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用于角膜感覺神經損傷的包含腦信號蛋白抑制劑作為活性成分的治療劑.pdf

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用于 角膜 感覺神經 損傷 包含 信號 蛋白 抑制劑 作為 活性 成分 治療
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摘要
申請專利號:

CN201280009762.7

申請日:

20120223

公開號:

CN103379906B

公開日:

20160120

當前法律狀態:

有效性:

有效

法律詳情:
IPC分類號: A61K31/352,A61P27/02,A61P27/04,A61P43/00,C07D311/86 主分類號: A61K31/352,A61P27/02,A61P27/04,A61P43/00,C07D311/86
申請人: 學校法人慶應義塾,大日本住友制藥株式會社
發明人: 岡野榮之,坪田一男,榛村重人,大本雅弘,岸野晶祥,前田美穗
地址: 日本東京都
優先權: 040128/2011
專利代理機構: 北京市中咨律師事務所 代理人: 張建;黃革生
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法律狀態
申請(專利)號:

CN201280009762.7

授權公告號:

法律狀態公告日:

法律狀態類型:

摘要

式(1)表示的化合物或其藥學可接受的鹽有效地作為角膜病或歸因于角膜手術的感覺神經損傷的治療劑或預防劑并且作為角膜感覺神經的再生促進劑:其中R1表示氫原子或羧基,R2表示氫原子或羥基,R3表示氫原子或羧基,且R4表示氫原子或羥基。

權利要求書

1.包含由下式(1)表示的化合物或其藥學可接受的鹽的眼用液體制劑用于制備因角膜病或角膜手術損傷的角膜感覺神經導致的感覺神經病的治療劑或預防劑的用途:[式1]其中R和R各自表示羧基;R和R各自表示羥基,其中式(1)表示的化合物或其藥學可接受的鹽被眼局部施用入眼內,其中所述的角膜病選自角膜炎、大泡性角膜病變、角膜潰瘍、神經麻痹性角膜病變、糖尿病性角膜病變。2.根據權利要求1的用途,其中所述的感覺神經病由角膜手術損傷的角膜感覺神經造成且角膜手術是角膜移植術。3.根據權利要求1的用途,其中所述的感覺神經病由角膜手術損傷的角膜感覺神經造成且角膜手術是近視矯正術。4.根據權利要求1的用途,其中所述的感覺神經病由角膜手術損傷的角膜感覺神經造成且角膜手術靶向要求治療眼病或角膜損傷的角膜。5.根據權利要求1的用途,其中感覺神經病是知覺缺失。6.根據權利要求1的用途,其中感覺神經病是眼感干澀。7.包含由式(1)表示的化合物或其藥學可接受的鹽的眼用液體制劑用于制備在患有因角膜病或角膜手術的患者中的感覺神經病的角膜感覺神經的再生促進劑的用途,[式1]其中R和R各自表示羧基;且R和R各自表示羥基,其中所述的角膜病選自角膜炎、大泡性角膜病變、角膜潰瘍、神經麻痹性角膜病變、糖尿病性角膜病變。8.根據權利要求7的用途,其中感覺神經病是知覺缺失。9.根據權利要求7的用途,其中感覺神經病是眼感干澀。

說明書

技術領域

本發明涉及因角膜病或角膜手術導致的感覺神經病或與之相關的眼感干澀的治療劑,其中該治療劑包含具有腦信號蛋白抑制活性的呫噸酮化合物作為活性劑。

背景技術

角膜是覆蓋眼前部的透明膜且具有將光引入眼并然后與晶狀體一起折射光以聚焦所述眼的功能。此外,由于角膜表面始終被淚液覆蓋,所以角膜也具有預防眼感干澀或眼中細菌感染的功能。這種角膜可以因損傷或疾病變弱或變性,結果是上述舉出的功能可能缺失。為了治療這種癥狀,首先使用藥物。此外,就其中這種藥物無法帶來足夠的治療作用的情況而言,將正常角膜移植入變弱或變性的角膜。

屬于來源于三叉神經的角膜感覺神經分布于角膜表層上。三叉神經是顱神經之一且也稱作第五顱神經。三叉神經分支成三種神經,即眼神經、上頜神經和下頜神經。在眼神經中,在角膜中傳輸的神經是角膜感覺神經。角膜感覺神經不僅通過對保護角膜的角膜敏感度起產生角膜波的作用(眨眼反射),而且起產生淚液和促進神經營養因子分泌的作用以維持角膜內環境穩定。

在角膜病中,不僅發生角膜自身變性,而且也發生角膜感覺神經損傷,且由此正常的神經功能受損并且發生感覺紊亂。此外,在角膜手術包括作為典型實例的用于治療疾病的角膜移植術或近視矯正術例如LASIK中,因為角膜感覺神經被切斷,所以在手術完成后感覺紊亂必然發生較長時間期限。這種感覺紊亂即角膜感覺神經病具體意味著角膜表面上的感官知覺例如觸覺或痛覺下降并且導致缺乏角膜波、因淚液中的異常導致的眼感干澀(角膜干燥)、眼球上的損傷等。

稱作角膜感覺神經病或眼感干澀的原因的角膜病的實例包括角膜炎、角膜白斑(因角膜皰疹、麻疹、梅毒或損傷導致)、角膜感染、角膜變性、角膜營養不良、角膜基質營養不良、大泡性角膜病變、圓錐角膜、角膜代償失調、角膜潰瘍、神經麻痹性角膜病變、糖尿病性角膜病變、角膜化學燒傷(因進入眼的化學品等導致)和角膜熱燒傷。當該病嚴重時,可以施用角膜移植術治療它。

稱作角膜感覺神經病或眼感干澀的原因的角膜手術的實例包括角膜移植術、近視矯正術和用于治療白內障的插入人工晶狀體(人造晶狀體)的補植手術等。

角膜移植術也稱作角膜移植或角膜成形術。角膜移植術的實際應用不限于上述舉出的例子。角膜移植術應用的目的包括1)視力目的;2)治療目的;3)手術目的;和4)美容目的。

上述1)中的視力目的是指角膜混濁透明度的恢復和視覺恢復。這些癥狀的原因性疾病的實例包括角膜炎、角膜白斑(因角膜皰疹、麻疹、梅毒或損傷導致)、角膜感染、角膜變性、角膜營養不良、角膜基質營養不良、大泡性角膜病變、圓錐角膜和角膜代償失調。上述2)中的治療目的是指通過燒蝕作為感染病灶的角膜緩解感染。這種癥狀的原因性疾病的實例是角膜潰瘍(主要是活動期中的感染)。上述3)中的手術目的是指就角膜穿孔而言眼球形狀的保持。這些癥狀的原因性疾病的實例包括角膜潰瘍(細菌、真菌、病毒或無菌性潰瘍)和損傷。上述4)中的美容目的是指與角膜混濁相關的角膜白斑的美容改善。

角膜移植術的具體實例包括1)穿透角膜移植術;2)板層角膜移植術;3)深部板層角膜移植術;4)鞏膜角膜移植術;5)鞏膜移植物移植;6)角膜緣移植;和7)羊膜移植。

上述1)中的穿透角膜移植術是從角膜外層至內皮角膜范圍內的全層交換手術。這種移植用于治療涉及達到角膜實質深層的混濁的疾病,例如需要內皮移植或潰瘍穿孔的大泡性角膜病。上述2)中的板層角膜移植術是僅切除角膜外層和角膜實質中的損害且然后向其中移植與切除部分相同大小的角膜片的手術。這種移植用于其中僅角膜實質表層變混濁這樣的病例、其中角膜外周部分變薄這樣的病例和其中角膜局部變薄這樣的病例。上述3)中的深部板層角膜移植術是這樣的手術,作為整體切除角膜外層和角膜實質同時僅保留Demes膜和內皮角膜,然后僅移植角膜外層并且將角膜實質調整至具有與切除部分相同的大小。這種移植用于其中內皮細胞是健康的這樣的病例。上述4)中的鞏膜角膜移植術是切除角膜和鞏膜且然后將鞏膜角膜片移植入切除部分的手術。這種移植用于例如其中角膜潰瘍在寬范圍內擴散這樣的病例。上述5)中的鞏膜移植物移植是矯正變薄的鞏膜這樣的手術。這種移植用于其中角膜是健康的且鞏膜需要強化這樣的病例。上述6)中的角膜緣移植是移植角膜緣干細胞以提供正常的角膜外層的手術。上述7)中的羊膜移植是將異常結膜切除且然后將羊膜移植入切除部分的手術。這種手術的結果是調整了環境,從而再次用正常的結膜覆蓋了眼球。

在日本以高頻率需要角膜移植術的原因性疾病的實例包括:第一,圓錐角膜;第二,角膜白斑;第三,大泡性角膜病變;第四,角膜變性;和第五,角膜化學燒傷或角膜熱燒傷。圓錐角膜是青春期時發生的角膜營養不良。在這種疾病中,角膜的中心部分逐步變薄并且向前突出。因為角膜的形狀變形,所以角膜作為晶狀體的功能受損。在圓錐角膜是嚴重的且視力不足以被接觸鏡矯正或難以長期使用接觸鏡的病例中,可以進行角膜移植術。角膜白斑通常在老年人中發生且它指示了作為在生命早期受角膜炎侵害的結果角膜上保留瘢痕。皰疹性角膜炎后發生的混濁也包括在角膜白斑中。大泡性角膜病變顯示這樣的情況,其中用于調節角膜在其后部中含水量的肉皮細胞減少且作為結果是水蓄積且角膜腫脹。在預先進行角膜移植術的患者中內皮細胞減少和患者需要再次進行角膜移植術稱作再植的情況也包括在大泡性角膜病變中。角膜變性顯示其中角膜中沉淀異常物質且變混濁的情況。角膜化學燒傷和角膜熱燒傷顯示其中化學物質或粘結物質進入眼的情況且作為結果是生成強烈瘢痕。

據報道,例如,在日本每年進行這種角膜移植術的有1,000-2,000個病例。還報道,需要角膜移植術的患者數量每年約為20,000人。

除角膜移植術外,近視矯正術是這樣一種手術,其中角膜感覺神經病可以作為角膜感覺神經切斷的結果發生。術語″近視矯正術”主要用于指恢復因近視降低的視力的手術。

共同稱作近視矯正術的手術的具體實例目前包括放射狀角膜切開術(RK)、光性屈光性角膜切削術(PRK)和激光原位角膜磨鑲術(LASIK,角膜屈光手術)。在這些手術中,準分子激光用于PRK和LASIK。10年前,主要的近視矯正術是放射狀角膜切開術。然而,進來,最常用的近視矯正術是LASIK。因此,近視矯正術的趨勢近來在短的時間里得到了改變且由此可以認為最先進的手術方法將被新的手術方法替代。就LASIK而言,例如,在日本每年進行LASIK手術的有50,000-60,000個病例。需要LASIK手術的病例數量趨向于增加。由于這種LASIK手術數量的增加,將眼感干澀等報道為LASIK的副作用。

此外,近視矯正術還包括非手術的近視矯正方法,例如LASEK、基質內角膜環段(ICRS)、角膜內透鏡、有晶狀體眼人工晶狀體植入術和角膜矯正術。與上述相同的角膜感覺神經病也因這些近視矯正法而發生。

此外,不僅通過角膜移植術和近視矯正術,而且通過靶向要求治療眼病或角膜損傷的角膜的手術切斷角膜感覺神經,例如角膜切開術、角膜切除術、角膜屈光手術、角膜塑形術或角膜磨鑲術。作為結果,與上述相同的感覺神經病因這些手術操作發生。此外,在治療白內障等的過程中,可以進行手術以將人工晶狀體插入眼。甚至在這種手術中,因為角膜被適度切開,所以可能損傷角膜感覺神經。

腦信號蛋白是鑒定為用于產生神經生長錐以使其變性并且抑制軸突伸長的因子的內源性蛋白質。迄今為止,已知約20種類型的分子種類。在這些種類中,已經充分研究了一組基因,稱作第3類亞族,并且已知由這些基因編碼的蛋白質在體外具有強抑制神經突伸長的活性或導致生長錐變性的活性。研究最多的因子是腦信號蛋白3A(Sema3A,腦衰蛋白-1)(非專利文獻1和2),且這種蛋白質在低濃度下在短期內誘導培養的神經細胞生長錐變性。

已知對腦信號蛋白具有腦信號蛋白抑制活性的物質:獲自青霉屬SPF-3059菌株培養物(登記號FERMBP-7663;NITEPatentMicroorganismsDepositary(NPMD))的一系列呫噸酮化合物(專利文獻1和2);和通過化學修飾這樣的呫噸酮化合物形成的衍生物(專利文獻3)。呫噸酮化合物具有促進體內神經生成的作用。此外,還報道了這種呫噸酮化合物抑制與局部缺血性障礙相關的神經細胞死亡且有效地治療或預防缺血性神經病(專利文獻4)。

還報道了腦信號蛋白對成年動物體內感覺神經的作用(非專利文獻3)。特別地,報道了當使用基因槍將腦信號蛋白3基因導入家兔角膜外層細胞時,三叉神經變性且通過將Sema3基因施用于其中角膜外層已經剝脫和除去的家兔角膜創傷模型抑制三叉神經再伸長。該報道啟示成年感覺神經被Sema3基因緊張性調節且通過施用這種Sema3基因治療慢性痛。然而,該報道既未公開、也未啟示促進因角膜損傷切斷的角膜感覺神經再生的方法。這是因為該報道未啟示如果角膜損傷后未進行治療,則角膜感覺神經不能得到充分再生。此外,尚不清楚在角膜中表達的腦信號蛋白導致角膜感覺神經再生不充分。

已經報道,來源于晶狀體的腦信號蛋白3A排斥控制發育過程中(胎兒生命期)角膜感覺神經形成(非專利文獻4)。在該公開文獻中,認為眼球的感覺神經一般在胎兒生命期過程中形成,從而避開角膜,由此形成循環神經環,而這樣的循環神經環在從雞胚胎中當消除晶狀體時不能正常形成,且由此排斥對神經伸長起作用的因子從晶狀體中分泌。根據該公開文獻,當將晶狀體于感覺神經共培養時,感覺神經無法在其中存在晶狀體的方向上伸長。然而,通過添加Sema3A-阻斷肽感覺神經在上述舉出的方向上伸長。因此,在上述舉出的公開文獻中認為排斥對感覺神經伸長起作用的因子是來源于晶狀體的腦信號蛋白3A。此外,當將Sema3A-阻斷肽加入正常胚胎的晶狀體或其周圍時,證實了角膜感覺神經伸長。基于這些結果,該公開文獻報道了晶狀體衍生的腦信號蛋白3A排斥控制發育過程中(胎兒生命期)角膜感覺神經形成。然而,該公開文獻既未公開、也未啟示促進因角膜損傷切斷的角膜感覺神經再生的方法。該公開文獻的依據在于解釋了發育過程中角膜感覺神經特征性形成的機理。因此,該公開文獻既未描述腦信號蛋白于疾病的相關性,也未使用病理狀態模型研究腦信號蛋白。該公開文獻使用Sema3A-阻斷肽澄清了感覺神經不會進入角膜,因為腦信號蛋白3A對其排斥起作用。然而,這是在發育過程中(胎兒生命期)正常神經形成期情況中得到的發現。這些情況完全不同于抑制受損角膜中正常感覺神經伸長的情況。此外,在該公開文獻中,未使用角膜損傷模型進行抑制性實驗。因此,不能分析受損角膜中角膜感覺神經的伸長。此外,僅將雞胚胎用作體內模型且在研究中未使用嚙齒動物。因此,該報道既未公開、也未啟示促進因角膜損傷切斷的角膜感覺神經再生的方法。

已經報道了通過免疫染色方法或實時PCR方法證實了腦信號蛋白3A在大鼠角膜中表達和存在這一事實(非專利文獻5)。然而,該報道既未公開、也未啟示促進因角膜損傷切斷的角膜感覺神經再生的方法。在該公開文獻中,未進行抑制性實驗,未使用損傷模型或病理狀態模型進行實驗,且沒有有關角膜損傷的描述。

已經報道了如下事實:就小鼠而言,腦信號蛋白3A及其受體即神經纖毛蛋白-1和plexinA在從胎兒生命期到出生后至少2周的期限內在角膜中表達和存在,該事實已經通過免疫染色方法或實時PCR方法證實(非專利文獻6)。然而,該報道的依據在于腦信號蛋白3A與從胎兒生命期到出生后即刻的期限內角膜形成的相關性。該報道既未公開、也未啟示促進因角膜損傷切斷的角膜感覺神經再生的方法。在該公開文獻中,未進行抑制性實驗,未使用損傷模型或病理狀態模型進行實驗,且沒有有關角膜損傷的描述。

已經報道了如下事實:通過原位雜交法或實時PCR方法證實了腦信號蛋白3A表達的波動與雞胎兒生命期中角膜神經形成相關(非專利文獻7)。然而,該報道未包括有關哺乳動物的報道,但包括有關鳥類的報道。此外,該公開文獻的依據在于解釋了胎兒生命期過程中角膜神經回路形成的機理。該公開文獻既未公開、也未啟示促進因角膜損傷切斷的角膜感覺神經再生的方法。此外,在該公開文獻中,未進行抑制性實驗,未使用損傷模型或病理狀態模型進行實驗,且沒有有關角膜損傷的描述。

已經使用成年大鼠角膜創傷模型檢驗了腦信號蛋白3A及其受體神經纖毛蛋白-1表達的波動。作為結果,發現腦信號蛋白3A和神經纖毛蛋白-1的表達水平在因損傷導致的創傷區域邊緣部分整個層上增加,但該表達水平作為愈合的結果恢復到正常水平。因此,啟示腦信號蛋白3A與角膜外層中的創傷愈合緊密相關(非專利文獻8)。然而,該公開文獻涉及角膜外層細胞再生,但既未公開、也未啟示因角膜損傷切斷的角膜感覺神經再生的促進方法。這些損傷模型不同于因角膜移植術或感覺神經損傷導致的損傷模型。在該公開文獻中,尚未進行抑制性實驗且沒有有關感覺神經功能的描述。

引用清單

專利文獻

專利文獻1:國際公開號WO02/09756

專利文獻2:國際公開號WO03/062243

專利文獻3:國際公開號WO03/062440

專利文獻4:國際公開號WO2005/053678

非專利文獻

非專利文獻1:Cell,第75卷,p.217,1993

非專利文獻2:Cell,第75卷,p.1389,1993

非專利文獻3:NatureMedicine,第3卷,第12期,p.1398,1997

非專利文獻4:DevelopmentBiology,第306卷,第2期,p.750,2007

非專利文獻5:ExperimentalEyeResearch,第86卷,第4期,p.669,2008

非專利文獻6:BiochemicalandBiophysicalResearchCommunications,第403卷,第3-4期,p.305,2010

非專利文獻7:DevelopmentalBiology,第344卷,第1期,p.172,2010

非專利文獻8:BiochemicalandBiophysicalResearchCommmunications,第395卷,第4期,p.451,2010

發明概述

技術問題

如上所述,有許多有關角膜和腦信號蛋白的研究的報道。然而,沒有對有關如下事實進行研究:具有腦信號蛋白3A抑制活性的呫噸酮化合物促進因角膜病或角膜手術例如角膜移植術受損或切斷的角膜感覺神經再伸長并且具有有效地治療或預防因角膜病或角膜手術導致的感覺神經病的作用。迄今為止尚不了解該事實。

因此,本發明的一個目的在于提供用于因角膜病或角膜手術導致的感覺神經病的治療劑或預防劑,包含具有腦信號蛋白3A抑制活性的呫噸酮化合物作為活性成分。本發明的另一個目的在于提供使角膜感覺神經再生的促進劑,包含具有腦信號蛋白3A抑制活性的呫噸酮化合物作為活性成分。

[問題解決方式]

角膜感覺神經因角膜病或角膜移植術受損且由此導致感覺神經病。因為通過角膜移植術必然切斷角膜感覺神經,所以認為它是角膜感覺神經損傷的最嚴重模型。在移植的角膜中不能充分地使角膜感覺神經再伸長,作為結果,發生感覺紊亂。本發明的發明人認為在晶狀體或角膜外層上表達的腦信號蛋白3A的作用可以導致這種角膜感覺神經再伸長不充分。發明人已經進行了有關具有腦信號蛋白3A抑制活性的呫噸酮化合物的應用是否能夠使角膜感覺神經再伸長和感覺紊亂得到改善的深入研究。作為結果,本發明的發明人首次解釋了這種具有腦信號蛋白3A抑制活性的呫噸酮化合物促進小鼠角膜移植術模型中角膜感覺神經再生。因此,發明人發現這種具有腦信號蛋白3A抑制活性的呫噸酮化合物有效地作為用于因角膜病或角膜手術受損的角膜感覺神經損傷導致的角膜感覺神經病的治療劑或預防劑。作為基于上述舉出的發現進一步進行的深入研究的結果,完成了本發明。

特別地,本發明涉及如下[1]-[20]:

[1]因角膜病或角膜手術導致的感覺神經病的治療劑或預防劑,包含由下式(1)表示的化合物或其藥學可接受的鹽作為活性成分:

[式1]

其中R1表示氫原子、羧基或烷氧羰基;R2表示氫原子、羥基或酰氧基;R3表示氫原子、羧基或烷氧羰基;R4表示氫原子、羥基或酰氧基;

[2]根據上述[1]的治療劑或預防劑,其中在式(1)中,R1表示氫原子或羧基,R2表示氫原子或羥基,R3表示氫原子或羧基,R4表示氫原子或羥基;

[3]根據上述[1]或[2]的治療劑或預防劑,其中在式(1)中,至少一個R2和R4表示羥基;

[4]根據上述[3]的治療劑或預防劑,其中在式(1)中,R2表示羥基;

[5]根據上述[3]的治療劑或預防劑,其中在式(1)中,R2和R4各自表示羥基;

[6]根據上述[1]-[5]任一項的治療劑或預防劑,其中在式(1)中,至少一個R1和R3的至少一個表示羧基;

[7]根據上述[6]的治療劑或預防劑,其中在式(1)中,R3表示羧基;

[8]根據上述[1]的治療劑或預防劑,其中在式(1)中,R1和R3各自表示羧基,R2和R4各自表示羥基;

[9]根據上述[1]-[8]任一項的治療劑或預防劑,其中所述角膜病是角膜炎、角膜白斑、角膜感染、角膜變性、角膜營養不良、角膜基質營養不良、大泡性角膜病變、圓錐角膜、角膜代償失調、角膜潰瘍、神經麻痹性角膜病變、糖尿病性角膜病變、角膜化學燒傷或角膜熱燒傷;

[10]根據上述[1]-[8]任一項的治療劑或預防劑,其中所述角膜手術是角膜移植術;

[11]根據上述[1]-[8]任一項的治療劑或預防劑,其中所述角膜手術是近視矯正術;

[12]根據上述[1]-[8]任一項的治療劑或預防劑,其中所述角膜手術靶向要求治療的眼病或角膜損傷的角膜;

[13]根據上述[1]-[12]任一項的治療劑或預防劑,其中歸因于角膜病或角膜手術損傷的角膜感覺神經導致的感覺神經病是知覺缺失;

[14]根據上述[1]-[12]任一項的治療劑或預防劑,其中歸因于角膜病或角膜手術損傷的角膜感覺神經導致的感覺神經病是眼感干澀;

[15]根據上述[1]-[14]任一項的治療劑或預防劑,為眼用制劑形式;

[16]用于使角膜感覺神經再生的促進劑,包含由式(1)表示的化合物或其藥學可接受的鹽作為活性成分;

[17]根據上述[16]的再生促進劑,其中該促進劑用于治療或預防因角膜病或角膜手術導致的感覺神經病;

[18]根據上述[17]的再生促進劑,其中因角膜病或角膜手術導致的感覺神經病是知覺缺失;

[19]根據上述[17]的再生促進劑,其中因角膜病或角膜手術導致的感覺神經病是眼感干澀;和

[20]根據上述[16]-[19]任一項的再生促進劑,其中該促進劑是眼用制劑形式。

此外,本發明涉及如下[1-1]-[20-1]:

[1-1]治療或預防因角膜病或角膜手術導致的感覺神經病的方法,包括對有此需要的受試者施用由下式(1)表示的化合物或其藥學可接受的鹽:

[式2]

其中R1表示氫原子、羧基或烷氧羰基;R2表示氫原子、羥基或酰氧基;R3表示氫原子、羧基或烷氧羰基;R4表示氫原子、羥基或酰氧基;

[2-1]根據上述[1-1]的治療或預防方法,其中在式(1)中,R1表示氫原子或羧基,R2表示氫原子或羥基,R3表示氫原子或羧基,R4表示氫原子或羥基;

[3-1]根據上述[1-1]或[2-1]的治療或預防方法,其中在式(1)中,R2和R4的至少一個表示羥基;

[4-1]根據上述[3-1]的治療或預防方法,其中在式(1)中,R2表示羥基;

[5-1]根據上述[3-1]的治療或預防方法,其中在式(1)中,R2和R4各自表示羥基;

[6-1]根據上述[1-1]-[5-1]任一項的治療或預防方法,其中在式(1)中,R1和R3的至少一個表示羧基;

[7-1]根據上述[6-1]的治療或預防方法,其中在式(1)中,R3表示羧基;

[8-1]根據上述[1-1]的治療或預防方法,其中在式(1)中,R1和R3各自表示羧基,R2和R4各自表示羥基;

[9-1]根據上述[1-1]-[8-1]任一項的治療或預防方法,其中所述角膜病是角膜炎、角膜白斑、角膜感染、角膜變性、角膜營養不良、角膜基質營養不良、大泡性角膜病變、圓錐角膜、角膜代償失調、角膜潰瘍、神經麻痹性角膜病變、糖尿病性角膜病變、角膜化學燒傷或角膜熱燒傷;

[10-1]根據上述[1-1]-[8-1]任一項的治療或預防方法,其中所述角膜手術是角膜移植術;

[11-1]根據上述[1-1]-[8-1]任一項的治療或預防方法,其中所述角膜手術是近視矯正術;

[12-1]根據上述[1-1]-[8-1]任一項的治療或預防方法,其中所述角膜手術靶向要求治療眼病或角膜損傷的角膜;

[13-1]根據上述[1-1]-[12-1]任一項的治療或預防方法,其中歸因于角膜病或角膜手術損傷的角膜感覺神經導致的感覺神經病是知覺缺失;

[14-1]根據上述[1-1]-[12-1]任一項的治療或預防方法,其中歸因于角膜病或角膜手術損傷的角膜感覺神經導致的感覺神經病是眼感干澀;

[15-1]根據上述[1-1]-[14-1]任一項的治療或預防方法,其中以眼用制劑形式施用由式(1)表示的化合物或其藥學可接受的鹽;

[16-1]用于促進角膜感覺神經再生的方法,包括對有此需要的受試者施用由式(1)表示的化合物或其藥學可接受的鹽;

[17-1]根據上述[16-1]的再生促進方法,其中該方法用于治療或預防因角膜病或角膜手術導致的感覺神經病;

[18-1]根據上述[17-1]的再生促進方法,其中因角膜病或角膜手術導致的感覺神經病是知覺缺失;

[19-1]根據上述[17-1]的再生促進方法,其中因角膜病或角膜手術導致的感覺神經病是眼感干澀;和

[20-1]根據上述[16-1]-[19-1]任一項的再生促進方法,其中以眼用制劑形式施用由式(1)表示的化合物或其藥學可接受的鹽。

此外,本發明涉及如下[1-2]-[20-2]:

[1-2]由下式(1)表示的化合物或其藥學可接受的鹽在生產用于因角膜病或角膜手術導致的感覺神經病的治療劑或預防劑中的用途:

[式3]

其中R1表示氫原子、羧基或烷氧羰基;R2表示氫原子、羥基或酰氧基;R3表示氫原子、羧基或烷氧羰基;R4表示氫原子、羥基或酰氧基;

[2-2]根據上述[1-2]的用途,其中在式(1)中,R1表示氫原子或羧基,R2表示氫原子或羥基,R3表示氫原子或羧基,R4表示氫原子或羥基;

[3-2]根據上述[1-2]-[2-2]任一項的用途,其中在式(1)中,R2和R4的至少一個表示羥基;

[4-2]根據上述[3-2]的用途,其中在式(1)中,R2表示羥基;

[5-2]根據上述[3-2]的用途,其中在式(1)中,R2和R4各自表示羥基;

[6-2]根據上述[1-2]-[5-2]任一項的用途,其中在式(1)中,R1和R3的至少一個表示羧基;

[7-2]根據上述[6-2]的用途,其中在式(1)中,R3表示羧基;

[8-2]根據上述[1-2]的用途,其中在式(1)中,R1和R3各自表示羧基,R2和R4各自表示羥基;

[9-2]根據上述[1-2]-[8-2]任一項的用途,其中所述角膜病是角膜炎、角膜白斑、角膜感染、角膜變性、角膜營養不良、角膜基質營養不良、大泡性角膜病變、圓錐角膜、角膜代償失調、角膜潰瘍、神經麻痹性角膜病變、糖尿病性角膜病變、角膜化學燒傷或角膜熱燒傷;

[10-2]根據上述[1-2]-[8-2]任一項的用途,其中所述角膜手術是角膜移植術;

[11-2]根據上述[1-2]-[8-2]任一項的用途,其中所述角膜手術是近視矯正術;

[12-2]根據上述[1-2]-[8-2]任一項的用途,其中所述角膜手術靶向要求治療眼病或角膜損傷的角膜;

[13-2]根據上述[1-2]-[12-2]任一項的用途,其中歸因于角膜病或角膜手術損傷的角膜感覺神經導致的感覺神經病是知覺缺失;

[14-2]根據上述[1-2]-[12-2]任一項的用途,其中歸因于角膜病或角膜手術損傷的角膜感覺神經導致的感覺神經病是眼感干澀;

[15-2]根據上述[1-2]-[14-2]任一項的用途,其中所述治療劑或預防劑是眼用制劑形式;

[16-2]式(1)表示的化合物或其藥學可接受的鹽在生產用于使角膜感覺神經再生的促進劑中的用途;

[17-2]根據上述[16-2]的用途,其中所述再生促進劑用于治療或預防因角膜病或角膜手術導致的感覺神經病;

[18-2]根據上述[17-2]的用途,其中因角膜病或角膜手術導致的感覺神經病是知覺缺失;

[19-2]根據上述[17-2]的用途,其中因角膜病或角膜手術導致的感覺神經病是眼感干澀;和

根據上述[16-2]-[19-2]任一項的用途,其中所述治療劑或預防劑是眼用制劑形式。

本發明的有利作用

根據本發明,能夠使用包含具有腦信號蛋白3A抑制活性的呫噸酮化合物作為活性成分的藥物治療或預防因角膜病或角膜手術導致的感覺神經病。即根據本發明,能夠治療或預防因角膜病導致的感覺神經病或因靶向要求治療眼病或角膜損傷的角膜的角膜手術例如角膜移植術、近視矯正術或角膜手術導致的感覺神經病,特別是因角膜病或角膜手術損傷的角膜感覺神經導致的感覺神經病。此外,根據本發明,已經澄清了呫噸酮化合物可以有效地用作使感覺神經再生的促進劑并且還可以用作治療或預防因角膜病或角膜手術損傷的角膜感覺神經導致的感覺神經病的再生促進劑。

此外,本發明中使用的呫噸酮化合物在水溶液例如磷酸鹽緩沖液中在化學上穩定。當本發明的呫噸酮化合物用于治療或預防因角膜病或角膜手術導致的感覺神經病或作為再生促進劑時,最優選使用通過滴眼液施用。因此,已經澄清了本發明中使用的呫噸酮化合物是極為優選的,因為在以滴眼液形式施用后,它們在淚液或角膜中穩定。

附圖簡述

[圖1]圖1是顯示通過測定實施例1中經角膜移植術移植的角膜即角膜移植片中再生的神經纖維長度得到的結果的示意圖[斯氏t-檢驗,與對照組比較,*:p<0.01]。縱軸表示再生纖維的總長度。橫軸表示vinaxanthone(SPF-3059-5)施用組和對照組(僅施用不含藥物的溶劑)。從圖1中發現,通過施用vinaxanthone促進了角膜移植片中神經纖維再生。

[圖2]圖2是顯示在手術完成后每周通過使用Cochet-Bonnet角膜觸覺測量器測量角膜移植片中心部分中角膜敏感度得到的結果的示意圖,其中進行這種測量以評估實施例1中再生神經的功能[Mann-WhitneyU檢驗,與對照組比較,*:p<0.01]。縱軸表示角膜敏感度水平。橫軸表示移植完成后第1周、第2周和第3周得到的結果。在圖2中,實心圓圈(●)表示vinaxanthone施用組,空心圓圈(○)表示僅施用不含藥物的溶劑的對照組。從圖2中發現,通過施用vinaxanthone改善了角膜敏感度。作為角膜敏感度改善的結果,發現實施例1中的再生神經主要是角膜感覺神經。

[圖3]圖3是顯示通過測定實施例1中移植的角膜移植片中新近形成的血管的數量得到的結果的示意圖[斯氏t-檢驗,與對照組比較未發現顯著性差異]。縱軸表示新近形成的血管總長度。橫軸表示vinaxanthone(SPF-3059-5)施用組和對照組(僅施用不合藥物的溶劑)。從圖3中發現,通過施用vinaxanthone未促進新形成血管進入角膜移植片。

[圖4]圖4是顯示以滴眼液形式施用后通過測定角膜中vinaxanthone的保留量得到的結果的示意圖,其中將vinaxanthone溶液的濃度設定在實施例2中的0.5mg/mL。虛線表示在體外實驗中得到的IC50值(75ng/mL=130nM)。縱軸表示保留的vinaxanthone濃度(ng/g)。橫軸中的數值表示經過一定時間期限后保留的vinaxanthone水平(例如數值0.5表示施用后0.5小時的保留水平,數值2表示施用后2小時的保留水平,數值6表示施用后6小時的保留水平)。從圖3中發現。以滴眼液的形式施用0.5mg/mL濃度的vinaxanthone在以認為表示藥物作用所必需的角膜中的濃度施用后保留0.5小時。

[圖5]就圖4而言,圖5是顯示以滴眼液形式施用后通過測定vinaxanthone在角膜中的保留量得到的結果的示意圖,其中將vinaxanthone溶液的濃度設定在實施例2中的1.5mg/mL。

[圖6]就圖4而言,圖6是顯示以滴眼液形式施用后通過測定vinaxanthone在角膜中的保留量得到的結果的示意圖,其中將vinaxanthone溶液的濃度設定在實施例2中的5.0mg/mL。

[圖7]圖7是顯示實施例10中通過測定呫噸酮化合物在PBS(磷酸鹽緩沖液)中的穩定性得到的結果的示意圖。橫軸表示用于測定的每種化合物的名稱。縱軸表示每種化合物的剩余百分比。從圖7中發現,從式(1)排除的所有呫噸酮化合物幾乎完全分解,而式(1)中包括的噸酮化合物保留的剩余百分比為90%或以上。

[圖8]圖8是顯示實施例11中通過vinaxanthone(SPF-3059-5)和SPF-3059-1在PBS(磷酸鹽緩沖液)中的穩定性得到的結果的示意圖。橫軸表示其中每種化合物溶解后保持的天數。縱軸表示每種化合物的剩余百分比。在圖8中,實心三角形(▲)表示vinaxanthone穩定性隨時間的改變,實心圓圈(●)表示SPF-3059-1穩定性隨時間的改變。從圖8中發現,SPF-3059-1在約1周時幾乎完全分解,而vinaxanthone在37℃在PBS4周或以上時保留的剩余百分比為96%或以上,由此顯示穩定性在4周或以上。

實施方案的描述

在本說明書中,所用的術語“烷氧羰基”是指包含2-7個碳原子的直鏈或支鏈烷氧羰基。烷氧羰基的具體實例包括甲氧羰基、乙氧羰基、丙氧羰基、1-甲基乙氧羰基、丁氧羰基、1-甲基丙氧羰基、2-甲基丙氧羰基、1,1-二甲基乙氧羰基、戊氧羰基和己氧羰基。

本文所用的術語“酰氧基”是指包含2-6個碳原子的直鏈或支鏈酰氧基。酰氧基的具體實例包括乙酰氧基、丙酰氧基、丁酰氧基、異丁酰氧基、戊酰氧基、異戊酰氧基和新戊酰氧基。

本文所用的術語“藥學可接受的鹽”是指藥學或獸藥可接受的鹽。這種藥學可接受的鹽的實例包括:無機堿式鹽,例如鈉鹽、鉀鹽、鈣鹽、鎂鹽、鋁鹽和銨鹽;有機堿式鹽,例如三乙銨鹽、三乙醇銨鹽、吡啶鎓鹽和二異丙基銨鹽;和堿性氨基酸鹽,例如精氨酸和賴氨酸。此外,例如當式(1)表示的化合物帶有兩個羧基時,本發明藥學可接受的鹽還包括例如一鈉一鉀鹽這樣的鹽。

措詞“因角膜病導致的感覺神經病”中的“角膜病”的實例包括角膜炎、角膜白斑(因角膜皰疹、麻疹、梅毒或損傷導致)、角膜感染、角膜變性、角膜營養不良、角膜基質營養不良、大泡性角膜病變、圓錐角膜、角膜代償失調、角膜潰瘍、神經麻痹性角膜病變、糖尿病性角膜病變、角膜化學燒傷(因化學物質等進入眼導致)和角膜熱燒傷。

措詞“因角膜手術導致的感覺神經病”中的“角膜手術”的實例包括角膜移植術、近視矯正術和靶向要求治療眼病或角膜損傷的角膜的角膜手術。

“角膜移植術”也稱作角膜移植或角膜成形術。這種角膜移植術的實例包括穿透角膜移植術、板層角膜移植術、深部板層角膜移植術、鞏膜角膜移植術、鞏膜移植物移植、角膜緣移植和羊膜移植。進行角膜移植術的目的的實例包括視力目的、治療目的、手術目的和美容目的。角膜移植術的具體實例包括:為治療原因性疾病例如角膜炎、角膜白斑(因角膜皰疹、麻疹、梅毒或損傷導致)、角膜感染、角膜變性、角膜營養不良、角膜基質營養不良、大泡性角膜病變(進行眼內晶體植入的眼、Fuchs氏角膜內皮營養不良或無晶狀體眼)、圓錐角膜和角膜代償失調而進行的角膜移植術;為治療感染例如角膜潰瘍(細菌、真菌、病毒或無菌潰瘍)進行的角膜移植術;為治療損傷進行的角膜移植術;為治療角膜化學燒傷或角膜熱燒傷進行的角膜移植術;和為治療神經營養性角膜炎例如糖尿病性角膜病變而進行的角膜移植術。

目前進行的“近視矯正術”的具體實例包括放射狀角膜切開術(RK)、光性屈光性角膜切削術(PRK)和激光原位角膜磨鑲術(LASIK)。此外,近視矯正法例如LASEK、基質內角膜環、角膜內透鏡、有晶狀體眼人工晶狀體植入術和角膜矯正術也包括在近視矯正術中。

措詞“靶向要求治療眼病或角膜損傷的角膜的角膜手術”中“眼病”的實例包括角膜炎、角膜皰疹、圓錐角膜、角膜變性、角膜白斑、大泡性角膜病變、角膜軟化癥和白內障。

措詞“靶向要求治療眼病或角膜損傷的角膜的角膜手術”中“角膜損傷”的實例包括刺激性液體進入眼、固體飛入和進入眼、用手術刀切割、用手術刀粘片等、寵物搔抓、接觸鏡不適當使用、強光束和挫傷導致的損傷。

措詞“靶向要求治療眼病或角膜損傷的角膜的角膜手術”中“角膜手術”的實例包括角膜切開術、角膜切開術、角膜屈光手術、角膜矯正術和角膜磨削術。此外,在其中眼病是白內障的情況中,靶向要求治療白內障的角膜的外科手術包括插入人工晶狀體(人造晶狀體)的手術。

措詞“角膜病或角膜手術導致的感覺神經病”中的“感覺神經病”的實例包括觸覺和痛覺減輕。眨眼反射缺乏因知覺缺失導致且可以導致眼感干澀、眼球受損等。因此,“感覺神經病”還包括眼感干澀。應注意,術語“感覺神經”是指分布于角膜中的感覺神經且由此其具有的含義與角膜中傳輸的三叉神經相同(在角膜中傳輸的眼神經),即角膜感覺神經。

術語“角膜感覺神經再生促進劑”用于指具有促進角膜感覺神經再生的作用的藥物。術語“促進角膜感覺神經再生的作用”用于指促進因角膜手術等切斷或受損的角膜感覺神經再生的作用。

在式(1)表示的化合物中,R1和R3各自獨立地表示氫原子、羧基或烷氧羰基。優選的烷氧羰基的實例包括包含2-4個碳原子的烷氧羰基,例如甲氧羰基、乙氧羰基或丙氧羰基。其中更優選甲氧羰基。作為R1,優選氫原子或羧基,其中更優選羧基。作為R3,優選氫原子或羧基,其中更優選羧基。

R2和R4各自獨立地表示氫原子、羥基或酰氧基。優選的酰氧基的實例包括包含2-4個碳原子的酰氧基,例如乙酰氧基、丙酰氧基、丁酰氧基或異丁酰氧基。其中更優選乙酰氧基。作為R2,優選氫原子或羥基,其中更優選羥基。作為R4,優選氫原子或羥基,其中更優選羥基。

式(1)表示的化合物的具體實例包括:SPF-3059-2,其中R1是羧基,R2是羥基,R3是氫原子,R4是羥基;SPF-3059-4,其中R1是羧基,R2是羥基,R3是羧基,R4是氫原子;SPF-3059-5,其中R1是羧基,R2是羥基,R3是羧基,R4是羥基;SPF-3059-12,其中R1是羧基,R2是氫原子,R3是羧基,R4是羥基;SPF-3059-24,其中R1是氫原子,R2是羥基,R3是羧基,R4是羥基;SPF-3059-25,其中R1是氫原子,R2是羥基,R3是羧基,R4是氫原子;和SPF-3059-26,其中R1是氫原子,R2是羥基,R3是氫原子,R4是羥基。在這些化合物中,最優選SPF-3059-5。SPF-3059-5也稱作vinaxanthone。

作為由式(1)表示的化合物的藥學可接受的鹽,優選鈉鹽、鉀鹽和鈣鹽,因為這些鹽在水中具有改善的溶解度且溶液的pH無需調整。在這些鹽中,最優選鈉鹽。

可以通過培養或化學總體合成青霉屬SPF-3059菌株或通過已知合成方法的化學轉化、使用通過上述舉出的培養物或總體合成物作為原料得到由式(1)表示的化合物。

即,就應用培養方法而言,可以通過培養分離自大阪區域土地的屬于青霉屬的霉菌即SPF-3059菌株[其中該菌株寄根據如下條文保存:國際承認的用于專利程序的微生物保藏布達佩斯條約與獨立行政法人產業技術綜合研究所專利生物保藏中心,即經濟部,貿易和工業局下的獨立行政機構(日本茨城縣筑波市東1丁目1番地1中央第6,郵政編碼:305-8566),登記號FERMBP-7663,2001年7月13日]有效地得到由式(1)表示的化合物。特別地,可以根據國際公開號WO02/09756(上述舉出的專利文獻1)或國際公開號WO03/062243(上述舉出的專利文獻2)中所述的方法得到由式(1)表示的化合物。

就應用總體合成而言,根據JP2008-13530A中所述的方法得到由式(1)表示的化合物。

在由式(1)表示的化合物中,可以通過對由式(1)表示的化合物進行已知的酯化(其中所涉及的烷氧羰基是羧基、用作原料)和/或通過對由式(1)表示的化合物進行已知的酰化(其中所涉及的酰氧基是羥基、用作原料)、由此進行化合物的化學轉化合成化合物,其中至少一個R1和R3表示烷氧羰基或至少一個R2和R4表示酰氧基。這種已知的酯化或酰化可以根據JP2006-335683A或國際公開號WO03/062440(上述舉出的專利文獻3)中所述的方法進行。

此外,可以通過使堿對用任一上述方法得到的式(1)表示的化合物在適合的溶劑例如水、甲醇、乙醇、丙酮、乙酸乙酯、氯仿或乙醚中起作用得到由式(1)表示的化合物的藥學可接受的鹽。

由本發明式(1)表示的化合物也稱作呫噸酮化合物。正如下文實施例4和5中顯而易見的,這是對腦信號蛋白3A的神經突伸長活性具有抑制作用的化合物。正如在下文實施例2中顯而易見的,本發明首次闡明了由式(1)表示的呫噸酮化合物促進小鼠角膜移植術模型中的角膜感覺神經再生。因此,本發明的呫噸酮化合物有效地用于治療或預防因角膜病或角膜手術受損的角膜感覺神經導致的角膜感覺神經病。歸因于角膜病或角膜手術損傷的角膜感覺神經導致的感覺神經病的實例是觸覺或痛覺下降。眨眼反射缺乏是因這種知覺缺失導致,然后導致眼感干澀、眼球上的損傷等。因此,由式(1)表示的呫噸酮化合物特別有效地用于治療或預防觸覺、痛覺下降等或眼感干澀。

正如下文實施例1中顯而易見的,由式(1)表示的呫噸酮化合物促進角膜感覺神經再生且由此還有效地作為角膜感覺神經再生的促進劑。通過促進角膜感覺神經再生,因角膜病或角膜手術受損的角膜感覺神經導致的感覺神經病可以得到治療或預防。更具體地,由式(1)表示的呫噸酮化合物有效地預防或治療因角膜病或角膜手術受損的角膜感覺神經導致的知覺缺失和眼感干澀。

本發明用于角膜感覺神經病的治療劑或預防劑和用于使角膜感覺神經再生的促進劑包含由式(1)表示的化合物或其藥學可接受的鹽作為活性成分。此外,可以將用于不同類型制劑的添加劑成分例如藥學可接受的共同載體、粘合劑、穩定劑、賦形劑、稀釋劑、pH調節劑、崩解劑、助溶劑、增溶劑和等滲劑加入本發明的治療劑或預防劑或本發明的再生促進劑。

此外,可以通過口服或胃腸外施用這種治療劑或預防劑和這種再生促進劑。可以通過全身施用或局部施用施用這些活性劑。更優選地,通過胃腸外將這些活性劑局部施用于眼。即就口服施用而言,可以通過常用的劑型例如片劑、丸劑、粉末、顆粒、膠囊、糖漿劑、乳劑或混懸液口服施用所述活性劑。就胃腸外施用而言,可以將活性劑加工成劑型,例如眼用制劑、眼用軟膏劑、眼內注射劑、結膜下注射劑、靜脈內注射劑(滴劑)、肌內注射劑、皮下注射劑或鼻用制劑(鼻內施用的噴霧劑)。其中,優選眼用制劑。就液體制劑而言,如果適合,可以將活性劑加工成溶液、乳劑、混懸液等。其中,使用磷酸鹽緩沖液的眼用制劑溶液是優選的。就固體制劑例如片劑而言,可以通過混合活性成分與如下成分制備:常用的藥理學可接受的載體或賦形劑,例如乳糖、蔗糖或玉米淀粉;粘合劑,例如羥丙基纖維素、聚乙烯吡咯烷酮或羥丙基甲基纖維素;崩解劑,例如羥丙基甲基纖維素鈉或羥基乙酸淀粉鈉;潤滑劑,例如硬脂酸或硬脂酸鎂;防腐劑等。為了進行胃腸外施用,可以將活性成分溶于或混懸于生理學可接受的載體,例如水、生理鹽水、油、葡萄糖溶液等,且如果必要,由此得到的溶液或混懸液可以包含助劑,例如乳化劑、穩定劑、調節滲透的鹽或緩沖劑。就眼用制劑而言,如果必要,它可以包含添加劑,包括等滲劑,例如甘油或氯化鈉;緩沖劑,例如磷酸或檸檬酸;pH調節劑,例如鹽酸或氫氧化鈉;增稠劑,例如羥丙基甲基纖維素或聚乙烯醇;防腐劑,例如芐索氯銨;或增溶劑。此外,用于眼用軟膏劑的添加劑的實例包括凡士林油、聚乙二醇、純羊毛脂和液體石蠟。

應用劑量和施用頻率根據施用方法、患者年齡、體重和癥狀等的不同而不同。優選將活性劑局部施用于受侵害區域的方法。此外。優選將活性劑每日施用一次或兩次或多次。當將活性劑每日施用兩次或多次時,期望每天或在適當間隔重復施用。由于角膜感覺神經再生一般需要幾天到幾個月的時間期限,所以期望連續施用活性劑以在上述舉出的時間期限抑制腦信號蛋白活性。

在應用劑量方面,相對于單一施用的活性成分量,可以以幾百μg-2g、優選5-100mg且更優選幾十mg或以下的劑量將活性劑施用于成年患者。可以將活性劑每天施用一次或分次幾次施用。為了降低施用頻率,還可以使用緩釋制劑。還能夠在長時間期限內使用滲透泵等施用少量的活性劑。就胃腸外施用而言,可以以0.1-100mg/天且更優選0.3-50mg/天的劑量將活性劑施用于成年患者。可以將活性劑每天施用一次或分次幾次施用。為了降低施用頻率,也可以使用緩釋制劑。

在其中以滴眼液形式使用活性劑的情況中,相對于活性成分的量,可以以0.01-10w/v%且優選0.05-5w/v%的劑量將活性劑施用于成年患者。期望以一滴至幾滴的量施用活性劑,每日單一施用1-6次,視癥狀而定。正如下文實施例2中顯而易見的,由式(1)表示的呫噸酮化合物在作為眼用制劑施用時在角膜中的保留極佳。因此,本發明呫噸酮化合物的優選劑型是眼用制劑。此外,當以眼用軟膏劑的形式使用本發明的呫噸酮化合物時,相對于其活性成分的量,可以以0.01-10w/v%且優選0.1-5w/v%的劑量將活性劑施用該制劑。期望每天將這種眼用軟膏劑施用1-6次,視癥狀而定。

在所有這些施用方法中,優選采用這樣的施用途徑和施用方法,能夠使化合物的濃度在其作用部位達到足以抑制腦信號蛋白活性的水平。此外,本發明用于因角膜病或角膜手術導致的感覺神經病的治療劑或預防劑和用于使角膜感覺神經再生的促進劑也可以用作用于動物的活性劑。在這樣的動物中,優選哺乳動物,最優選人。

本發明下文在如下實施例中更具體地描述本發明。然而,這些實施例不預以限定本發明的技術范圍。

實施例1

vinaxanthone在促進小鼠角膜移植術模型中角膜移植片中角膜感覺神經再 生中的作用

在本實驗中,使用遺傳修飾的小鼠(P0-Cre/Floxed-EGFP小鼠),其中角膜實質細胞、角膜內皮細胞和神經表達角膜中的一類熒光蛋白即綠色熒光蛋白(GFP)。使用這些小鼠易于通過取出一層角膜內皮細胞觀察到在角膜中傳輸的角膜感覺神經纖維。

將來源于同基因的野生型小鼠的角膜植入每只上述舉出的小鼠。此后,通過在手術完成后即刻結膜下注射將50ulvinaxanthone(已經溶于Rinderon(1mg/ml倍他米松磷酸鈉注射液)至0.1mg/mL濃度)施用于小鼠,然后每隔2天施用1次,總計11次。以與上述相同的量僅將不含藥物的溶劑施用于對照組。手術完成后1周除去縫合線。手術完成后3周,評估角膜敏感度,然后對小鼠實施安樂死,然后切下眼球。對有關角膜移植片中神經纖維的再生進行比較。通過在手術完成后每周使用Cochet-Bonnet角膜觸覺測量器測量角膜移植片中心上的角膜敏感度評估角膜敏感度。通過如下步驟對有關角膜移植片中神經纖維再生進行比較:根據免疫染色法、使用β3微管蛋白抗體測定角膜移植片中對β3微管蛋白和作為再生神經纖維的GFP雙重陽性的纖維;使用計算機圖象處理軟件追蹤再生的神經纖維;測定其總長度,然后在vinaxanthone施用組與對照組之間進行比較。

從圖1中所示的結果中發現,vinaxanthone施用組中角膜移植片上的神經纖維再生明顯比對照組顯著。

此外,從圖2中所示的結果中發現,在手術完成后3周,vinaxanthone施用組中觀察到的眨眼發射改善明顯比對照組顯著,使得在vinaxanthone施用組中的角膜敏感度可以得到改善。這些結果啟示圖1中所示的再生神經主要是角膜感覺神經。

在角膜血管化方面,將在使用CD31抗體的免疫染色法中顯示陽性的纖維定義為新形成的血管并且用計算機圖象處理軟件追蹤新形成的血管。此后,測量其總長度,然后在vinaxanthone施用組與對照組之間進行比較。

從圖3中所示的結果中發現,在vinaxanthone施用組中血管化進入角膜移植片與對照組相比未得到強化。

這些結果證實vinaxanthone促進切斷的角膜神經纖維再生并且還促進神經功能即角膜敏感度恢復。此外,顯然vinaxanthone不會促進屬于有害現象的角膜血管化。

實施例2

vinaxanthone制劑在角膜組織中保留的評價

通過施用滴眼液給家兔(Kbs:JW,健康,雄性,體重:2.00-2.49kg)右眼角膜上施用50μLvinaxanthone(0.5、1.5和5.0mg/mL)的PBS溶液(0.12M磷酸鹽緩沖液(pH7.4)),然后封閉其眼30秒。此后,在施藥后0.5、2和6小時,對家兔實施安樂死,然后用生理鹽水洗滌切下的眼球。此后,從每個眼球中采集角膜。勻化角膜,然后從其中提取vinaxanthone。使用HPLC檢查角膜組織中vinaxanthone含量和濃度隨時間的改變。

從圖4、5和6中所示的結果中證實,以應用濃度/劑量依賴性方式將vinaxanthone轉入角膜組織。在5.0mg/mLvinaxanthone溶液施用組中,證實甚至在手術完成后6小時,vinaxanthone在角膜中的保留量大于通過體外實驗(實施例4中有關對Sema3A分解活性的抑制活性的實驗)得到的IC50值(75ng/mL=130nM,在每個圖中用虛線表示)。顯然甚至可以通過施用滴眼液達到認為表示藥物作用所必需的角膜中vinaxanthone的濃度。

作為結果,啟示施用滴眼液是現實的vinaxanthone施用方法。

實施例3

式(1)表示的呫噸酮化合物的生產

本發明式(1)表示的呫噸酮化合物是眾所周知的化合物且公開在國際公開號WO02/09756(上述舉出的專利文獻1)、國際公開號WO03/062243(上述舉出的專利文獻2)、國際公開號WO03/062440(上述舉出的專利文獻3)、JP2006-335683A和JP2008-13530A中。本發明的呫噸酮化合物可以通過培養、化學總體合成或化學轉化SPF-3059菌株生產。除生產方法外,該化合物的物化特性也公開在上述舉出的專利文獻中。生產方法等具體如下。

將包含2%葡萄糖、5%蔗糖、2%棉籽粉、0.1%硝酸鈉、0.1%L-組氨酸、0.05%磷酸氫二鉀、0.07%氯化鉀和0.0014%七水合硫酸鎂的已經調整至pH7.0的10ml培養基傾入50ml體積的錐形瓶,然后用高壓滅菌器滅菌。向得到的培養基中接種一鉑環的斜面培養的青霉屬物種SPF-3059菌株(FERMBP-7663),然后將得到的混合物在27℃以180rpm進行旋轉攪拌培養4天,以得到預-預-培養物。將與上述相同組成的125ml培養基傾入各5支500ml體積的錐形瓶,然后用高壓滅菌器滅菌。將4ml預-預培養基加入到得到的各培養基中,然后在27℃以180rpm進行旋轉攪拌培養4天,以得到預-培養物。將包含1.43%葡萄糖、3.57%蔗糖、1.43%棉籽粉、0.07%硫酸鈉、0.07%L-組氨酸、0.036%磷酸氫二鉀、0.05%氯化鉀、0.001%七水合硫酸鎂和0.01%AdekanolLG-295S(由ADEKACorporation生產的消泡劑)的已經調整至pH7.0的30L培養基傾入50L體積的發酵缸,然后進行高壓蒸汽滅菌(121℃,20分鐘)。此后,將500ml上述預-培養基加入到得到的培養基中,然后將得到的混合物在27℃以400rpm、15L/min的換氣量進行通風攪拌培養9天。

培養完成后,以10,000rpm將培養基離心10分鐘,以從細胞團中分離上清液。用20L乙酸乙酯-甲酸(99∶1)將上清液部分提取2次。用30L丙酮提取細胞團部分,然后過濾,濃縮。用10L乙酸乙酯-甲酸(99:1)提取得到的水溶液。將上述兩種提取物彼此混合,然后使得到的混合物進行真空濃縮,得到224g粗提取物。將100g粗提取物溶于500ml甲醇。然后將得到的溶液進行使用Sephadex(注冊商標)LH-20(GEHealthcare)的柱色譜,然后用甲醇洗脫。采集活性級分,然后減壓蒸餾出溶劑,得到48.8g油狀產物。將得到的油狀產物溶于400ml甲醇。然后將生成物進行使用TSKgelTOYOPERLHW-40F(TosohCorporation)的柱色譜,然后用甲醇洗脫。采集活性級分,然后減壓蒸餾出溶劑,得到21.8g基本上純的產物。將該產物每次以200mg溶于2ml二甲亞砜(DMSO),然后將得到的溶液進行反相分離型HPLC。反相分離型HPLC的條件如下。柱:Wakopak-Wakosil(注冊商標)-II5C18HGprep(5cm直徑×10cm連接5cm直徑×25cm,由WakoPureChemicalIndustriesLtd.生產),洗脫液A:1%甲酸水溶液,洗脫液B:甲醇,梯度:線性梯度,其中溶液B的百分比為45%→75%,2小時,流速:25ml/min,檢測:在260nm的吸光度。每分鐘分離洗脫液。

通過分析型HPLC分析由此分離的級分。分析型HPLC的條件如下。柱:Wakopak-Wakosil(注冊商標)-II5C18RS(4.6mm直徑×150mm,由WakoPureChemicalIndustriesLtd.生產),洗脫液A:1%甲酸水溶液,洗脫液B:甲醇,梯度:線性梯度,其中溶液B的百分比為20%→67%,71.1分鐘,流速:1.3ml/min,檢測:在260nm的吸光度。在這種分析型HPLC中使用保留時間作為指標,采集分離型HPLC洗脫級分,然后減壓蒸餾出溶劑。使殘余物再進行分離型HPLC,然后按照與上述相同的方式進行純化。將生成物進一步進行使用TSKgelTOYOPERLHW-40F(TosohCorporation)的柱色譜,然后按照與上述相同的方式進行純化。減壓蒸餾出溶劑,然后干燥殘余物,得到期望化合物的純化產物。

具體得到的化合物及其物化特性如下。

SPF-3059-2

●外觀:奶油色粉末

●高分辨率高速電子轟擊質譜(HRFAB-MS)m/z(M+H)+:實際測量值:533.0710,計算值:533.0721

●分子式:C27H16O12

●紫外線-可見吸收光譜λmax(在甲醇中)nm(ε):209(40,600),236(42,600),283(28,500),323(25,400)

●紅外吸收光譜vmax(KBr)cm-1:3266,1678,1654,1623,1562,1471,1296

●1H-NMR(DMSO-d6)δppm:2.53(6H,s),6.93(1H,s),6.95(1H,s),7.47(1H,s),8.15(1H,s),8.54(1H,s),9.38(1H,brs),9.89(1H,brs),10.78(1H,brs),11.37(1H,brs),12.68(1H,brs)

●13C-NMR(DMSO-d6)δppm:29.1,32.1,102.3,103.1,108.7,112.5,113.5,119.6,119.8,120.9,126.2,132.4,133.6,136.1,141.7,144.5,150.71,150.74,152.49,152.54,152.7,154.4,167.4,172.9,173.4,199.2,201.2

基于上述數據,將化合物SPF-3059-2的結構式確定為下式(2)。

[式4]

SPF-3059-4

●外觀:奶油色粉末

●分子量:560

●分子式:C28H16O13

●高速電子轟擊質譜(FAB-MS)m/z(正):561(M+H)+

●高速電子轟擊質譜(FAB-MS)m/z(負):559(M-H)-

●高分辨率高速電子轟擊質譜(HRFAB-MS)m/z(M+H)+:實際測量值:561.0667,計算值:561.0670(C28H17O13)

●紫外線-可見吸收光譜λmax(在甲醇中)nm(ε):221(35,600),250(38,100),276sh(25,800),323(24,300)

●紅外吸收光譜vmax(KBr)cm-1:3412,1665,1619,1563,1465,1427,1263

●1H-NMR(DMSO-d6)δppm:2.53(3H,s),2.56(3H,s),6.84(1H,d,2.1),6.95(1H,s),6.96(1H,d,2.1),8.17(1H,s),8.52(1H,s),10.10-11.40(3H,brs),12.71(1H,brs),13.26(1H,brs)

●13C-NMR(DMSO-d6)δppm:29.2,32.1,102.3,103.2,110.1,112.4,112.8,119.6,120.3,120.8,126.3,133.1,133.4,136.7,137.5,141.7,150.8,152.3,152.7,152.8,157.2,163.9,167.4,69.3,172.2,172.9,199.3,201.0

●溶解度:不溶于水和己烷,可溶于甲醇和DMSO

基于上述數據,將化合物SPF-3059-4的結構式確定為下式(3)。

[式5]

SPF-3059-5(vinaxanthone)

●外觀:奶油色粉末

●高分辨率高速電子轟擊質譜(HRFAB-MS)m/z(M+H)+:實際測量值:577.0615,計算值:577.0619

●分子式:C28H16O14

●紫外線-可見吸收光譜λmax(在甲醇中)nm(ε):229(35,800),284(22,600),322(21,000)

●紅外吸收光譜vmax(KBr)cm-1:3260,1684,1626,1567,1467,1288

●1H-NMR(DMSO-d6)δppm:2.53(3H,s),2.55(3H,s),6.93(1H,s),6.96(1H,s),8.17(1H,s),8.53(1H,s),9.5-13.0(6H)

●13C-NMR(DMSO-d6)δppm:29.1,32.1,102.26,102.32,109.9,112.4,119.6,119.8,120.3,120.9,126.3,132.5,133.4,136.2,141.2,141.7,150.4,150.8,152.1,152.68,152.73,154.5,167.4,167.5,172.5,172.9,199.1,201.1

基于上述數據,將化合物SPF-3059-5(vinaxanthone)的結構式確定為下式(4)。

[式6]

SPF-3059-12

●外觀:奶油色粉末

●分子量:560

●分子式:C28H16O13

●高速電子轟擊質譜(FAB-MS)m/z(正):561(M+H)+

●高速電子轟擊質譜(FAB-MS)m/z(負):559(M-H)-

●高分辨率高速電子轟擊質譜(HRFAB-MS)m/z(M+H)+:實際測量值:561.0680,計算值:561.0670(C28H17O13)

●紫外線-可見吸收光譜λmax(在甲醇中)nm(ε):232(37,400),250sh(34,800),285(28,000),308sh(23,200),360sh(9,000)

●紅外吸收光譜vmax(KBr)cm-1:3080,1698,1608,1468,1291

●1H-NMR(DMSO-d6)δppm:2.54(3H,s),2.55(3H,s),6.82(1H,d,2.1),6.87(1H,s),6.95(1H,d,2.1),8.22(1H,s),8.55(1H,s),9.50-13.50(5H,brs)

●13C-NMR(DMSO-d6)δppm:29.1,32.2,102.1,103.0,109.4,112.1,113.5,119.8,120.0,121.7,126.6,132.0,133.3,135.9,136.7,141.7,150.6,152.1,153.0,155.4,157.6,162.4,167.4,167.6,172.2,172.9,199.1,201.1

●溶解度:不溶于水和己烷,可溶于甲醇和DMSO

基于上述數據,將化合物SPF-3059-12的結構式確定為下式(5)。

[式7]

SPF-3059-24

●外觀:奶油色粉末

●分子量:532

●分子式:C27H16O12

●高速電子轟擊質譜(FAB-MS)m/z(正):533(M+H)+

●高速電子轟擊質譜(FAB-MS)m/z(負):531(M-H)-

●高分辨率高速電子轟擊質譜(HRFAB-MS)m/z(M+H)+:實際測量值:531.0621,計算值:531.0564(C27H17O12)

●紫外線-可見吸收光譜λmax(在甲醇中)nm(ε):212(36,900),229sh(34,500),283(26,300),323(21,700)

●紅外吸收光譜vmax(KBr)cm-1:3447,1697,1629,1578,1470,1290

●1H-NMR(DMSO-d6)δppm:2.52(3H,s),2.54(3H,s),6.92(1H,s),6.93(1H,s),7.28(1H,s),8.13(1H,s),8.54(1H,s),9.50-13.00(5H,brs)

●13C-NMR(DMSO-d6)δppm:29.1,32.3,102.3,102.9,107.9,110.0,115.8,119.8,120.4,120.7,126.5,133.0,133.3,136.0,141.2,145.0,150.4,151.1,152.2,152.9,153.0,154.3,167,172.6,173.6,199.1,201.1

●溶解度:不溶于水和己烷,可溶于甲醇和DMSO

基于上述數據,將化合物SPF-3059-24的結構式確定為下式(6)。

[式8]

SPF-3059-25

●外觀:奶油色粉末

●分子式:C27H16On

●高速電子轟擊質譜(FAB-MS)m/z(正):517(M+H)+

●高速電子轟擊質譜(FAB-MS)m/z(負):515(M-H)-

●高分辯率高速電子轟擊質譜(HRFAB-MS)m/z(M+H)+:實際測量值:517.0778,計算值:517.0771(C27H17O11)

●紫外線-可見吸收光譜λmax(在甲醇中)nm(ε):215(35,000),253(35,100),276sh(25,200),323(23,400)

●紅外吸收光譜vmax(KBr)cm-1:3417,1691,1625,1471,1293

●1H-NMR(DMSO-d6)δppm:2.54(6H,s),6.82(1H,brs),6.92(2H,brs),7.27(1H,s),8.14(1H,s),8.53(1H,s),9.5~14.0(4H,brs)

●13C-NMR(DMSO-d6)δppm:29.2,32.3,102.9,103.0,107.8,109.9,113.0,115.7,120.4,120.6,126.4,133.3,133.4,136.4(2c),145.0,151.2,152.3,152.98,153.01,157.3,164.2,169.4,172.6,173.6,199.2,201.0

●溶解度:不溶于水和己烷,可溶于甲醇和DMSO

基于上述數據,將化合物SPF-3059-25的結構式確定為下式(7)。

[式9]

SPF-3059-26

●外觀:奶油色粉末

●分子量:488

●分子式:C26H16O10

●高速電子轟擊質譜(FAB-MS)m/z(正):489(M+H)+

●高速電子轟擊質譜(FAB-MS)m/z(負):487(M-H)-

●高分辨率高速電子轟擊質譜(HRFAB-MS)m/z(M+H)+:實際測量值:489.0823,計算值:489.0822(C26H17O10)

●紫外線-可見吸收光譜λmax(在甲醇中)nm(ε):212(31,500),235(30,900),284(23,900),324(19,500)

●紅外吸收光譜vmax(KBr)cm-1:3454,1694,1625,1517,1471,1293

●1H-NMR(DMSO-d6)δppm:2.53(3H,s),2.54(3H,s),6.91(1H,s),6.92(1H,s),7.27(1H,s),7.47(1H,s),8.11(1H,s),8.57(1H,s)

●13C-NMR(DMSO-d6)δppm:29.1,32.2,102.9,103.0,107.9,108.5,113.3,115.7,119.8,120.7,126.3,132.7,133.5,135.8,144.6,145.0,150.8,151.1,152.5,152.9(2c),154.7,173.3,173.6,199.1,201.2

●溶解度:不溶于水和己烷,可溶于甲醇和DMSO

基于上述數據,將化合物SPF-3059-26的結構式確定為下式(8)。

[式10]

實施例4

化合物對Sema3A的分解活性的抑制活性

給聚賴氨酸-包被的96-孔培養板(SumitomoBakeliteCo.,Ltd.)進一步包被層粘連蛋白(20μg/ml層粘連蛋白,室溫,1小時)。然后將100μl培養基(包含10%胎牛血清、20ng/mlNGF、100單位/ml青霉素和100μg/ml鏈霉素的F12培養基)加入到各孔中。此后,將從7日齡雞胚胎中切下的背根神經節接種入得到的孔,然后在由16-20小時、5%CO2和37℃組成的條件下培養得到的混合物。此后,將上述實施例3中所述的化合物各自以不同濃度加入到得到的培養物中,然后將得到的化合物培養1小時。此后,將2個單位/ml小鼠腦信號蛋白3A(Sema3A)加入到培養物中,將得到的混合物再培養1小時。啟動培養后1小時,向培養物中加入戊二醛,使得它迅速地達到1%的終濃度。然后將得到的混合物在室溫靜置15分鐘,以固定組織切片。此后,在顯微鏡下確定收縮的生長錐的百分比。未加入Sema3A的孔用作對照組。將陰性對照組(既未加入化合物、也未加入Sema3A)中生長錐收縮的百分比定義為(A)%;將陽性對照組(未加入化合物,但加入了Sema3A)中生長錐收縮的百分比定義為(B)%;將試驗組(既加入了化合物,又加入了Sema3A)中生長錐收縮的百分比定義為(C)%。將保持式C=(A+B)/2的每種化合物的濃度定義為IC50值。結果如下。從得到的結果中發現,實施例3的化合物各自強烈地抑制腦信號蛋白3A。

[表1]

化合物 IC50(μg/ml) SPF-3059-2 <0.1 SPF-3059-4 2.0 SPF-3059-5 0.075 SPF-3059-12 2.0 SPF-3059-24 0.1 SPF-3059-25 4.0 SPF-3059-26 0.2

實施例5

呫噸酮化合物在抑制腦信號蛋白3A的神經突伸長抑制活性中的作用

將表達Sema3A的COS7細胞團和7-或8-日齡雞胚胎背根神經節進行膠原蛋白凝膠共培養(Neuroprotocols4,116,1994),檢查實施例3的化合物各自是否顯示連續抑制Sema3A的作用。通過下列方法生產表達Sema3A的COS7細胞團。即,使用FuGENE6轉染試劑(Roche),將1μg表達Sema3A的質粒導入已經培養過夜的COS7細胞(100,000細胞/35mm培養皿)。在啟動轉染后2.5小時,使用胰蛋白酶從培養皿中除去COS7細胞,然后通過離心采集它們。將采集的細胞再次混懸于200μl培養基。此后,將20μl細胞混懸液加入到培養皿的頂部(內側),然后將頂部倒置,隨后進行培養20小時(懸滴培養)(Cell,78,425,1994)。培養完成后,用培養基重新覆蓋凝固的COS7細胞(團),然后修整至0.5mm直徑大小。將這種表達Sema3A的COS7細胞團和上述背根神經節放入彼此之間有0.5-1mm距離的0.2%膠原蛋白凝膠,然后在37℃在5%CO2中將該膠原蛋白凝膠在包含上述舉出的各自不同濃度的化合物的培養基中培養2天。隨后向培養物中加入戊二醛,使得它迅速地達到1%的終濃度。然后將得到的混合物在室溫靜置1小時,以固定組織切片。此后,在顯微鏡下確定神經突伸長。

在上述膠原蛋白凝膠中,Sema3A從導入表達Sema3A的質粒的COS7細胞團中分泌,形成濃度梯度(其中越接近COS7細胞團,則濃度越高)。當使用不含測試化合物的培養基時,神經突可能無法在一定方向上伸長,其中存在COS7細胞團,由此Sema3A濃度高,僅在相對的方向上伸長。當將實施例3的化合物各自加入到培養基中時,觀察到神經突在一個方向上伸長,其中存在表達Sema3A的COS7細胞團。

相對于使用未表達Sema3A的COS7細胞的情況,其中神經突以完全共中心的形式伸長的情況用符號+++表示(強Sema3A抑制作用)。其中以近似共中心的形式伸長、但其伸長至表達Sema3A的COS7細胞側面得到輕度抑制的情況用符號++表示。其中神經突以半發光形式伸長至表達Sema3A的COS7細胞側面的情況,神經突得到相當大抑制用符號+表示。其中不存在神經突伸長至表達的Sema3A的COS7細胞側面的情況用-表示(無Sema3A抑制作用)。測定結果如下所示。

[表2]

(NT=未測試:未評價)

實施例6

制劑實施例1

將如下組合物混懸于100ml滅菌純化水,然后用與淚液等滲的濃度將該混懸液調整至pH7.0,以制備眼用制劑。

實施例7

制劑實施例2

將如下組合物混懸于100ml滅菌純化水,然后用與淚液等滲的濃度將該混懸液調整至pH7.0,以制備眼用制劑。

實施例8

制劑實施例3

根據用于生產眼用軟膏劑的常用方法,可以用如下配方制備眼用軟膏劑。

SPF-3059-550mg

液體石蠟10g

白凡士林適量

實施例9

制劑實施例4

根據用于生產眼用軟膏劑的常用方法,可以用如下配方制備眼用軟膏劑。

SPF-3059-550mg

液體石蠟10g

白凡士林適量

實施例10

呫噸酮化合物在PBS(磷酸鹽緩沖液)中的穩定性

將式(1)中包括的呫噸酮化合物的SPF-3059-2、SPF-3059-5、SPF-3059-24和SPF-3059-26和不包括在式(1)中的呫噸酮化合物的SPF-3059-1、SPF-3059-3、SPF-3059-9和SPF-3059-30各自溶于PBS(Dulbecco的PBS(-),磷酸濃度:10mM)至濃度為100μg/ml。(化合物SPF-3059-1、SPF-3059-3、SPF-3059-9和SPF-3059-30的結構式、生產方法和物化特性描述在國際公開號WO02/09756(上述舉出的專利文獻1)中)。將得到的溶液各自貯存在37℃下。4周后,通過HPLC對每種化合物的剩余量進行定量,然后得到剩余百分比,以便評估呫噸酮化合物在37℃下在PBS中的穩定性。HPLC條件如下。柱:Wakopak-Wakosil(注冊商標)-II5C18RS(4.6mm直徑×150mm,由WakoPureChemicalIndustriesLtd.生產),洗脫液A:1%甲酸水溶液,洗脫液B:甲醇,梯度:線性梯度,其中溶液B的百分比為30%→70%,60分鐘,流速:1.0ml/min,檢測:在260nm的吸光度。

通過評估呫噸酮化合物在PBS中的穩定性得到的結果如圖7中所示。從圖7中所示的結果中發現,式(1)中包括的所有4種類型的呫噸酮化合物顯示剩余百分比為90%或以上。另一方面,不包括在式(1)中的所有4種類型的呫噸酮化合物的幾乎其全部量都分解。

實施例11

vinaxanthone在PBS(磷酸鹽緩沖液)中的穩定性

將Vinaxanthone(SPF-3059-5)和SPF-3059-1各自溶于PBS(Dulbecco的PBS(-))至100μg/ml濃度。將得到的溶液貯存在37℃,在從保存開始到開始保存后4周時的每個時間點通過HPLC對溶液中剩余的活性劑量進行定量,以便檢查剩余百分比隨時間的改變。應用與實施例10相同的HPLC條件。

評估vinaxanthone(SPF-3059-5)和SPF-3059-1在PBS中的穩定性,結果如圖8中所示。從圖8中所示的結果中發現,屬于式(1)中包括的呫噸酮化合物的vinaxanthone(SPF-3059-5)在37℃在PBS中保留的剩余百分比為96%或以上,直到開始保存后4周為止,因此該化合物穩定4周或以上。另一方面,SPF-3059-1其總量在約1周時幾乎完全分解。

實施例12

有關本發明化合物在淚液和角膜中的含量改變的分析

為了治療角膜神經損傷,最優選施用活性劑的滴眼液。因此,重要的是分析在施用活性劑的滴眼液后活性劑在淚液和/或角膜中含量的改變。例如,可以根據如下試驗方法對活性劑含量的改變進行分析。

[試驗方法]

分析本發明式(1)表示的化合物(例如SPF-3059-5;下文縮寫為本發明的化合物)和靶子化合物(不包括在式(1)中的化合物,例如上述舉出的SPF-3059-1)的含量改變。即將化合物各自溶于PBS至0.1mg/mL-1mg/mL的濃度。將10μL本發明化合物的溶液、靶子化合物的溶液或單獨的PBS通過施用滴眼液各自施用于每只大鼠的1只眼。施用后30分鐘、2小時和10小時,用移液管采集1μL-10μL淚液,然后對大鼠實施安樂死。從每只大鼠中切下眼球,然后采集角膜。

通過LC-MS測定淚液和/或角膜中每種化合物的含量。將0.1MHCl加入到樣品中,此后,就淚液的情況攪拌得到的混合物或就角膜的情況勻化得到的混合物。此后。將乙酸乙酯加入到生成物中,然后將得到的混合物充分攪拌以離心。然后采集上層。向下層中再加入乙酸乙酯,將上述操作對得到的混合物反復進行。采集來自3次操作的上層,然后將通過用氮氣干燥采集的層得到的樣品用于LC-MS測定。

工業實用性

本發明具有腦信號蛋白3A抑制活性的呫噸酮化合物有效地作為用于因角膜病或角膜手術導致的感覺神經病的治療劑或預防劑。特別地,本發明的呫噸酮化合物可以有效地作為因角膜病受損的角膜感覺神經導致的感覺神經病的治療劑或預防劑,所述的角膜病例如角膜炎、角膜白斑、角膜感染、角膜變性、角膜營養不良、角膜基質營養不良、大泡性角膜病變、圓錐角膜、角膜代償失調、角膜潰瘍、神經麻痹性角膜病變、糖尿病性角膜病變、角膜化學燒傷或角膜熱燒傷;或有效地作為因角膜手術受損的角膜感覺神經導致的感覺神經病的治療劑或預防劑,所述的角膜手術例如角膜移植術、近視矯正術和角膜手術,所述的角膜手術靶向要求治療眼病或角膜損傷的角膜。此外,本發明具有腦信號蛋白3A抑制活性的呫噸酮化合物還可以有效地用作用于角膜感覺神經再生的促進劑。

此外,用于本發明的呫噸酮化合物在水溶液中例如在磷酸鹽緩沖液中在化學上極為穩定。因此,當以滴眼液形式施用本發明的呫噸酮化合物時,它在淚液或角膜中穩定。因此,本發明的呫噸酮化合物極為優選地作為用于因角膜病或角膜手術導致的感覺神經病的治療劑或預防劑并且還可以作為用于使角膜感覺神經再生的促進劑。

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本文標題:用于角膜感覺神經損傷的包含腦信號蛋白抑制劑作為活性成分的治療劑.pdf
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