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一種中藥注射劑的質量安全性的分析方法及其藥物制劑.pdf

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一種 中藥 注射 質量 安全性 分析 方法 及其 藥物制劑
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摘要
申請專利號:

CN201410045077.0

申請日:

20140207

公開號:

CN103751809A

公開日:

20140430

當前法律狀態:

有效性:

失效

法律詳情:
IPC分類號: A61K49/00,A61K45/00,A61K31/352,A61P37/06,A61P37/04 主分類號: A61K49/00,A61K45/00,A61K31/352,A61P37/06,A61P37/04
申請人: 潘衛松
發明人: 潘衛松
地址: 510330 廣東省廣州市海珠區新港東路雅芝街3號1001室
優先權: 201310044412.0
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法律狀態
申請(專利)號:

CN201410045077.0

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法律狀態公告日:

法律狀態類型:

摘要

本發明屬于醫藥領域,特別是以中藥注射劑為研究對象,選擇清開靈注射液、穿琥寧注射液和參麥注射液為代表,通過向中藥注射劑中加入肥大細胞膜穩定劑等抗過敏藥物作抑制其引發各種免疫毒性反應發生,通過檢測其引發各型超敏反應及類過敏反應的能力,證實了該方法對中藥注射劑免疫安全性進行質量控制的可行性。本發明為控制中藥注射劑在臨床上應用的主要不良反應——免疫毒性提供了全新的解決方案。本發明建立了適用于中藥注射劑免疫安全性控制的檢測方法,以控制中藥注射劑臨床不良反應的發生;并研究其作用機制,為新版藥典對中藥注射劑免疫安全性控制的檢測方法提供了選擇和依據,也為制定我國新藥免疫安全性評價新的指導原則提供了參考。

權利要求書

1.一種中藥注射劑的質量安全性的分析方法,其特征在于采用小鼠耳廓藍染試驗鑒別。2.一種中藥注射劑的質量安全性的分析方法,其特征在于采用家貓降壓物質檢查試驗鑒別。3.一種中藥注射劑的質量安全性的分析方法,其特征在于采用大鼠被動皮膚過敏檢查試驗鑒別。4.一種中藥注射劑的質量安全性的分析方法,其特征在于采用大鼠被動皮膚過敏致敏后檢查血清中IgE及組胺含量的分析方法。5.一種中藥注射劑的質量安全性的分析方法,其特征在于采用豚鼠外加咪喹莫特佐劑進行主動全身皮膚過敏檢查試驗鑒別。6.根據權利要求1-5任一所述分析方法,其特征在于用色甘酸鈉作為制劑處方組成來抑制藥物誘發免疫亢進或免疫抑制等各型免疫毒性的效果。7.根據權利要求1-5任一所述分析方法,其特征在于用肥大細胞膜穩定劑作為制劑處方組成來抑制藥物誘發免疫亢進或免疫抑制等各型免疫毒性的效果。8.根據權利要求1-5任一所述分析方法,其特征在于用抗過敏藥物作為制劑處方組成來抑制藥物誘發免疫亢進或免疫抑制等各型免疫毒性的效果。9.一種藥物制劑,其特征在于含有色甘酸鈉作為制劑處方組成來抑制藥物誘發免疫亢進或免疫抑制等各型免疫毒性的效果。10.一種藥物制劑,其特征在于含有用抗過敏藥物或肥大細胞膜穩定劑作為制劑處方組成來抑制藥物誘發免疫亢進或免疫抑制等各型免疫毒性的效果。

說明書

技術領域

本發明涉及醫藥領域,特別是以中藥注射液為研究對象,選擇清開靈注射液、穿琥寧注射液和參麥注射液為代表,通過檢測其引發超敏反應類過敏反應的能力,建立適用于中藥注射劑免疫安全性控制的檢測方法,證實了在中藥注射劑的處方組成中外加肥大細胞膜穩定劑等抗過敏藥物可以控制中藥注射劑臨床免疫毒性類不良反應的發生;并研究了其作用機制,為下一版藥典對中藥注射劑免疫安全性控制的檢測方法提供選擇和依據,同時也為制定我國新藥免疫安全性評價新的指導原則提供參考。

背景技術

對藥物免疫安全性進行客觀系統評價的需求催生了免疫毒理學這一邊緣學科。免疫毒理學是研究化學性、物理性和生物性等外來因素對機體免疫系統的不良影響及其作用機理的學科。免疫毒理學的主要任務就是要從分子細胞到機體整體水平研究外來物與免疫系統的相互作用,鑒定這些外來物對機體的免疫毒性,并對外來物提供免疫安全性評價的方法和依據。對于新藥評價和保障藥物臨床安全應用上,免疫毒理學正發揮著越來越大的作用。

近來,醫療器械的生物學評價領域也在強調對醫療器械的進行免疫安全性評價的重要性。

中藥注射劑最為多見的不良反應主要表現為過敏性休克和過敏反應。過敏反應是機體免疫機能發生紊亂的極端反應,也是臨床上擴大其應用范圍的主要障礙。如何減少或控制中藥注射劑的過敏反應,是保證中藥注射劑臨床安全應用的當務之急,同時也是推動中藥現代化進程的重大課題。

現有研究認為中藥注射劑所引發的臨床不良反應也有可能是由于制劑中輔料或復雜成分所引發的類過敏反應所導致。由于中藥注射劑成分復雜,其致敏反應的物質基礎和病理生理機制難以完全闡明,所以難以判別究竟何種物質是療效的作用基礎,何種物質才是引發過敏反應或者類過敏反應的致害原,傳統的理化分析方法控制質量的方法難以確保中藥注射劑臨床應用的安全和有效。

因此,利用現代生物醫學科學研究的最新成果對中藥注射劑進行免疫毒性評價和免疫毒理學研究,通過免疫毒性評價的方法控制其生產質量,保障臨床安全應用,就成為了對中藥注射劑質量進行安全性控制的最佳解決方案。

2005年9月15日,ICHS8(step4)指導原則“人用藥物免疫毒性研究”被推薦采用,標志著20多年來關于免疫毒性問題的一系列國際活動(會議和指導原則制定)取得明顯的進展。ICH的一般原則包括在常規毒性研究中進行一套基本的毒性篩選參數測定,包括血液學、淋巴器官重量和淋巴器官組織病理學。若常規毒理學研究中發現異常,則進行附加研究和深入研究。推薦了免疫毒性追加研究試驗的方法。研究者需要自行選擇適當的模型、方法和方案進行免疫毒性的深入研究。提倡在功能性試驗的必要性上采用“case-by-case(個案處理)”的原則設計免疫毒性深入研究試驗方案,以便有足夠的靈活性來反映一種藥物對免疫系統的不同影響。

國內目前尚沒有全面的免疫毒性研究的指導原則。已經發布的“化學藥物刺激性、過敏性和溶血性研究技術指導原則”和“中藥、天然藥物免疫毒性(過敏性、光過敏反應)研究的技術指導原則”只包括超敏反應的評價,并且基本上參考國外的評價方法。但對于I型過敏反應采用ACA或者ASA和PCA等進行評價,而國外認為這些方法對評價I型過敏反應的作用不大。IV型超敏反應推薦采用GMPT法和Buehler試驗法,但也提倡在科學的原則上選擇其他方法。對光過敏作用及其評價方法進行了較詳細的討論,并且與光毒性作用進行了區別。光過敏評價與日本基本相同,推薦采用AdjuvantandStrip(佐劑和角質剝離)法、Harber法、Jordan法、Maurer法、Morikawa和Vinson法等。目前我國的免疫毒理學研究、對藥物的免疫安全性評價和技術管理水平與國際上都存在明顯得差距,其研究水平亟待加強。

中藥注射劑系指在中醫藥傳統理論的指導下,中藥材經提取、純化后制成的供注入人體的溶液、乳狀液及供臨用前配制成溶液的粉末或濃溶液的無菌制劑,為我國獨創。但是中藥注射劑也帶來了不少安全性問題,尤其是制劑所致的變態反應。清開靈注射液以清熱解毒,化痰通絡,醒神開竅為主要功效。臨床多用于熱病神昏,中風偏癱、發熱、上呼吸道感染、肺炎等癥,但由于其為復方制藥提取物中含有多種氨苯酸和蛋白質,會刺激機體產生相應抗體,極易發生過敏反應。如何減少或控制清開靈注射液的過敏反應,是保證清開靈注射液臨床安全應用的當務之急,同時也是推動中藥現代化進程的重大課題。

發明內容

本發明的一個目的在于提供一種處方組成成分以控制中藥注射劑臨床應用的免疫安全性,并通過一系列的對其引發各型超敏反應及類過敏反應能力的檢測建立了完整可行的中藥注射劑免疫安全性質量控制方法。

具體而言,本發明的中藥注射劑的質量安全性的分析方法,采用小鼠耳廓藍染試驗鑒別。

本發明的中藥注射劑的質量安全性的分析方法,采用家貓降壓物質檢查試驗鑒別。

本發明的中藥注射劑的質量安全性的分析方法,采用大鼠被動皮膚過敏檢查試驗鑒別。

本發明的中藥注射劑的質量安全性的分析方法,采用大鼠被動皮膚過敏致敏后檢查血清中IgE及組胺含量的分析方法。

本發明的中藥注射劑的質量安全性的分析方法,采用豚鼠外加咪喹莫特佐劑進行主動全身皮膚過敏檢查試驗鑒別。

上述分析方法,包括但并不限于這些分析方法,其特征在于用色甘酸鈉作為制劑處方組成來抑制藥物誘發免疫亢進或免疫抑制等各型免疫毒性的效果。

上述分析方法,包括但并不限于這些分析方法,其特征在于用肥大細胞膜穩定劑作為制劑處方組成來抑制藥物誘發免疫亢進或免疫抑制等各型免疫毒性的效果。

上述分析方法,包括但并不限于這些分析方法,其特征在于用抗過敏藥物作為制劑處方組成來抑制藥物誘發免疫亢進或免疫抑制等各型免疫毒性的效果。

本發明的一個目的在于提供一種藥物制劑,其中含有色甘酸鈉作為制劑處方組成來抑制藥物誘發免疫亢進或免疫抑制等各型免疫毒性的效果。

本發明的另一個目的在于提供一種藥物制劑,其中抗過敏藥物或肥大細胞膜穩定劑作為制劑處方組成來抑制藥物誘發免疫亢進或免疫抑制等各型免疫毒性的效果。

本發明的統和應用,可以推廣用于控制所有中藥注射劑的免疫安全性。提高中藥注射劑的使用安全性,減少臨床應用的不良反應能夠保證中藥注射劑生產企業穩定的擴大再生產,由此促進整個醫藥行業經濟產能的提高。目前全國僅中藥注射液有生產廠家數百家之多,年制劑產值約數十億元以上,本研究的完成可以保證該產業的健康發展。

附圖說明

圖1陰性對照的豚鼠皮膚反應圖示

圖2咪喹莫特作為佐劑攻擊1h后的陰性對照的豚鼠皮膚反應圖示

圖3咪喹莫特作為佐劑攻擊1h后的清開靈組的豚鼠皮膚反應圖示

圖4陽性對照組的豚鼠皮膚反應圖示

圖5咪喹莫特作為佐劑攻擊1h后的陽性對照組豚鼠皮膚過敏反應圖示

圖6大鼠的被動皮膚過敏反應圖示

圖710%吐溫80的水溶液以0.2mL.kg-1的劑量對家貓血壓的影響

(S:0.2mL.kg-1的0.5ug.mL-1組胺標準品溶液,T1:10%吐溫80的水溶液)

圖810%吐溫80的水溶液以1.0mL.kg-1的劑量對家貓血壓的影響

(S:0.2mL.kg-1的0.5ug.mL-1組胺標準品溶液,T:10%吐溫80的水溶液)

圖91.0mL.kg-1劑量的清開靈注射液對家貓血壓的影響

(S:0.2mL.kg-1的0.5ug.mL-1組胺標準品溶液,T13,T14:清開靈注射液)

具體實施方式

下面通過給出的試驗例對本發明作出進一步說明,但所述實驗例并不能對本發明要求保護的范圍構成任何限制。

實驗例1

材料與方法

1咪喹莫特作為佐劑的藥物過敏效果

1.1實驗材料:清開靈注射液由廣州明興制藥廠提供,規格10ml/支,批號100826;2,4-二硝基氯苯,化學純,購自上海晶純試劑有限公司,規格100g/瓶,批號14676;丙酮購自國藥集團化學試劑有限公司,規格500ml/瓶;佐劑為麗科杰(咪喹莫特乳膏),購白湖北科益藥業股份有限公司,白色乳膏劑,規格3g∶0.15g,批號110201。

1.2實驗動物:雌性Hartley豚鼠,250-350g,購自廣州市花東信華實驗動物養殖場。

1.3陽性物的配制:致敏時稱取0.2g2,4-二硝基氯苯,將其溶入20ml丙酮中,制得澄清淡黃色溶液;攻擊時稱取0.05g2,4-二硝基氯苯,將其溶入50ml丙酮中,制得澄清淡黃色溶液。

1.4致敏:致敏前24小時先用動物剃毛刀將豚鼠背部左側皮膚上的毛剃去。

1.4.1陰性對照組:將5只脫毛豚鼠分為陰性對照組。第0天,在外敷藥紙上稱取麗科杰0.1g(含咪喹莫特5mg)/只,貼敷在左側去毛區皮膚,以醫用膠帶和繃帶固定6小時。第7、14天分別重復上述操作致敏,共3次。

1.4.2清開靈組:將脫毛豚鼠分為4組,每組5只。第0天,A組在外敷藥紙上稱取麗科杰0.05g(含咪喹莫特2.5mg)/只,分別與0.2ml清開靈注射液混合,貼敷在豚鼠左側皮膚;B組在外敷藥紙上稱取麗科杰0.1g(含咪喹莫特5mg)/只,分別與0.2ml清開靈注射液混合,貼敷在豚鼠左側皮膚;C組在外敷藥紙上稱取麗科杰0.05g(含咪喹莫特2.5mg)/只,分別與0.2ml清開靈注射液混合,貼敷在豚鼠左側皮膚;D組在外敷藥紙上稱取麗科杰0.1g(含咪喹莫特5mg)/只,分別與0.2ml清開靈注射液混合,貼敷在豚鼠左側皮膚。各組豚鼠以醫用膠帶和繃帶固定6小時。第7、14天以同樣方法重復一次,共3次。

1.4.3陽性對照組:將脫毛豚鼠分為5組,每組5只。第0天,E組在外敷藥紙上稱取麗科杰0.05g(含咪喹莫特2.5mg)/只,分別與0.2ml1%2,4-二硝基氯苯丙酮溶液混合,貼敷在豚鼠左側皮膚;F組在外敷藥紙上稱取麗科杰0.1g(含咪喹莫特5mg)/只,分別與0.2ml1%2,4-二硝基氯苯丙酮溶液混合,貼敷在豚鼠左側皮膚;G組在外敷藥紙上稱取麗科杰0.05g(含咪喹莫特2.5mg)/只,分別與0.2ml0.2ml1%2,4-二硝基氯苯丙酮溶液混合,貼敷在豚鼠左側皮膚;H組在外敷藥紙上稱取麗科杰0.1g(含咪喹莫特5mg)/只,分別與0.2ml0.2ml1%2,4-二硝基氯苯丙酮溶液混合,貼敷在豚鼠左側皮膚;第5組涂抹0.2ml1%2,4-二硝基氯苯丙酮溶液,不加佐劑,以外敷藥紙貼敷在豚鼠左側皮膚。各組豚鼠以醫用膠帶和繃帶固定6小時。第7、14天分別重復上述操作致敏,共3次。

1.5攻擊:攻擊前24小時先用動物剃毛刀將豚鼠背部右側皮膚上的毛剃去。

1.5.1陰性對照組:第28天,在外敷藥紙上稱取麗科杰0.1g(含咪喹莫特5mg)/只,貼敷在右側去毛區皮膚,以醫用膠帶和繃帶固定6小時。激發接觸后1、24、48小時觀察皮膚反應并根據表2評分。

1.5.2清開靈組:第28天,A組涂抹0.2ml清開靈注射液,不加佐劑,貼敷在豚鼠右側皮膚;B組涂抹0.2ml清開靈注射液,不加佐劑,貼敷在豚鼠右側皮膚;C組在外敷藥紙上稱取麗科杰0.05g(含咪喹莫特2.5mg)/只,分別與0.2ml清開靈注射液混合,貼敷在豚鼠右側皮膚;D組在外敷藥紙上稱取麗科杰0.1g(含咪喹莫特5mg)/只,分別與0.2ml清開靈注射液混合,貼敷在豚鼠右側皮膚。各組豚鼠以醫用膠帶和繃帶固定6小時。激發接觸后1、24、48小時觀察皮膚反應并根據表2評分。

1.5.3陽性對照組:第28天,A組涂抹0.2ml1%2,4-二硝基氯苯丙酮溶液,不加佐劑,貼敷在豚鼠右側皮膚;B組涂抹0.2ml1%2,4-二硝基氯苯丙酮溶液,不加佐劑,貼敷在豚鼠右側皮膚;C組在外敷藥紙上稱取麗科杰0.05g(含咪喹莫特2.5mg)/只,分別與0.2ml1%2,4-二硝基氯苯丙酮溶液混合,貼敷在豚鼠右側皮膚;D組在外敷藥紙上稱取麗科杰0.1g(含咪喹莫特5mg)/只,分別與0.2ml1%2,4-二硝基氯苯丙酮溶液混合,貼敷在豚鼠右側皮膚。各組豚鼠以以醫用膠帶和繃帶固定6小時。激發接觸后1、24、48小時觀察皮膚反應并根據表2評分。

表1各組豚鼠試驗用受試物和佐劑劑量安排

表2變態反應試驗皮膚反應評分

2皮膚光毒性試驗

3.2材料與方法

3.2.1試驗儀器與材料:皮膚光毒性實驗儀購白天津合普公司,型號為HOPE-MED8130A型。陽性對照物選用8-甲氧基補骨脂(8-methoxypsoralen,8-Mop),購自東京化成工業株式會社。

2.2試驗動物:Hartley豚鼠,雌雄各半,250-350g,購自廣州市花東信華實驗動物養殖場。

2.3陽性物的配制:稱取0.2g8-甲氧基補骨脂,將其溶入20ml95%酒精中,制得澄清無色溶液。

2.4UV光源

2.4.1UV光源:波長為340nm的UVA,UVB劑量不超過1J/cm2。

2.4.2強度的測定

用前需用輻射劑量儀在實驗動物背部照射區設6個點測定光強度(mW/cm2),以平均值計。測得UVA光強度依次為21、30、35.5、33、31.7、20.9,平均值為28.7,單位為100uW/cm2;UVB光強度依次為2.8、4.2、5.3、5.6、5.1、3.3,平均值為4.4,單位為1uW/cm2。

2.4.3照射時間的計算

照射劑量為10J/cm2,按下式計算照射時間。

照射時間(sec)=照射劑量(10000mJ/cm2)÷光強度(mJ/cm2/sec)

注:1mW/cm2=1mJ/cm2/sec

計算得出照射時間為3484秒,UVB劑量為15.3mJ/cm2,符合實驗要求。

2.5試驗步驟:進行正式光毒試驗前24小時,將豚鼠脊柱兩側皮膚去毛,試驗部位皮膚需完好,無損傷及異常。備4塊去毛區,左上、右上、左下、右下,編號依次為1~4。將豚鼠固定,按表3所示,在動物去毛區1和2涂覆0.2ml陽性物。通過預試驗確定所用陽性物濃度不引起皮膚刺激反應,30分鐘后,左側(去毛區1和3)用鋁箔覆蓋,膠帶固定,右側用UVA進行照射。

結束后分別于1、24、48和72小時觀察皮膚反應,根據表4判定每只動物皮膚反應評分。

表3動物去毛區的試驗安排

表4皮膚光毒性反應評分

3結果與分析

1咪喹莫特作為佐劑的藥物過敏效果結果分析

攻擊后48小時內陰性對照與清開靈組豚鼠皮膚均無紅斑或水腫出現。1小時后觀察陽性對照組豚鼠皮膚出現不同程度的紅斑與水腫,出現陽性結果的比例較高,24、48小時后部分豚鼠紅斑或水腫明顯減輕,但有部分豚鼠呈現遲發性陽性反應。各組動物之間結果差異不明顯,見表5~7及圖1。

表5攻擊后1h對豚鼠皮膚變態反應試驗結果

表6攻擊后24h對豚鼠皮膚變態反應試驗結果

表7攻擊后48h對豚鼠皮膚變態反應試驗結果

圖1攻擊后1h豚鼠皮膚紅斑與水腫情況

1:陰性對照組;2:清開靈組;3:陽性對照組(E);4:陽性對照組(+)

2皮膚光毒性試驗結果分析

單純涂受試物而未經照射區域未出現皮膚反應,而涂受試物后經照射的區域出現皮膚反應分值之和為2或2以上的動物數為1只或1只以上時,判為受試物具有光毒性。部分豚鼠去毛區1、4在1小時后出現輕微紅斑或水腫,24、48小時后反應明顯減輕,72小時后反應均完全消失;去毛區2均呈現中度至重度的陽性結果,72小時后部分豚鼠反應減輕,但仍可見明顯紅斑;去毛區3未見任何皮膚反應,見表8。

表8陽性對照物對豚鼠皮膚光毒性試驗結果

注:1,2,3,4為表6所不試驗區

4討論

由于藥物過敏的特異性和不可預測性,設計和建立適當藥物過敏動物模型是對藥物過敏進行準確評價及其反應機制研究的必然途徑。但目前通過動物模型預測藥物過敏的發生率,以及建立適于已知藥物過敏繁盛機制研究的動物模型,均存在較大的困難。咪喹莫特屬于咪唑喹啉胺類藥物。有報道指出,咪喹莫特作為透皮劑,確實能促進生物大分子的透皮作用。目前對于藥物過敏的動物模型結果評價,實驗人員的主觀影響因素較大,且皮膚過敏反應與皮膚刺激反應、皮膚毒性反應有相似之處,難以區分。用咪喹莫特混合清開靈注射液或陽性對照物2,4-二硝基氯苯對豚鼠皮膚給藥,實驗結果表明咪喹莫特未能加強藥物過敏反應,與預期結果不符。但在末次致敏給藥中發現部分豚鼠有提早出現紅斑的情況,懷疑咪喹莫特可能縮短了過敏物質的致敏周期。另外發現了添加咪喹莫特的各組豚鼠死亡率均明顯高于不加咪喹莫特的組別,懷疑咪喹莫特有加強藥物毒性的作用。但因受經費等條件制約,樣本量不足以說明問題。

本實驗室的另外一項皮膚光毒性試驗則成功建立了以豚鼠為動物模型的藥物光毒性反應,并且區分于藥物過敏。可用于藥物、化妝品等的光毒性檢測。

實驗例2

實驗方法

1全身主動過敏試驗(ASA)

1.1致敏:取健康豚鼠6只,雌雄兼用,腹腔注射清開靈注射液0.5ml,隔日一次,共3次進行致敏。首次致敏前稱重并記錄。

1.2激發:于致敏的第14和第21天,分別取3只豚鼠靜脈注射給藥進行攻擊,給藥劑量為1.0ml。激發前稱重并記錄。

1.3觀察:攻擊后30分鐘內,豚鼠有無豎毛、呼吸困難、抽搐等過敏反應癥狀。指標有豎毛、噴嚏、干嘔、連續咳嗽3聲和呼吸困難等現象中2種或2種以上,或出現抽搐、休克、死亡現象之一者判斷為出現過敏反應。

2豚鼠最大化試驗(GPMT)

2.1分組:取健康白色豚鼠30只,體重300g~500g,雌雄兼用,隨機分為3組,即清開靈注射液組、1%2,4-二硝基氯苯陽性對照組、0.9%氯化鈉注射液陰性對照組,每組10只。試驗前24小時剃除肩背部4cm×6cm區域毛發。

2.2誘導:用75%乙醇清潔去毛區,作6點對稱皮內注射,相距1cm,劑量為0.1ml。7天后再次剃毛,用75%乙醇清潔,若未出現刺激反應,每一試驗區用10%十二烷基硫酸鈉石蠟液預處理,在局部斑貼前24小時涂抹,按摩試驗區皮膚,24小時后,將2cm×4cm濾紙浸入供試品或陰性對照液、陽性對照液至飽和,將其貼于豚鼠背部注射部位,封固48小時。

2.3激發:于誘導完成14天,在豚鼠左右腹側未用過處剃毛,用75%乙醇清潔,將2cm×2cm濾紙浸入供試品或陰性對照液、陽性對照液中至飽和,將其貼于剃毛區,封固24小時。

2.4觀察:將貼敷物取下后1、24和48小時,分別觀察貼敷處紅斑和水腫情況,并記分。

2.3被動皮膚過敏試驗(PCA)

2.3.1劑量設計:清開靈注射液用量用法:肌肉注射,一日2~4mL。重癥患者靜脈滴注,一日20~40mL,以10%葡萄糖注射液200mL或生理鹽水注射液100mL稀釋后使用。清開靈注射液靜脈滴注發現過敏劑量在20~40mL/人次不等,按40mL/人次換算大鼠等效劑量為3.6mL·kg-1,故設計給藥劑量高劑量組為7.2mL·kg-1,低劑量組為3.6mL·kg-1。

卵白蛋白陽性對照組大鼠給藥劑量為75mg·kg-1,按15mg·mL-1給藥濃度和0.5mL·(100g)-1的給藥體積給藥。陰性對照組為0.9%氯化鈉注射液,給藥體積同陽性對照組。

2.3.2抗血清的制備:取健康大鼠8只,每組2只,分別為清開靈注射液高劑量組、低劑量組、卵白蛋白組(陽性對照)、生理鹽水組(陰性對照),各組隔日腹腔注射相應藥液,共3次。末次致敏注射后第10天腹主動脈采血,3000r·min-1離心10min,分離血清。

2.3.3被動致敏:取健康大鼠16只,隨機分成4組,上述各組抗血清用生理鹽水稀釋成1∶2、1∶4、1∶8、1∶16,在動物背部預先脫毛3×4cm2的皮內注射各對應組的抗血清0.1mL,進行被動致敏。

2.3.4激發:被動致敏48小時后,各組靜脈注射2倍致敏劑量的激發抗原內含的0.5%伊文思蘭染料,進行激發。

2.3.5觀察指標1:30min后處死各組動物,剪取背部皮膚,測量皮膚內層的藍色斑點大小,直徑大于5mm者為陽性(不規則斑點的直徑為長徑與短徑之和的一半)。

2.3.6觀察指標2:將藍色斑片剪下,稱重后剪碎,加人丙酮-生理鹽水(7∶3)混合液5ml,浸泡后次日離心,3000r·min-1離心10min。取上清液在610nm波長處定其吸收度。計算出變化百分率。

2.3.7血清IgE、組胺測定:取2.3.4項動物血清,根據SD公司豚鼠免疫球蛋白E(IgE)說明書、大鼠豚鼠組胺(Histamine)說明書操作步驟操作,測定血清中IgE、組胺含量。

2.3.8統計分析:各組實驗數據用均數±標準差(x±s)表示,組間比較用t檢驗,數據統計采用excel軟件處理

4實驗結果

3.1全身主動過敏試驗:致敏期間豚鼠未出現任何異常反應,體重隨時間延長而增長。在給予激發劑量后沒有出現豎毛、噴嚏、干嘔、連續咳嗽3聲和呼吸困難等現象中2種或2種以上,或出現抽搐、休克、死亡現象,判斷為過敏反應陰性。

3.2豚鼠最大化試驗

表1清開靈注射液豚鼠最大化試驗結果

3.3被動皮膚過敏試驗

3.3.1藍斑結果與光密度

試驗中清開靈注射液的陽性反應不明顯,只有清開靈低劑量組一只大鼠出現陽性反應(藍斑5mm)見圖1;皮膚反應斑光密度項清開靈組與陽性對照組比較無明顯差異(P>0.05),與陰性對照組比較有明顯差異(P<0.05),清開靈高劑量組皮膚反應斑光密度比低劑量組大。(見表2)

3.3.2血清中IgE含量測定

清開靈注射液組血清中IgE含量與陰性對照組無明顯差異,與陽性對照組有明顯差異,清開靈高劑量組比低劑量組的血清中IgE含量低。(見表4)

3.3.3血清中組胺含量測定

開靈注射液組血清中IgE含量與陰性對照組無明顯差異,與陽性對照組有明顯差異,清開靈高劑量組比低劑量組的血清中組胺含量高。(見表3)

表2被動皮膚過敏試驗藍斑與光密度表現(x±s)

注:與陽性對照組比較P>0.05;與陰性對照組比較P<0.05

表3血清中組胺含量(x±s)μg/L

注:HIS:y=222.49x+1.3284R=0.930676??與陽性對照組比較P<0.05

表4血清中IgE含量(x±s)μg/L

注:y=72.432x+6.242R=0.91121??與陽性組比較P<0.05

5討論

本文用現行中藥注射劑過敏反應非臨床研究方法研究臨床上經常出現過敏反應的清開靈注射劑的過敏性,并測定血清中IgE、組胺的含量,以找到更加合適的試驗方法、檢測指標對其進行全面評價,保障臨床用藥的安全性。ASA、GPMT和PCA試驗研究表明PCA試驗與臨床實際應用有更好的相關性;在PCA試驗中出現過敏反應(藍斑5mm)清開靈低劑量組血清中IgE的含量比未出現過敏反應的高劑量組高,但是與陽性組有明顯差異(P<0.05),表明過敏反應發生與IgE生成有關,但是過敏反應只是弱陽性或者是假陽性。對于血清中組胺的含量測定表明,PCA試驗中出現過敏反應,但是血清中組胺含量沒有升高,故組胺含量結果與過敏反應不一致,其原因是試劑盒的測定方法及靈敏度有關,還是與過敏反應中所介導的抗體種類有關尚值得將來進一步研究。

綜上,被動皮膚過敏試驗(PCA)對于清開靈注射液臨床實際應用有較好的相關性,但其他中藥注射劑PCA試驗是否能產生同樣反應尚未可知,因此PCA對于中藥注射劑過敏反應預測的適用性還需確定。雖然血清IgE濃度變化作為過敏反應評價指標存在缺陷,但是從達到提高試驗預測準確性為目的,可以從IgE檢測角度考慮通過動物實驗預測全身性過敏反應。

實驗例3

類過敏反應(Anaphylactoid?Reaction),也稱偽變態反應(Pseudoallergy?Reaction),泛指不經過抗體形成過程,首次給藥即可引發過敏癥狀的現象。中藥注射劑所引起的類過敏反應日漸成為中藥免疫毒理學研究關注的焦點。缺少有力的動物模型制約了對其非臨床評價和機制探討的深入研究,為此我們了小鼠耳廓藍染試驗檢查中藥注射劑類過敏反應的效能,并初步探討了其反應的機制,以期建立起高效能的動物模型對中藥注射劑引起的類過敏反應進行全面客觀的評價,為今后深入研究中藥注射劑的免疫毒性反應,提高中藥注射劑的質量標準奠定基礎。

1儀器與材料

UV-2401PC紫外分光光度計(島津公司);Biofuge28RS型離心機(HERAEUS?SEPATECH公司);Medlab-U/4C501H生物信號采集處理系統(南京美易科技有限公司)。

實驗動物:雄性NIH小鼠,體重22-25g,共90只,購自廣東省醫學實驗動物中心,實驗動物生產許可證號:SCXK(粵)2008-0002;SPF動物室溫度23-25℃,濕度40-70%,12h/12h光照,自由進食飲水;SPF級大小鼠維持期飼料由廣東省醫學實驗動物中心提供;雄性家貓,體重3.5kg,由本所動物房提供。

試劑:清開靈注射劑,由白云山明興制藥廠生產,規格:10ml/支,批號:100833;

丹參川芎嗪注射液,由貴州拜特制藥有限公司生產,規格5ml/支,批號:20091003001。吐溫80由廣州化學試劑廠生產,批號:20080401-1。

2方法與結果

2.1小鼠耳廓藍染試驗

各組動物按以下分組給藥。

第一組:空白對照組,以原液給予氯化鈉注射液;

第二組:陽性對照低劑量組,給以2.5%吐溫80的水溶液;

第三組:陽性對照高劑量組,給以5%吐溫80的水溶液;

第四組:丹參川芎嗪低劑量,給以1/40丹參川芎嗪注射液;

第五組:丹參川芎嗪中劑量,給以1/20丹參川芎嗪注射液:

第六組:丹參川芎嗪高劑量,給以丹參川芎嗪注射液1/10原液;

第七組:清開靈低劑量組,給以25%清開靈注射液;

第八組:清開靈中劑量組,給以50%清開靈注射液;

第九組:清開靈高劑量組,給以清開靈注射液原液。

各給藥組分別按20ml/kg的劑量iv.給以含0.4%伊文思藍的各供試樣品溶液。30分鐘后檢測各組動物耳廓藍染面積。拖頸處死各組動物,剪下雙耳,以2ml丙酮-生理鹽水液浸泡,于4℃冰箱中過夜,以3000rpm離心15分鐘,取上清液于610nm處測試吸光度。同時做10、5、1、0.5、0.2、0.1、0mg/L的伊文思藍的標準曲線,計算各耳朵伊文思藍染料的滲出量,試驗結果見表1。

統計方法,以SPSS13.0統計軟件進行方差分析。

2.2中藥注射劑的降壓物質檢查

按照2010年版《中國藥典》(二部)附錄XIG降壓物質檢查法進行,取供試用家貓,以苯巴比妥鈉與戊巴比妥鈉的混合麻醉劑麻醉之后,固定于保溫手術臺上,在一側頸動脈插入連接血壓測量計的動脈插管,管內以肝素溶液抗凝,記錄血壓。在一側股靜脈插入靜脈插管以注射試驗溶液。待血壓穩定后開始進行注射,各次注射速度基本相同,注射藥液后注入2mL氯化鈉注射液。每次注射在前一次反應穩定后進行,相鄰兩次注射的間隔時間也盡量保持一致。首先依次注入對照品稀釋液,確定該貓靈敏度符合藥典規定之后開始進行正式試驗。以0.2mL.kg-1和1mL.kg-1劑量分別給以10%吐溫80水溶液,結果見圖2,3。

3結論和討論

表1中藥注射劑對NIH小鼠耳廓藍染作用(X±S)

各給藥組均與空白對照組作比較,*p<0.05,**p<0.01,n=10

從本研究的試驗結果可以看出,吐溫80水溶液在5%的濃度下可以顯著的增加小鼠耳廓藍染的反應,可以用作本試驗的陽性對照物,并證明NIH小鼠對于本試驗的靈敏性與ICR小鼠一致。

本試驗方法對于不同中藥注射劑的耳廓藍染反應具有區分性,且該反應對于清開靈注射液呈劑量依賴性,由此可見,以小鼠耳廓藍染的方法檢測中藥注射劑引發類過敏反應的能力是可行的。

通過降壓物質檢查法檢查兩個劑量下的吐溫80水溶液和清開靈注射液引起家貓血壓下降的反應,發現清開靈注射液和10%吐溫80水溶液在1mL.kg-1劑量下引起貓血壓下降的能力超過組胺標準品溶液中劑量,該結果提示小鼠耳廓藍染的反應與與機體內組胺的一過性釋放密切相關。組胺在體內的濃度升高是肥大細胞脫顆粒的宏觀體現,也是速發型變態反應的重要病理生理特征,可由于組胺在體內的半衰期很短,如何準確的檢測機體內組胺水平是一個難點,本研究表明,可以通過小鼠耳廓藍染的試驗方法檢測機體內的組胺釋放量。

由本研究結果還可以看出,降壓物質檢查與小鼠的耳廓藍染試驗均可用于檢測機體內的組胺一過性釋放,從而表征藥物引發類過敏反應的能力。其各自相關的機制和方法適用性則還有待于進一步的深入研究。

中藥注射劑和制劑輔料的免疫安全性評價日漸得到重視。本研究為中藥注射劑和制劑輔料的免疫安全型評價以及質量控制奠定了基礎。

摘要]目的研究清開靈注射液對痤瘡丙酸桿菌和脂多糖(P.acnes-LPS)誘發小鼠免疫性肝炎的治療作用。方法通過建立P.acnes-LPS誘發小鼠免疫性肝損傷模型,用全自動血生化分析儀測定小鼠血清丙氨酸氨基轉移酶(ALT)、天冬氨酸氨基轉移酶(AST)等血清生化水平。結果與模型組相比,清開靈注射液能明顯降低痤瘡丙酸桿菌和脂多糖(P.acnes-LPS)所致肝損傷導致的血清中ALT活性的升高(P<0.05)。結論清開靈注射液對于P.acnes-LPS引起的免疫性肝炎有一定的抑制作用,說明中藥注射劑具有一定的抑制性的免疫毒性。

此外,我們同時進行了卵白蛋白引發豚鼠哮喘的模型和小鼠的腘窩淋巴結試驗檢測清開靈注射液的免疫毒性,試驗結果表明,清開靈注射液在不同的劑量下,具有不同的免疫毒性反應。其免疫毒性反應的機制和評價方法,值得進一步的研究和探討。

實驗例4-清開靈注射液抗免疫性肝損傷活性的研究

熱滅活P.acnes和LPS共同誘發肝損傷是目前較為常用的自身免疫性肝損傷動物模型。當LPS靜脈注射P.acnes負荷小鼠后,激活肝臟庫普弗細胞(Kupffer?cell),活化巨噬細胞及相關細胞因子,繼而誘發炎癥反應[5]。與其他肝損傷動物模型相比,P.acnes-LPS誘導的肝損傷更近似自身免疫性肝炎的病理過程,其病變與慢性肝炎非常接近。研究證明組胺等炎癥介質及外周免疫擔當細胞參與P.acnes-LPS誘發小鼠肝損傷的病理過程。在研究中確認白三烯是肝損傷過程中的重要炎癥介質[6]。

本研究通過P.acnes-LPS負荷小鼠肝損傷模型,考察清開靈注射液提取物對P.acnes-LPS誘發肝損傷小鼠血漿中丙氨酸氨基轉移酶(alan?ine?am?inotransferase,ALT)的影響,評價中藥注射劑對P.acnes-LPS誘發肝損傷的保護作用及探討可能的作用機制,以探索合適的中藥注射劑免疫毒性的評價方法。

2材料與方法

2.1實驗動物

7周齡18-22g,SPF級昆明種小鼠購自廣州中醫藥大學實驗動物中心[許可證號SCXK(粵)2008-0020]。適應性飼養1周后進行實驗。

2.2分析儀器

梅特勒電子分析天平、熱電臺式高速冷凍離心機,日立7060全自動血生化分析儀。美國Bio-Rad伯樂酶標儀(型號:iMark)。96孔微量板(平底,貨號:3599,COSTAR公司)。

2.3猴耳環水體物浸膏對免疫性肝損傷的治療作用

2.3.1熱滅活P.acnes干粉的制備[8]

P.acnes菌株接種在添加0.03%L-半胱氨酸(L-cysteine)和0.03%吐溫80(Tween80)的腦-心浸萃液態培養基中,置于厭氧培養裝置內,37℃條件下培養48h。培養后回收菌液在4℃,10000×g下離心15min,并以PBS(phosphate-buffered?saline)清洗。清洗后的菌細胞重新以PBS分散,80℃加熱30min滅活后冷凍干燥,并回收得P.aches干粉用于本研究。

2.3.2P.acnes-LPS肝炎模型制備及給藥方法[9]

P.acnes-LPS肝炎模型制備通過小鼠尾靜脈注射8mg·kg-1熱滅活P.acnes生理鹽水溶液,P.acnes負荷5d后尾靜脈注射5ug/kg?LPS-PBS溶液。實驗動物在LPS注射0.5h后眼眶取血于EP管中,3000r/min離心10min,取上清液用于血生化分析。實驗動物隨機分為空白對照組、P.acnes-LPS模型組、P.acnes-LPS模型+CsA組(25mg·kg-1)、P.acnes-LPS模型+清開靈注射液高劑量組、P.acnes-LPS模型+清開靈注射液低劑量組共5組,每組6只小鼠。P.acnes負荷前1d起每天1次連續7d灌胃給予注射液,末次給藥在LPS注射30min前,對照組給予等容量氯化鈉注射液。CsA從P.acnes負荷后1d起灌胃給藥。

2.3.3丙氨酸氨基轉移酶(ALT)活性測定[10]

測定小鼠血清ALT活性以評價肝臟損傷程度。同時以生化分析儀檢測ALT、AST、TP、ALB等血生化指標。

2.4統計學處理

實驗數據以STATA11.0統計軟件包處理實驗數據,實驗數據以x±s表示,采用方差分析進行統計學分析。

3結果

清開靈注射液對P.acnes-LPS誘發肝損傷小鼠血清ALT水平的影響P.acnes-LPS誘發小鼠血清ALT活性顯著升高(P<0.001)。與模型組相比,不同劑量猴耳環水提物均顯示降低P.acnes-LPS負荷小鼠血清ALT水平,且呈一定量效關系。對照藥CsA也同樣顯著抑制因P.acnes-LPS負荷而引起的小鼠血清ALT活性的升高。肝臟是合成白蛋白和球蛋白的主要器官,肝臟損傷后必然會影響這些蛋白的合成。本試驗中,經尾靜脈注射P.acnes-LPS誘導小鼠免疫性肝損傷后,模型組小鼠血清TP含量減少、ALB含量下降、GLO(TP與ALB的差值)升高。高、低劑量猴耳環均可有效抑制小鼠免疫性肝損傷后血清TP,ALB含量的減少及GLO含量的升高。但由于統計樣本量不足,這種差異沒有體現出統計學意義。結果見表1。

表1清開靈注射液對免疫性肝損傷小鼠血液生化檢測結果的影響

各組數據均與模型對照組相比較(*P<0.05,**P<0.01)。

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