魚置于培養皿中,在顯微鏡下測量體長。

優選的,所述活體檢測魚鱗片形成方法為鈣黃素活體染色方法,具體包括如下步驟:

(1)將魚依照體型大小放入適當大小的容器中,將容器中的水分吸干,然后加入0.2%的鈣黃素,加入的鈣黃素染色液需淹沒魚身,避光條件下染色10分鐘;

(2)將染完的鈣黃素染色液吸出,可以回收再利用;然后加水至容器中,將鈣黃素染色液洗凈

(3)重復步驟(2)2-3次,直至看不到容器中鈣黃素染色液的熒光黃綠色為止;

(4)洗凈后即可將魚放置在熒光顯微鏡下以活體做觀察;且染色后的魚可以保有熒光1-2天。

優選的,所述硬骨染色檢測魚鱗片形成方法為茜素紅染色方法,具體包括如下步驟:

(1)將魚在4%福爾馬林中固定;

(2)用ddH2O漂洗4%福爾馬林固定的標本30min,重復3次;

(3)將魚浸泡在1%KOH中,滴加1%的H2O2,強光下照射除去大部分色素;

(4)用胰蛋白酶消化液消化直至頭部肌肉組織透明;用1%KOH漂洗幾次后浸泡在該溶液中;

(5)滴加幾滴茜素紅溶液進行染色直至魚變成深紅色,;

(6)將染色的魚依次浸泡1%KOH︰甘油體積比為:3︰1、1︰1、1︰3的混合溶液中,最后保存在含有少許麝香草酚或不含麝香草酚的甘油。

本發明的有益效果:(1)本發明通過藥物L-苯丙氨酸人為地抑制魚鱗片的形成,采用L-苯丙氨酸抑制堿性磷酸酶AKP的活力,從而進一步影響鱗片的鈣化形成;(2)本發明采用的L-苯丙氨酸對魚體無毒害,可用作培育無鱗片的斑馬魚等,或者還可以用作于其他經濟魚類,通過調整濃度,為生命科學研究服務,制備無鱗片的魚。

附圖說明

以下結合附圖和具體實施方式來進一步說明本發明。

圖1為斑馬魚鈣黃素染色情況;圖A為對照組有鱗片斑馬魚鈣黃素染色情況:有鱗片斑馬魚經鈣黃素染色,鱗片染色熒光遮蓋了內部中軸骨骼以及肌間刺的熒光;圖B為無鱗片斑馬魚的鈣黃素染色情況;無鱗片斑馬魚經鈣黃素染色能夠清晰的看到內部的中軸骨骼以及肌間刺。

圖2為斑馬魚茜素紅染色情況;圖C為對照組有鱗片斑馬魚茜素紅染色情況,有鱗片斑馬魚經茜素紅染色,體表呈暗紫色;圖D為浸泡組無鱗片斑馬魚茜素紅染色情況,無鱗片斑馬魚經茜素紅染色,體表呈透明色。

圖3為斑馬魚茜素紅染色方法情況;圖E為對照組有鱗片斑馬魚茜素紅染色情況放大圖,箭頭所示1為鱗片;圖F為浸泡組無鱗片斑馬魚茜素紅染色情況放大圖。

上述標尺均為500μm。

具體實施方式

為了使本發明的技術手段、創作特征、達成目的與功效易于明白了解,下面結合具體圖示,進一步闡述本發明。

本文中,L-苯丙氨酸購于國藥集團化學試劑有限公司。實施例1-6中所述L-苯丙氨酸浸泡濃度為5mmol-100mmol。實施例1-6中所述浸泡魚類為斑馬魚、青鳉,還可以是其它經濟魚類物種。胰蛋白酶消化液為100ml體系:65mlddH2O,35ml飽和硼酸鈉鹽(Na2B4O7.10H2O)上清液,1g胰蛋白酶。茜素紅溶液為1g茜素紅溶于100ml0.5%KOH。

實施例1

用10mmol?L-苯丙氨酸浸泡抑制斑馬魚鱗片形成的方法,可按照以下步驟操作:

(1)L-苯丙氨酸的配置:養魚淡水曝氣過夜,然后用養魚水將L-苯丙氨酸配置成10mmol濃度;

(2)斑馬魚飼養于500L燒杯中,20-30尾/杯;一天換水2次,早9:00,下午16:00,每次換水1/2,主要清除殘餌、糞便;

(3)早上和下午換水時投喂草履蟲或者鹵蟲無節幼體;

(4)每天清洗一次燒杯;

(5)斑馬魚從孵化后20天開始浸泡,一直浸泡至孵化后60天;

(6)使用鈣黃素活體染色和茜素紅染色方法檢測斑馬魚鱗片形成情況。

實施例2

用50mmol?L-苯丙氨酸的水溶液浸泡抑制斑馬魚鱗片形成的方法,可按照以下步驟操作:

(1)L-苯丙氨酸的配置:養魚淡水曝氣過夜,然后用養魚水將L-苯丙氨酸配置成50mmol濃度;

(2)斑馬魚飼養于500L燒杯中,20-30尾/杯,一天換水2次,早9:00,下午16:00,每次換水1/2,主要清除殘餌、糞便;

(3)早上和下午換水時投喂草履蟲或者鹵蟲無節幼體;

(4)每天清洗一次燒杯;

(5)斑馬魚從孵化后20天開始浸泡,一直浸泡至孵化后60天;

(6)使用鈣黃素活體染色和茜素紅染色方法檢測斑馬魚鱗片形成情況。

實施例3

用100mmol?L-苯丙氨酸的水溶液浸泡抑制斑馬魚鱗片形成的方法,可按照以下步驟操作:

(1)L-苯丙氨酸的配置:養魚淡水曝氣過夜,然后用養魚水將L-苯丙氨酸配置成100mmol濃度;

(2)斑馬魚飼養于500L燒杯中,20-30尾/杯,一天換水2次,早9:00,下午16:00,每次換水1/2,主要清除殘餌、糞便;

(3)早上和下午換水時投喂草履蟲或者鹵蟲無節幼體;

(4)每天清洗一次燒杯;

(5)斑馬魚從孵化后20天開始浸泡,一直浸泡至孵化后60天;

(6)使用鈣黃素活體染色和茜素紅染色方法檢測斑馬魚鱗片形成情況。

實施例4

用10mmol?L-苯丙氨酸的水溶液浸泡抑制青鳉鱗片形成的方法,可按照以下步驟操作:

(1)L-苯丙氨酸的配置:養魚淡水曝氣過夜,然后用養魚水將L-苯丙氨酸配置成10mmol濃度;

(2)青鳉飼養于500L燒杯中,20-30尾/杯,一天換水2次,早9:00,下午16:00,每次換水1/2,主要清除殘餌、糞便;

(3)早上和下午換水時投喂草履蟲或者鹵蟲無節幼體;

(4)每天清洗一次燒杯;

(5)青鳉從孵化后20天開始浸泡,一直浸泡至孵化后60天;

(6)使用鈣黃素活體染色和茜素紅染色方法檢測青鳉鱗片形成情況。

實施例5

用50mmol?L-苯丙氨酸的水溶液浸泡抑制青鳉鱗片形成的方法,可按照以下步驟操作:

(1)L-苯丙氨酸的配置:養魚淡水曝氣過夜,然后用養魚水將L-苯丙氨酸配置成50mmol濃度。

(2)青鳉飼養于500L燒杯中,20-30尾/杯;一天換水2次,早9:00,下午16:00,每次換水1/2,主要清除殘餌、糞便;

(3)早上和下午換水時投喂草履蟲或者鹵蟲無節幼體;

(4)每天清洗一次燒杯;

(5)青鳉從孵化后20天開始浸泡,一直浸泡至孵化后60天;

(6)使用鈣黃素活體染色和茜素紅染色方法檢測青鱂鱗片形成情況。

實施例6

用100mmol?L-苯丙氨酸的水溶液浸泡抑制青鳉鱗片形成的方法,可按照以下步驟操作:

(1)L-苯丙氨酸的配置:養魚淡水曝氣過夜,然后用養魚水將L-苯丙氨酸配置成100mmol濃度;

(2)青鳉飼養于500L燒杯中,20-30尾/杯,一天換水2次,早9:00,下午16:00,每次換水1/2,主要清除殘餌、糞便;

(3)早上和下午換水時投喂草履蟲或者鹵蟲無節幼體;

(4)每天清洗一次燒杯;

(5)青鳉從孵化后20天開始浸泡,一直浸泡至孵化后60天;

(6)使用鈣黃素活體染色和茜素紅染色方法檢測青鳉鱗片形成情況。

上述實施案例1中的斑馬魚進行體長數據的測量,檢驗其不是通過控制生長來抑制鱗片的生成,體長數據如表1所示。

表1.斑馬魚對照組和浸泡組體長

以上顯示和描述了本發明的基本原理、主要特征和本發明的優點。本行業的技術人員應該了解,本發明不受上述實施例的限制,上述實施例和說明書中描述的只是說明本發明的原理,在不脫離本發明精神和范圍的前提下本發明還會有各種變化和改進,這些變化和改進都落入要求保護的本發明范圍內。本發明要求保護范圍由所附的權利要求書及其等同物界定。

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