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用于活化和綴合生物分子的方法.pdf

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用于 活化 生物 分子 方法
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摘要
申請專利號:

CN201180020149.0

申請日:

20110221

公開號:

CN102970988A

公開日:

20130313

當前法律狀態:

有效性:

有效

法律詳情:
IPC分類號: A61K31/00 主分類號: A61K31/00
申請人: 拜耳醫藥保健有限公司
發明人: J.H.沃格爾,杜志崇,C.L.比安科
地址: 美國紐約州
優先權: 61/306,513
專利代理機構: 北京市柳沈律師事務所 代理人: 張文輝
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法律狀態
申請(專利)號:

CN201180020149.0

授權公告號:

法律狀態公告日:

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摘要

本發明涉及用于生成生物分子綴合物的方法,其中將該方法整合入單一單元操作中。

權利要求書

1.一種用于生成生物分子綴合物的方法,包括下列步驟:通過與活化劑接觸活化生物分子;除去所述活化劑;和通過將所述生物分子與活化的聚合物起反應綴合所述生物分子;其中將該方法的步驟整合入單一單元操作中。2.權利要求1的方法,其中所述單一單元操作是集成的切向流過濾系統。3.權利要求1的方法,進一步包括分開所述生物分子綴合物與未綴合的生物分子的步驟。4.權利要求3的方法,其中通過大小排阻層析或離子交換層析分開所述生物分子綴合物與未綴合的生物分子。5.權利要求1的方法,其中所述活化劑選自緩沖液更換、pH調節、或還原劑。6.權利要求5的方法,其中所述還原劑是二硫蘇糖醇或三2-羧乙基膦。7.權利要求1的方法,其中所述聚合物是聚乙二醇。8.權利要求1的方法,其中所述生物分子選自:蛋白質、多糖和核酸。9.權利要求8的方法,其中所述蛋白質選自凝固因子、抗體、激素、生長因子和酶。

說明書

發明領域

本發明涉及用于生成生物分子綴合物的方法,其中將該方法整合入單一單元操作(single?unit?operation)中。

發明背景

隨著生物技術的進展,已經開發出生物藥物來滿足未滿足的醫學需要。然而,其短的體內半衰期需要患者服用頻繁和/或大劑量的這些生物藥物來實現靶標治療或預防目的。長的靜脈內療法或頻繁的注射可以影響患者的生命質量。多種聚合物諸如聚乙二醇(PEG)可以與生物分子(例如,蛋白質)綴合以提高許多生物分子的半衰期和生物活性(Reddy,Ann.Pharmacother.34:915-923,2000)。聚合物綴合物的其它益處包括(a)在制造過程期間改善的產品穩定性;(b)降低的腎清除(Fung等,Polym.Prepr.38:565-566,1997);改善的腫瘤靶向(Yowell等,Cancer?Treat.Rev.28Suppl.A:3-6,2002);降低的抗原性和免疫原性(Muller等,Br.J.Haematol.110:379-384,2000;Abshire等,Blood96:1709-1715,2000);和更大的可耐受性(Safra等,Ann.Oncol.11:1029-1033,2000;Judson等,Eur.J.Cancer?37:870-877,2001)。PEG化已經應用于人生長因子(Kim等,Biomaterials?23:2311-2317,2002;Wu等,Protein?Expr.Purif.48:24-27,2006)、生長激素釋放因子(Piquet等,J.Chromatogr.944:141-148,2002)、腺病毒載體(Eto等,Int.J.Pharm.354:3-8,2008)和質粒DNA(Hosseinkhani等,J.Control?Release,97:157-171,2004)。由于PEG化的益處,已經開發出許多綴合反應化學(Roberts等.,Adv.Drug?Deliv.Rev.54:459-476,2002)和聚合物衍生物(歐洲專利No.1578841)。隨著生物分子-聚合物綴合物的應用增加,有必要開發簡單的、可再現的、且可縮放的(scalable)單元操作來滿足制造需要。

發明概述

本發明涉及一種用于生成生物分子綴合物的方法,包括下列步驟:通過與活化劑接觸活化生物分子;除去所述活化劑;并通過將所述生物分子與活化的聚合物起反應綴合所述生物分子;其中將該方法的步驟整合入單一單元操作中。該方法可以進一步包括分開所述生物分子綴合物與未綴合的生物分子的步驟。在一個實施方案中,通過大小排阻層析或離子交換層析分開所述生物分子綴合物與未綴合的生物分子。

在一個實施方案中,單一單元操作是集成的切向流過濾系統。在另一個實施方案中,活化劑選自緩沖液更換、pH調節、或還原劑。在又一個實施方案中,還原劑是二硫蘇糖醇或三2-羧乙基膦(tris?2-carboxyethyl?phosphine)。在其它實施方案中,聚合物是聚乙二醇,且生物分子選自:蛋白質、多糖和核酸。在又一個實施方案中,所述蛋白質選自凝固因子、抗體、激素、生長因子和酶。

附圖簡述

圖1:PEG化對照運行的陽離子交換層析洗脫譜(profile)。

圖2:來自PEG化對照運行的陽離子交換層析洗脫峰的SDS-PAGE。

圖3:來自PEG化對照的陽離子交換層析洗脫峰的大小排阻層析。

圖4:以TFF模式實施的PEG化的陽離子交換層析洗脫譜。

圖5:實驗室規模TFF運行的陽離子交換層析洗脫譜。

圖6:由實驗室規模TFF運行生成的PEG化rFVIII的SEC譜。

圖7:試驗(pilot)規模TFF運行的陽離子交換層析洗脫譜。

發明詳述

應當理解,本發明不限于所描述的具體裝置或部分,并且因此可以有所變化。還應當理解,本文中所使用的術語僅為了描述具體的實施方案,而并不意圖限制本發明的范圍,其僅由所附權利要求書限制。

必須注意到,如本文中和所附權利要求書中所使用的,單數形式“一個”、“一種”和“該/所述”包括復數提及物,除非上下文另有明確規定。如此,例如,提及“藥劑”指提及一種或多種藥劑(agent),并且包括本領域技術人員已知的其等同物,等等。除非另有定義,本文中所使用的所有技術和科學術語與本發明所屬領域普通技術人員的通常理解具有相同的意義。

生物分子的綴合,諸如PEG化可以是隨機綴合或位點特異性綴合物。在這兩種情況中,通常活化生物分子以容許聚合物,諸如PEG的有效偶聯。在隨機PEG化中,PEG可以與隨機活化的氨基酸殘基共價綴合。它通常導致單-PEG化的和多-PEG化的生物分子的混合物。對于位點特異性PEG化,生物分子可以遺傳修飾為使得PEG分子可以與生物分子的表面上的特定位點綴合。此方法使副產物形成最小化,并且減輕分開產物與副產物的隨后的純化步驟的負擔。

可以通過調節溶液的pH或者通過使用還原劑諸如二硫蘇糖醇(DTT)或三2-羧乙基膦(TCEP)活化生物分子上溶劑暴露的殘基。還原后,可以經由共價連接將PEG分子附接于活化的殘基。若使用還原劑,則可能有必要在綴合反應前除去還原劑。大小排阻層析(SEC)是一種用于實驗室規模還原劑除去的常見技術。

有效的現有技術生物分子綴合一般要求多單元操作,例如,

-經由與還原劑一起溫育/受控混合活化,其通常在混合式容器諸如攪拌式活化罐中實施;

-除去活化劑,其通常通過大小排阻層析或其它層析法進行;

-經由與活化的聚合物(諸如PEG)一起溫育/受控混合來綴合,其通常在攪拌式綴合罐中實施;并

-通過層析諸如離子交換層析分開綴合的生物分子與未反應的分子和副產物。

此類方法需要多個系統和(在商業規模上)相當大的空間和單元操作間手工處理/轉移。另外,SEC難以在商業規模制造中執行,并且要求設置為獨立單元操作。

本發明的方法通過利用集成切向流過濾來接觸/混合及隨后除去反應物將活化、除去活化劑、和綴合步驟整合入一個單一單元操作中。雖然通過利用合適的分子量截留膜保留靶生物分子,但是可以在活化/綴合之前、期間、或之后改變物理化學條件諸如濃度、pH、電導率、和緩沖液種類。系統中水動力學的調節容許調節最佳的濃度,及任選地實現膜表面上局部更高的接觸濃度以進一步優化活化和綴合過程。此方法是操作簡單的、可再現的、可縮放的、且可用于商業規模藥物生產。

可以在本發明的方法中使用的聚合物的例子包括但不限于聚烷撐氧(polyalkylene?oxide)諸如聚乙二醇、右旋糖苷、多聚乙酰神經氨酸、或其它基于碳水化合物的聚合物、氨基酸的聚合物、生物素衍生物、聚乙烯醇(PVA)、聚羧酸酯、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙烯-馬來酸酸酐共聚物、聚苯乙烯-蘋果酸酸酐共聚物、聚噁唑啉、聚丙烯酰嗎啉、肝素、清蛋白、纖維素、殼聚糖的水解產物、糖原、瓊脂糖及其衍生物、瓜爾膠、普魯分支葡聚糖(pullulan)、菊粉、黃原膠(xanthan?gum)、角叉藻聚糖(carrageenan)、果膠、褐藻酸水解產物及其任何等同物。聚乙二醇的例子是甲氧基聚乙二醇(mPEG)。其它有用的聚烷撐二醇化合物是聚丙二醇(PPG)、聚丁二醇(PBG)、PEG-縮水甘油基醚(Epox-PEG)、PEG-氧羰基咪唑(COl-PEG)、分支的聚乙二醇、線性聚乙二醇、叉狀的聚乙二醇和多臂的或超分支的聚乙二醇(星-PEG)。

聚乙二醇(PEG)包括任何水溶性聚(環氧乙烷)。通常,PEG包含下列結構“--(OCH2CH2)--”,其中(n)是2至4000。如本文中所使用的,PEG還包括“--CH2CH2--O(CH2CH2O)-CH2CH2--”和(OCH2CH2)O--”,這取決于末端氧是否已經被置換。

聚乙二醇還包括具有各種末端或末端加帽基團,諸如但不限于羥基或C120烷氧基基團的結構。聚乙二醇還意指含有大部分,也就是說,大于50%的--OCH2CH2--重復亞單元的聚合物。就特定形式而言,PEG可以采用眾多分子量,以及構建或幾何學諸如分支的、線性的、叉狀的、和多功能的。

生物分子的例子包括例如任何蛋白質、多糖或核酸。蛋白質包括但不限于凝固因子、抗體、激素、生長因子和酶。

本文中所描述的方法和材料意圖是本發明的代表性例子,并且應當理解,本發明的范圍不限于例子的范圍。本領域技術人員會認可,本發明可以用公開的方法和材料的變型實施,并且認為此類變型在本發明的范圍內。

實施例

為了使本發明可以得到更好的理解,列出以下實施例。這些實施例僅為了例示目的,而不應以任何方式解釋為限制本發明的范圍。通過提及而完整收錄本文中提及的所有出版物。

實施例1:PEG化

在對照中,將三2-羧乙基膦(TCEP)儲備溶液注入7.2mL純化的rFVIII溶液(0.4μM)中。還原后,使用Superdex-75柱通過SEC除去rFVIII溶液中的TCEP。將固體PEG注入rFVIII溶液中至30μM的最終PEG濃度。將rFVIII于2-8°C與PEG一起溫育13小時。在PEG化溫育結束時,將該批次稀釋3倍,并加載到4mL陽離子交換層析柱上。將與柱結合的rFVIII分開并用梯度洗脫。

在另一次運行中,將695mL純化的rFVIII溶液(0.49μM)加載到裝備有50cm2?30kDa再生纖維素切向流過濾(TFF)膜的切向流設置的滲余物(retentate)容器中。首先通過將500mL滲透物(permeate)透過TFF膜將rFVIII溶液濃縮至1.78μM。濃縮后,將TCEP儲備溶液注入濃縮的rFVIII溶液中。還原溫育持續30分鐘。將滲余物橫向流速維持于4L/分鐘/m2,而以0.7L/分鐘/m2將滲透物再循環回滲余物容器。在還原后,通過針對5個體積的PEG化緩沖液滲濾除去滲余物中的TCEP。在滲濾過程中,在每個滲濾(diafilter)體積后采集滲余物和滲透物樣品以分析TCEP濃度。在TCEP除去滲濾結束時,將固體PEG注入滲余物容器中以實現39μM的最終PEG濃度。將rFVIII與PEG一起溫育約2小時。在溫育期間,通過以4L/分鐘/m2將滲余物再循環通過TFF系統提供混合。在PEG化溫育結束時,將滲余物收獲,并稀釋4倍。將稀釋的滲余物的部分加載到5mL陽離子交換層析柱中。通過梯度洗脫將與柱結合的rFVIII分離并洗脫。

通過SDS-PAGE和分析用HPLC-SEC分析自梯度洗脫獲得的級分,而通過分析用HPLC測定法對滲余物和滲透物樣品分析TCEP。

圖1中顯示了對照實驗的陽離子交換層析洗脫譜。它由三個洗脫峰組成,其中峰1、2和3分別于49.5%、58%和63.7%的緩沖液B洗脫。

使用SDS-PAGE來表征洗脫峰。因為碘化鋇染料與聚乙二醇形成復合物,所以首先用碘化鋇對SDS-PAGE凝膠染色以確認聚乙二醇與rFVIII的綴合。在采集圖像后,將凝膠脫色,然后用考馬斯藍再染色。圖2中顯示的用考馬斯藍染色的SDS-PAGE指示PEG化前的rFVIII含有重鏈(HC)和輕鏈(LC),其具有82kDa-116kDa的分子質量。在PEG化后,峰1中rFVIII中的輕鏈增加至高于182kDa。分子質量的增加是由于在PEG化期間聚乙二醇與輕鏈的綴合,其通過碘化鋇染料確認。峰2含有沒有PEG化的多種蛋白質種類。峰3中收集的種類含有重鏈和非PEG化的輕鏈。

還通過SEC分析來自每個洗脫峰的樣品。圖3顯示了峰1(PEG化的rFVIII)、峰2和峰3(非PEG化的rFVIII)的分析用SEC保留時間分別是16.6分鐘、17.8分鐘和19.4分鐘。因為非PEG化的rFVIII的保留時間比PEG化的rFVIII的保留時間長2.8分鐘,所以可以使用分析用SEC作為正交方法以確認PEG與rFVIII分子的綴合。

PEG化過程中的額外步驟是在綴合步驟前除去還原劑。表1顯示了TFF模式PEG化中收集的滲余物和滲透物在每個滲濾體積結束時具有相似的TCEP濃度。滲余物和滲透物兩者中的TCEP在4個滲濾體積后降低至低于測定檢測限度。這指示滲濾有效除去還原劑。

表1

??滲濾體積 ??滲余物TCEP(μM) ??滲透物TCEP(μM) ??1 ??241.3 ??326.0 ??2 ??147.0 ??181.6 ??3 ??54.0 ??69.2 ??4 ??0 ??0 ??5 ??0 ??0

圖4中顯示了自TFF模式PEG化回收的材料的陽離子交換層析洗脫譜。與圖1類似,它也由三個洗脫峰組成,其中峰1、2和3分別于48.3%、56.1%和62.8%的緩沖液B洗脫。與峰3的18.5分鐘相比,峰1的分析用HPLC-SEC保留時間是15.6分鐘。這兩個陽離子交換層析洗脫峰間保留時間的差異(2.9分鐘)與對照臂的差異一致。這表明TFF模式PEG化方法可以將牽涉生物分子-聚合物綴合物的步驟整合入單一TFF步驟中。

實施例2:一致性研究

實施多次實驗室規模運行以評估TFF模式PEG化方法的一致性。將體積700-900mL純化的rFVIII溶液加載入裝備有50-100cm2?30kDa再生纖維素膜(Millipore?Corporation,Billerica,MA)的UnifluxTM?TFF系統(GE?Healthcare,Piscataway,NJ)中。將rFVIII溶液濃縮至目標濃度。將TCEP注入滲余物容器中以實現有效濃度250-450μM,并溫育30分鐘。還原后,通過滲濾除去系統中的TCEP。將PEG注入還原的rFVIII以實現有效濃度13-26μM,并溫育10-15分鐘。在濃縮和滲濾期間采用的滲余物橫向流速和滲透物流速分別是6-15L/分鐘/m2和0.5-2L/分鐘/m2。在PEG化后,將滲余物自TFF系統回收,稀釋,并加載到56mL陽離子交換層析柱中。通過梯度將與柱結合的rFVIII分離并洗脫。通過分析用SEC-HPLC測定蛋白質濃度。通過生色測定法測定樣品的效力。

表中呈現了用于實驗室規模運行的膜面積。用于TFF運行的rFVIII溶液的初始濃度范圍為35μg/mL至55μg/mL。隨后,在還原和PEG化前將溶液濃縮直至10倍。

表2

? ?運行1 ??運行2 ??運行3 ??運行4 ??TFF膜面積(cm2) ??50 ??50 ??100 ??100 ??初始rFVIII濃度(μg/mL) ??53.6 ??35.1 ??56.0 ??54.5 ??還原rFVIII濃度(μg/mL) ??152 ??353 ??183 ??140 ??PEG化的rFVIII(%) ??59% ??72% ??64% ??48%

圖5中呈現了實驗室規模TFF運行的陽離子交換層析洗脫譜。這些譜與圖4中顯示的譜相似,其含有PEG化的rFVIII、非PEG化的rFVIII和其它rFVIII相關種類。

圖6中顯示的分析用HPLC-SEC洗脫譜指示PEG化的rFVIII是單-PEG化的。表3中匯總的HPLC-SEC保留時間顯示了PEG化的rFVIII比非PEG化的rFVIII早洗脫2.5-2.6分鐘。這與實施例1中觀察到的一致。

表3

使用過程中間體的效力計算TFF運行的PEG化效率。其范圍為48-72%(表),這與其它蛋白質的PEG化相當(Brocchini等,Adv.Drug?Deliv.Rev.60:3-12,2008;Schiavon等,Farmoco?55:264-269,2000;Lee等,Bioconjug.Chem.18:1728-1734;2007)。此實施例表明TFF模式的PEG化是可再現的,PEG化效率與文獻中報告的那些效率相當。

實施例3:試驗規模TFF模式PEG化

實施試驗規模TFF模式PEG化運行以表明方法的可縮放性。在這些運行中,將約25L?rFVIII溶液轉移入裝備有0.5m230kDa再生纖維素膜的TFF滑道(skid)中。將rFVIII溶液濃縮,并通過具有有效濃度600μM的TCEP還原。在還原后,通過針對PEG化緩沖液的滲濾除去TCEP。將PEG注入還原的rFVIII以實現有效濃度40μM。在濃縮和滲濾期間采用的橫向流速和滲透物流速分別是7L/分鐘/m2和1L/分鐘/m2。在PEG化溫育結束時,將滲余物收獲,稀釋,并加載到4L陽離子交換層析柱中。通過梯度將與柱結合的蛋白質分離并洗脫。

通過分析用HPLC-SEC分析PEG化的rFVIII,而基于通過生色測定法測定的效力計算PEG化效率。

圖7中顯示了試驗規模TFF模式PEG化的陽離子交換層析洗脫譜。與在先前實施例中顯示的相似,洗脫譜含有PEG化的rFVIII峰和其它rFVIII相關種類。用合適的梯度通過陽離子交換層析將PEG化的rFVIII與其它種類分開。

表4中匯總了PEG化的和非PEG化的rFVIII的保留時間。這兩種rFVIII種類間的保留時間差異是3分鐘。PEG化效率范圍為40-55%。這也與先前實施例中顯示的一致。此實施例表明TFF模式PEG化是可縮放的且一致的。

表4

??實驗室規模批No. ??rFVIII保留時間(分鐘) ?PEG化的rFVIII保留時間(分鐘) ??1 ??18.0 ??15.0 ??2 ??18.0 ??15.0 ??3 ??18.0 ??15.0

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