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干擾SIRT1表達試劑在制備抑制肝癌干細胞自我更新的藥物中的應用.pdf

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干擾 SIRT1 表達 試劑 制備 抑制 肝癌 干細胞 自我 更新 藥物 中的 應用
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摘要
申請專利號:

CN201410032594.4

申請日:

20140123

公開號:

CN103751805B

公開日:

20150923

當前法律狀態:

有效性:

有效

法律詳情:
IPC分類號: A61K48/00,A61P35/00 主分類號: A61K48/00,A61P35/00
申請人: 中國人民解放軍第三軍醫大學第一附屬醫院
發明人: 錢程,劉麗梅,劉春剛,沈俊杰,單娟娟
地址: 400038 重慶市沙坪壩區高灘巖正街30號
優先權: CN201410032594A
專利代理機構: 北京同恒源知識產權代理有限公司 代理人: 趙榮之
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法律狀態
申請(專利)號:

CN201410032594.4

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法律狀態公告日:

法律狀態類型:

摘要

本發明屬于化學領域,公開了干擾SIRT1表達試劑在制備抑制肝癌干細胞自我更新的藥物中的應用,通過在肝癌干細胞中抑制SIRT1表達能夠顯著降低肝癌干細胞的增殖能力、克隆形成能力和成球能力,從而抑制肝癌干細胞的自我更新;因此可以將干擾SIRT1表達試劑靶向抑制肝癌干細胞的自我更新,實現肝癌的靶向治療。

權利要求書

1.干擾SIRT1表達試劑在制備抑制肝癌干細胞自我更新的藥物中的應用。2.根據權利要求1所述的應用,其特征在于:所述干擾SIRT1表達試劑為干擾SIRT1表達的慢病毒。3.根據權利要求2所述的應用,其特征在于:所述干擾SIRT1表達的慢病毒含有Lv-sh-SIRT1質粒。4.根據權利要求3所述的應用,其特征在于:所述干擾SIRT1表達的慢病毒由Lv-sh-SIRT1質粒轉染293T細胞后,經包裝、純化而得。5.根據權利要求1-4任一項所述的應用,其特征在于:干擾SIRT1表達試劑在制備抑制肝癌干細胞增殖的藥物中的應用。6.根據權利要求1-4任一項所述的應用,其特征在于:干擾SIRT1表達試劑在制備抑制肝癌干細胞克隆形成的藥物中的應用。7.根據權利要求1-4任一項所述的應用,其特征在于:干擾SIRT1表達試劑在制備抑制肝癌干細胞成球的藥物中的應用。

說明書

技術領域

本發明屬于化學領域,特別涉及干擾SIRT1表達試劑在制備抑制肝癌干細胞自我更新的藥物中的應用。

背景技術

腫瘤是由遺傳改變或表觀遺傳發生變異所導致的一類復雜的疾病,腫瘤發生和演進是一個復雜的多步驟過程。近年來研究發現,腫瘤中存在一小群具有干細胞樣的腫瘤細胞亞群,具有啟始腫瘤的能力,因此被稱為腫瘤干細胞(Cancer?Stem?Cells,CSCs)或腫瘤啟始細胞(Tumor?Initiating?Cells,TICs)。迄今為止,已從肝癌、乳腺癌、結直腸癌、膠質瘤、肺癌、前列腺癌、黑色素瘤和白血病等至少30種常見腫瘤中分離和鑒定出腫瘤干細胞。因此,CSCs的分子調控機制及其在惡性腫瘤發生發展中的作用機理已成為腫瘤研究領域的關鍵科學問題。

近年來,表觀遺傳學修飾已日趨成為腫瘤研究的熱點課題。表觀遺傳修飾作為分子調控機制中一種重要的作用模式,參與了細胞自我更新、增殖和分化等一系列重要的生物學過程,而其中組蛋白乙酰化修飾作為表觀遺傳修飾一種重要的轉錄后修飾。組蛋白的乙酰化修飾與真核細胞基因表達密切相關,是基因轉錄調控的一種重要的機制。現有研究還表明,組蛋白的乙酰化修飾在胚胎干細胞自我更新和分化過程中發揮重要作用,但是在肝癌干細胞研究中還未見報道。

SIRT1蛋白是一種煙堿腺嘌呤二核苷酸(NAD+)依賴性的Class?III類組蛋白去乙酰化酶,屬于誘導沉默調節2(silent?information?regulator2,Sir2)家族。SIRT1在腫瘤的發生和細胞的代謝中具有重要的角色,其作用廣泛,包括細胞衰老,DNA修復,細胞周期,代謝,應激反應以及癌癥的發生等。目前對SIRT1在干細胞的研究主要集中在鼠和人的胚胎干細胞以及人的造血干細胞中,但SIRT1在調節實體腫瘤尤其是在肝癌干細胞的表達,以及它所發揮的作用和分子機制仍未見報道。

發明內容

有鑒于此,本發明的目的在于提供干擾SIRT1表達試劑的新用途,為肝癌的靶向治療具有重要意義。

為實現上述發明目的,本發明提供如下技術方案:

干擾SIRT1表達試劑在制備抑制肝癌干細胞自我更新的藥物中的應用。

優選的,所述干擾SIRT1表達試劑為干擾SIRT1表達的慢病毒。

更優選的,所述干擾SIRT1表達的慢病毒含有Lv-sh-SIRT1質粒。

更優選的,所述干擾SIRT1表達的慢病毒所述干擾SIRT1表達的慢病毒由Lv-sh-SIRT1質粒轉染293T細胞后,經包裝、純化而得。

優選的,干擾SIRT1表達試劑在制備抑制肝癌干細胞增殖的藥物中的應用。

優選的,干擾SIRT1表達試劑在制備抑制肝癌干細胞克隆形成的藥物中的應用。

優選的,干擾SIRT1表達試劑在制備抑制肝癌干細胞成球的藥物中的應用。

本發明的有益效果在于:本發明公開了干擾SIRT1表達試劑在制備抑制肝癌干細胞自我更新的藥物中的應用,利用了通過在肝癌干細胞中抑制SIRT1表達能夠抑制肝癌干細胞的增殖、克隆形成、成球能力以及皮下移植瘤形成率,延緩體內腫瘤生長,因此可以將干擾SIRT1表達試劑用于靶向治療肝癌,對延長肝癌生存時間具有重要意義。

附圖說明

為了使本發明的目的、技術方案和有益效果更加清楚,本發明提供如下附圖:

圖1為檢測在NanogPos的肝癌干細胞和NanogNeg的非肝癌干細胞中SIRT1的表達(A:通過western-blot檢測SIRT1表達;B:通過免疫熒光染色檢測SIRT1的表達)。

圖2為免疫缺陷小鼠皮下移植瘤中檢測SIRT1表達(A:western-blot檢測在SIRT1表達;B:H&E切片及免疫組化染色檢測SIRT1的表達)。

圖3為在NanogPos的肝癌干細胞分化過程中檢測SIRT1的表達。

圖4為western-blot驗證敲除SIRT1的干擾效率。

圖5為干擾SIRT1的表達后CCK-8檢測細胞增殖。

圖6為干擾SIRT1的表達后檢測克隆形成能力。

圖7為干擾SIRT1的表達后檢測成球能力。

圖8為NOD/SCID小鼠皮下移植瘤的重量和體積(A:NOD/SCID小鼠皮下移植瘤圖片;B:NOD/SCID小鼠皮下移植瘤的腫瘤重量;C:NOD/SCID小鼠皮下移植瘤的腫瘤體積)。

圖9為免疫組化檢測SIRT1或Ki-67在移植瘤的表達水平。

圖10為不同細胞數在NOD/SCID鼠皮下移植瘤成瘤能力(A:不同細胞數的存留率;B:干細胞形成比率)。

圖11為肝臟原位注射檢測NOD/SCID小鼠生存時間。

圖12為western-blot驗證在NanogNeg過表達SIRT1結果圖。

圖13為過表達SIRT1后檢測克隆形成以及成球能力(A:克隆形成;B成球能力)。

圖14為檢測過表達SIRT1的NOD/SCID小鼠移植瘤的腫瘤大小和重量(A:移植瘤的成瘤情況;B:移植瘤的重量;C:移植瘤的體積)。

具體實施方式

下面將結合附圖,對本發明的優選實施例進行詳細的描述。實施例中未注明具體條件的實驗方法,通常按照常規條件,例如分子克隆實驗指南(第三版,J.薩姆布魯克等著)中所述的條件,Shan?et?al.2012,hepatology,56:1014-1014中所述的條件或按照制造廠商所建議的條件。

本發明使用的肝癌干細胞模型由本實驗室構建,該模型含有Nanog啟動子調控GFP報告基因構建的慢病毒表達載體(Nanog/GFP報告系統),其構建方法參見Shan?et?al.2012,hepatology,56:1014-1014;Lv-sh-Scramble質粒和Lv-sh-SIRT1質粒、腺病毒載體AD-GFP由本實驗室構建,具體參見Shan?et?al.2012,hepatology,56:1014-1014;HEK293細胞由本實驗室保存。腺病毒AD-SIRT1由朱衛國教授惠贈,其構建方法見Liu?et?al.2011,Proc?NatlAcad?Sci?U?S?A.108:1925-1930。

人原發性肝癌細胞系PLC/PRF/5和肝癌細胞系Huh7購自中國科學院上海細胞所;抗SIRT1抗體購自美國Santa?Cruz公司,抗Albumin抗體購自美國Abcam公司。EnvisionTM和DAB顯色液購自丹麥DAKO公司。

一、檢測SIRT1在肝癌干細胞和非肝癌干細胞中的表達

取人原發性肝癌細胞系PLC/PRF/5、肝癌細胞系Huh7和肝癌細胞T1224,用流式細胞儀分別分選Nanog陽性肝癌干細胞(記為NanogPos)和Nanog陰性非肝癌干細胞(記為NanogNeg),然后western-blot方法檢測SIRT1的表達,具體為:分別收集1×106細胞數,離心去除PBS,加蛋白裂解液,冰上作用60min,分別滴加1×SDS凝膠加樣緩沖液,在100℃金屬浴煮10min,-20℃保存,配制10%分離膠和5%濃縮膠進行電泳,然后轉膜和顯影,其結果如圖1A所示。由圖1A可知,NanogPos的三種肝癌干細胞中SIRT1的表達水平顯著增高。

將分離三種細胞系的NanogPos和NanogNeg通過免疫熒光染色檢測SIRT1的表達,具體為:將分離三種細胞系的NanogPos和NanogNeg分別離心去除PBS,分別種植在爬片上,培養液為含10%FBS的DMEM(v/v),待細胞長至爬片約50-60%,棄去培養液,PBS快速洗滌3次,然后用質量分數為4%多聚甲醛固定液固定,室溫固定30min,PBS溶液漂洗3次,每次5min;然后棄去PBS溶液,滴加質量分數為0.1%的TritonX-100溶液,室溫作用5min,再用PBS溶液漂洗3次,每次5min,PBS溶液,滴加含10%FBS的PBS溶液(v/v),室溫封閉30min,棄去封閉液,滴加1:300(體積比)稀釋的兔抗SIRT1抗體,4℃孵育過夜;用PBS漂洗3次,每次5min,再加入1:1000(體積比)稀釋的488標記的兔抗山羊IgG(購自美國Invitrogen公司)室溫孵育60min;然后用PBS漂洗3次,每次5min分鐘,再滴加1:1000(體積比)稀釋的DAPI溶液,室溫作用10min;經PBS漂洗后,將爬片倒置于載玻片上,用含40%甘油的PBS封片(v/v)。激光共聚焦顯微鏡觀察染色結果,結果如圖1B所示。由圖1B可知,在NanogPos的三種肝癌干細胞中SIRT1的表達水平顯著高于NanogNeg的三種非肝癌干細胞。

二、SIRT1在肝癌干細胞與非肝癌干細胞移植瘤腫的表達情況

為進一步研究SIRT1在肝癌干細胞和非肝癌干細胞的表達,在NOD/SCID鼠體內進行皮下注射PLC/PRF/5細胞系分選的Nanog陽性肝癌干細胞與Nanog陰性非肝癌干細胞,具體如下:利用流式細胞儀在PLC/PRF/5細胞中分選Nanog陽性肝癌干細胞與Nanog陰性非肝癌干細胞,離心去除PBS,分別種植在6孔板內繼續培養以擴大細胞數量,培養液為含10%FBS的DMEM(v/v);然后分別取1.2×107個Nanog陽性肝癌干細胞與Nanog陰性非肝癌干細胞,離心去除培養液,加入1.2mL?PBS重懸,然后分別注射到NOD/SCID鼠皮下做移植瘤實驗,每只注射1×106細胞數,分10個點注射,待四周后,處死小鼠,剝離腫瘤,部分組織用于提取腫瘤組織蛋白,用western-blot鑒定SIRT1的表達,結果如圖2A所示;其余組織用于石蠟包埋并切片,經免疫組化染色后鑒定SIRT1的表達。具體方法為:將固定的NOD/SCID鼠皮下移植瘤,脫水并用石蠟包埋,H&E染色并連續切片,每張4-5μm厚,用免疫組化玻片裱片,常溫放置備用,然后將切片用烤片儀烘烤切片20min,放入二甲苯中,脫蠟10-20min,再用體積分數為70%-100%梯度酒精水化,蒸餾水漂洗切片3次,每次5min,接著將切片置于由41mL檸檬酸和9mL檸檬酸鈉并定容至為500mL的pH為6.0的枸櫞酸鈉溶液中,在800W條件下微波修復3.30min至溶液沸騰后,再在150W條件下16min維持沸騰狀態,修復完畢后至冷水中冷卻至室溫,蒸餾水漂洗切片3次,每次5min,然后按50μL/片滴加質量分數3%的H2O2溶液,37℃孵育20min,用雙蒸水漂洗5min后,再用PBS漂洗切片2次,每次5min;用滴加1:300(v/v)稀釋的兔抗SIRT1抗體,4℃孵育過夜;次日取出用PBS漂洗切片3次,每次5min,然后按50μL/片滴加EnVisionTM二抗,37℃孵育30min,PBS漂洗切片3次,每次5min,漂洗后滴加DAB顯色液,自來水終止反應,接著用蘇木素襯染45s,鹽酸酒精分化,自來水沖洗、藍化,最后用體積分數70%-100%梯度酒精脫水,二甲苯透明,中性樹脂封片,顯微鏡觀察,結果如圖2B所示。

免疫組化染色同時進行H&E染色實驗,具體為,取移植瘤按照常規病理組織固定、脫水、石蠟包埋,并連續切片,切片厚度3-5μm;裱片后用烤片儀烘烤切片20min,放入二甲苯中脫蠟10-20min后,用體積分數為100%-75%梯度酒精脫水,接著用蒸餾水漂洗切片3次,每次5min;再將切片放入蘇木素液中浸染切片5min,再在清水中漂洗蘇木素液;然后用質量分數為1%鹽酸酒精分化,流水沖洗,顯微鏡下觀察染色效果;再將切片置于伊紅染液中染色30s,用75%-100%梯度酒精水化;最后烘箱中烘干乙醇,浸入二甲苯中濕化切片,中性樹脂溶液封片觀察切片,結果如圖2B所示。

結果顯示,與NanogNeg的非肝癌干細胞移植瘤相比,在NanogPos的移植瘤中SIRT1的表達水平顯著上調,免疫組化染色結果也得到相同的結果。以上研究表明,在肝癌干細胞中SIRT1的表達顯著高于非肝癌干細胞,進一步表明高表達與肝癌干細胞存在內在聯系。

三、SIRT1在肝癌干細胞分化過程中的表達

為進一步研究SIRT1表達水平在肝癌干細胞分化過程中的變化,將人原發性肝癌細胞系PLC/PRF/5、肝癌細胞系Huh7通過流式細胞儀分選NanogPos的肝癌干細胞進行體外培養,分別收取0天,4天,8天,12天,16天,20天,24天不同時間點的蛋白,利用western-blot檢測SIRT1的表達,結果如圖3所示。結果顯示在肝癌干細胞分化過程中,SIRT1的表達水平隨著分化時間的延長而逐漸下調,表明SIRT1在肝癌干細胞中的異常高表達,而且在肝癌干細胞的分化過程中其表達水平逐漸下調。

四、在NanogPos的肝癌干細胞中下調SIRT1的表達對肝癌干細胞的影響

1.慢病毒Lv-sh-SIRT1和Lv-sh-Scramble的包裝

在10cm的培養皿中鋪2~5×106個293T細胞(最好是20代之前的,細胞的狀態必需良好,生長速度較快,否則對病毒產量影響很大),培養液含10%FBS的DMEM(v/v),待細胞匯合至70%時,換新鮮的含10%FBS的DMEM(v/v)培養液,3-4h后用于轉染。

取15-20μg的Lv-sh-SIRT1或Lv-sh-Scramble慢病毒表達質粒,分別滴加50μL2.5M的CaCl2混勻,向混合液中分別加入無菌水至總體積450μL,混勻后加入500μL2×HBS緩沖液(2×HBS緩沖液使用前于渦旋振蕩器上震蕩),然后置于渦旋振蕩器上震蕩10s以上,滴加結束后,繼續震蕩,室溫放置5分鐘后,將液體加入培養的293T中,加完后前后左右晃動混勻,加入后6-12小時換新鮮的10%FBS的DMEM(v/v)培養液。

2.慢病毒Lv-sh-SIRT1和Lv-sh-Scramble的收集和純化

自轉染開始后48小時、72小時各收集一次細胞培養液,48小時收集后,再補充15mL的培養液,將收集的病毒在1000rpm條件下離心10min去除細胞碎片,收集上清,并用0.45μm的濾膜過濾,濾液轉移入Millopore的濃縮柱,在5000rpm離心至上層凹槽內的液體體積濃縮至1mL(可分多次加入)。將濃縮液分裝,置于-80℃低溫冰箱保存。

3.在NanogPos的肝癌干細胞感染Lv-sh-SIRT1或Lv-sh-Scramble慢病毒

取人原發性肝癌細胞系PLC/PRF/5、肝癌細胞系Huh7和肝癌細胞T1224,通過流式細胞儀分選NanogPos的肝癌干細胞,然后接種在6孔板內,在37℃、5%CO2培養箱培養,待細胞長至5×105時,吸出孔內液體,加1mL的10%FBS/DMEM(v/v)培養液,然后每孔以10個MOI值,加入Lv-sh-SIRT1或Lv-sh-Scramble慢病毒,空白對照組不加入慢病毒,再于37℃、5%CO2培養箱培養,6-8小時后,吸出孔內液體,加2mL的10%FBS/DMEM培養液,72h后,分別檢測下調SIRT1的表達對肝癌干細胞增殖、克隆形成、成球形成的作用。

首先,利用western-blot檢測干擾SIRT1病毒72h的蛋白表達水平,驗證干擾SIRT1的有效性,其檢測方法與前述相同,檢測結果如圖4所示。結果顯示,相對于mock(空白組)和轉染Lv-sh-Scramble慢病毒組(對照組),轉染Lv-shSIRT1慢病毒的三種肝癌干細胞中SIRT1蛋白水平都顯著地下調,表明干擾SIRT1表達是有效的。

然后,利用CCK-8方法檢測干擾SIRT1表達后第1天、第2天、第3天、第4天、第5天和第6天三種肝癌干細胞的增殖速率,并在450nm處檢測吸光度,結果如圖5所示。結果顯示,經過連續6天的檢測,轉染Lv-sh-SIRT1慢病毒肝癌干細胞增殖速率顯著低于對照組和空白組,表明干擾SIRT1的表達能顯著抑制肝癌干細胞的增殖能力。同時,將感染Lv-sh-SIRT1或Lv-sh-Scramble慢病毒72h后的三種肝癌干細胞分別計數200個接種于24孔板(設置3個重復),培養14天后觀察克隆形成能力,分別計數克隆形成數,結果如圖6所示。結果表明,轉染Lv-sh-SIRT1慢病毒的三種肝癌干細胞細胞所成的克隆大小數目(11.3±1.5%)明顯小于對照細胞(32.2±0.6%),且兩者差異顯著(PLC/PRF/5:P<0.0002;Huh7:P<0.0012;T1224:P<0.0218),表明下調SIRT1的表達會降低肝癌干細胞克隆形成能力。

為進一步研究下調SIRT1的表達對肝癌干細胞成球能力的影響,我們分別將感染Lv-sh-SIRT1或Lv-sh-Scramble慢病毒72h后的三種肝癌干細胞分別計數10個細胞接種于96孔板,設置8個重復,培養12天觀察肝癌干細胞成球能力。通過顯微鏡觀察及計數,結果如圖7所示。結果發現,在肝癌干細胞中下調SIRT1表達的成球數目(平均數為10.2±1.5%)與對照組細胞相比成球體積小且數目少(平均數為29.0±0.7%),且兩者差異顯著(PLC/PRF/5:P<0.0003;Huh7:P<0.0212;T1224:P<0.0349),說明下調SIRT1表達能夠抑制細胞的成球生長能力。以上研究結果表明下調SIRT1的表達顯著降低了肝癌干細胞的自我更新能力。

4.在NanogPos肝癌干細胞中,下調SIRT1的表達對肝癌干細胞皮下移植瘤生長能力的影響

利用分離的PLC/PRF/5細胞系NanogPos細胞分別感染1×106數量的Lv-sh-SIRT1和Lv-sh-Scramble慢病毒,然后接種于免疫缺陷NOD/SCID皮下建立皮下移植瘤模型,注射時用戊巴比妥鈉腹腔麻醉NOD/SCID鼠,然后進行皮下注射。接種感染慢病毒細胞后2周,每2日觀察NOD/SCID鼠的腫瘤生長狀態,記錄小鼠生長情況、成瘤率、測量腫瘤生長狀況(大小)。接種感染慢病毒細胞4-9周后依次處理小鼠,照相,收集移植瘤,并測量腫瘤體積和重量,一部分保存液氮灌,一部分提取組織蛋白,剩余組織用4%多聚甲醛固定,并進行石蠟包埋切片。

接種感染慢病毒細胞4周時,脫頸法處死小鼠,分離腫瘤,然后進行觀察,其結果如圖8A所示。結果顯示,與對照組和空白組相比,轉染Lv-shSIRT1慢病毒的小鼠腫瘤體積明顯減小。然后統計接種感染慢病毒的NanogPos細胞在接種后26天內腫瘤體積和重量,并根據結果繪制時間點移植瘤體積和腫瘤生長曲線,結果如圖8B和圖8C所示。此結果同樣證明了轉染Lv-shSIRT1慢病毒后,在NOD/SCID小鼠體內形成腫瘤生長速度和體積明顯減少。上述結果表明了干擾SIRT1表達能夠抑制肝癌干細胞的自我更新能力和腫瘤生長。

取接種感染慢病毒細胞4周的腫瘤組織,分別進行H&E染色和免疫組化檢測SIRT1和ki67的表達,結果如圖9所示。由圖可知,對照組高表達SIRT1和Ki67,干擾SIRT1表達后表達SIRT1和Ki67表達量顯著降低。

按照與上述相同的方法,在NOD/SCID小鼠皮下每點分別接種1×102、1×103和1×104不同數量級的感染Lv-sh-SIRT1和Lv-sh-Scramble慢病毒的NanogPos細胞,接種9周后統計成瘤數目,然后利用在線軟件,計算其中具有成瘤的細胞比例,其結果圖10所示。結果顯示,干擾SIRT1表達后,每一個皮下移植瘤需要16927個肝癌干細胞;而對照組僅需要1350個肝癌干細胞,兩者之間具有顯著性差異(p=4.52e)。

為進一步證實干擾SIRT1表達能夠抑制肝癌干細胞的自我更新能力和腫瘤生長,利用分離的PLC/PRF/5細胞系NanogPos細胞分別感染1×106數量的Lv-sh-SIRT1和Lv-sh-Scramble慢病毒,然后接種于免疫缺陷NOD/SCID肝臟分別建立肝癌原位移植瘤模型。接種感染慢病毒細胞后,檢測對NOD/SCID小鼠生存時間的影響,結果如圖11所示。由圖11可知,與對照組相比,干擾SIRT1后能夠明顯增加NOD/SCID小鼠的存活時間。以上實驗結果提示,干擾SIRT1的表達明顯抑制了肝癌干細胞體內的成瘤能力并延長NOD/SCID小鼠的生存時間。

五、在NanogNeg的非肝癌干細胞中上調SIRT1的表達對非肝癌干細胞的影響

1.Ad-SIRT1及AD-GFP腺病毒擴增

用5mL的T25Flask培養瓶鋪HEK293細胞,培養液為含10%FBS的DMEM,然后在37℃、5%CO2培養箱培養,等到細胞匯合至70%時,更換培養液,然后在不同培養瓶中分別加入2μLAd-SIRT1腺病毒原液(Ad-SIRT1腺病毒原液由朱衛國教授惠贈)和Ad-GFP腺病毒原液,再繼續在37℃,5%CO2培養箱繼續培養3-5天,鏡下觀察感染病毒的HEK293細胞(由于受病毒感染,HEK293細胞變圓,成串浮起,出現細胞病變效應(cytopathic?effect,CPE),可形成空斑),然后將感染病毒的HEK293細胞從37℃,5%CO2培養箱取出放到-80℃冰箱冷凍,再放到37℃解凍,反復凍融3次,使細胞裂解,釋放腺病毒,經超速低溫離心機在10000r/pm條件下離心30min后,用4.5μm的濾膜過濾,收集上清液,分裝到1mLEP管,-80℃低溫冰箱保存,備用。

2.在NanogNeg的非肝癌干細胞中感染Ad-SIRT1或Ad-GFP腺病毒

分別取PLC/PRF/5和Huh7細胞,通過流式細胞分選NanogNeg的非肝癌干細胞,并接種在6孔板內,37℃,5%CO2培養箱培養,待細胞長至5×105時,吸出孔內液體,換無血清的DMEM培養液,然后每孔以10個MOI值加入Ad-SIRT1或Ad-GFP腺病毒,然后在37℃,5%CO2培養箱培養,2小時后,吸出孔內液體,更換含10%FBS的DMEM培養液繼續培養,培養48小時或72小時后即可檢測目的基因的表達或進行后續實驗。

3.檢測上調SIRT1的表達后NanogNeg對非肝癌干細胞的影響

提取的Ad-SIRT1腺病毒感染和對照Ad-GFP腺病毒感染的HEK293細胞的蛋白,然后利用western?blot方法檢測感染72h?SIRT1蛋白的表達量,同時以GAPDH蛋白為內參,檢測方法同上,檢測結果如圖12所示。由圖12可知,相對于感染Ad-GFP腺病毒,在非肝癌干細胞中感染Ad-SIRT1后SIRT1蛋白表達水平顯著性地上調。

為了進一步研究SIRT1在非肝癌干細胞中的作用,檢測經感染病毒72h后的NanogNeg克隆形成、成球能力。具體方法為:通過流式細胞儀計數200個感染病毒的NanogNeg接種在24孔板,設置3個重復,培養14天統計細胞克隆數量和細胞成球能力,結果如圖13所示。結果顯示,在NanogNeg的非肝癌干細胞中,過表達SIRT1所成的克隆比對照細胞要大,而且克隆形成率顯著上調(PLC/PRF/5:P<0.048;Huh7:P<0.004),說明在NanogNeg的非肝癌干細胞中過表達SIRT1能顯著促進克隆形成的能力。對細胞成球能力的統計結果表明,相比于對照細胞,利用腺病毒過表達SIRT1,能夠上調NanogNeg非肝癌干細胞的成球能力(PLC/PRF/5:P<0.033;Huh7:P<0.027)。以上研究結果表明,過表達SIRT1能夠促進NanogNeg非肝癌干細胞的克隆形成和成球能力。

為了進一步研究SIRT1對NanogNeg非肝癌干細胞體內生長成瘤能力的影響,在PLC/PRF/5NanogNeg非肝癌干細胞中分別感染Ad-SIRT1或Ad-GFP以及肝癌干細胞中感染shScramble,72h后將感染腺病毒或慢病毒的細胞接種到NOD/SCID小鼠檢測其對腫瘤瘤形成能力的影響,結果如圖14所示。結果顯示,在NOD/SCID小鼠皮下接種相同數量的shScramble、Ad-GFP以及Ad-SIRT1成瘤率分別為:100%(10/10)、70%(7/10)和100%(10/10)(圖14A);然后統計感染后成瘤重量和體積,成瘤重量分別為:0.32414±0.20g;0.08445±0.078g;0.40645±0.20g(圖14B),腫瘤體積分別為0.061±0.11cm3;0.016±0.01cm3;0.04±0.05cm3(圖14C)。以上結果表明在NanogNeg的非肝癌干細胞中過表達SIRT1,能夠顯著上調非肝癌干細胞的成瘤率和移植瘤的體積及重量。

綜上所述,組蛋白去乙酰化酶SIRT1在肝癌干細胞自我更新中具有重要作用。因此,SIRT1在肝癌干細胞自我更新調控中的作用機制,對于加深肝癌干細胞的認知以及開發新的靶向性藥物具有重要意義。

最后說明的是,以上優選實施例僅用以說明本發明的技術方案而非限制,盡管通過上述優選實施例已經對本發明進行了詳細的描述,但本領域技術人員應當理解,可以在形式上和細節上對其作出各種各樣的改變,而不偏離本發明權利要求書所限定的范圍。

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本文標題:干擾SIRT1表達試劑在制備抑制肝癌干細胞自我更新的藥物中的應用.pdf
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