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干擾素調節因子9(IRF9)及其抑制劑在腦卒中疾病中的應用.pdf

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干擾素 調節 因子 IRF9 及其 抑制劑 腦卒中 疾病 中的 應用
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摘要
申請專利號:

CN201410032151.5

申請日:

20140123

公開號:

CN103751803B

公開日:

20160210

當前法律狀態:

有效性:

有效

法律詳情:
IPC分類號: A61K48/00,A61K39/395,A61P9/10,A61P25/00,C12Q1/68 主分類號: A61K48/00,A61K39/395,A61P9/10,A61P25/00,C12Q1/68
申請人: 武漢大學
發明人: 李紅良,鞏軍,向梅,郭森,盧燕云,蔣曦
地址: 430072 湖北省武漢市武昌區珞珈山武漢大學
優先權: CN201410032151A
專利代理機構: 武漢科皓知識產權代理事務所(特殊普通合伙) 代理人: 張火春
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法律狀態
申請(專利)號:

CN201410032151.5

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法律狀態公告日:

法律狀態類型:

摘要

本發明公開一種IRF9在腦卒中疾病中的功能及其抑制劑的應用,屬于基因的功能與應用領域。本發明以IRF9基因敲除小鼠和腦袋特異性IRF9轉基因小鼠為實驗對象,通過大腦中動脈缺血再灌注模型,結果表明與野生型C57小鼠對比,IRF9基因敲除小鼠腦袋梗死體積明顯被抑制,神經功能也明顯好轉,而神經特異性IRF9轉基因小鼠的梗死體積則明顯增加,且神經功能明顯惡化。因此,IRF9基因具有惡化神經系統功能的作用,特別是IRF9基因能夠惡化腦卒中疾病的作用。針對IRF9的上述功能,提供IRF9作為腦卒中疾病治療的藥物靶標在研制腦卒中疾病藥物中應用。

權利要求書

1.一種干擾素調節因子9作為藥物靶標在篩選治療腦卒中疾病藥物中的應用。2.根據權利要求1所述的應用,其特征在于:所述的篩選治療腦卒中疾病藥物,是指篩選能夠抑制干擾素調節因子9基因表達的藥物。

說明書

技術領域

本發明屬于基因的功能與應用領域,特別涉及一種干擾素調節因子interferonregulatoryfactor9(IRF9)及其抑制劑在腦卒中疾病中的應用。

背景技術

缺血性腦卒中目前是全球第四大致死因素及第二大致殘因素,其發后數分鐘至數小時內即出現不可逆轉的腦損傷,對患者的生命和健康造成嚴重危害。神經元細胞是中樞神經系統重要的組成部分,但其高代謝率降低了對缺血缺氧環境耐受能力,因此較其他神經血管元件組分更易受到損傷。目前組織纖溶酶原激活劑(tPA)纖溶的治療仍是缺血性腦卒中的主要治療手段,但其僅4.5小時長的時間窗限制大部分患者只能接受對癥治療。研究表明,神經元保護策略可以在腦缺血損傷后較長時間內改善大腦功能,減少神經元細胞損失。凋亡是大腦缺血/再灌注過程中細胞死亡的基本機制之一,但其調控機制仍未完全闡明。因此,研究大腦缺血/再灌注時神經元細胞凋亡生存的分子機制,將有助于為神經元保護提供新的治療策略和方法。

多數研究認為,恢復腦組織供血是治療腦缺血最有效的方法。盡管1996年起組織纖溶酶原激活劑(tPA)即批準用于缺血性腦卒中治療,迄今為止其仍然是美國藥監局(FDA)唯一審核通過的溶栓藥物。因為隨時間延長出血風險增加,tPA的治療時間窗僅為4.5小時;考慮到缺血性和出血性腦卒中在早期影像學不易鑒別,進一步延誤了患者接受tPA治療的機會。目前只有小于5%的缺血性腦卒中患者使用tPA溶栓治療。此外,研究發現腦組織如果長時間嚴重缺血缺氧,即使在后期恢復腦血流仍會對腦組織造成不可逆轉的損傷,因此當前仍迫切需要研究針對缺血缺氧和(或)再灌注所致病理生理學事件的治療策略。自20世紀90年代以來,研究保護神經和腦組織的治療策略一直是腦卒中治療的熱點,這些策略不僅可以延長tPA的治療時間窗,也可以減輕缺血再灌注誘導的腦組織損傷。多種神經保護藥物已在動物實驗中取得了令人振奮的結果,但是進入腦卒中3期臨床實驗后,絕大部分藥物均未取得預期效果,其首要失敗的原因之一是大部分已知神經保護機制作用于在卒中后4-6小時以內,而臨床實踐中很難在如此短暫的時間窗內實施治療,因此進一步闡明卒中發生后較長一段時間內促進或保護腦組織損傷的分子機制對于研究有效的卒中治療靶點或者策略具有重要意義。

干擾素調節因子(interferonregulatoryfactor,IRF)家族現已發現有10個成員,其組成為IRF1~IRF10。現有的研究提示,IRF家族成員參與了廣泛的生物學過程,主要涉及天然免疫和獲得性免疫反應,調控細胞生長及生存、凋亡和增殖,參與造血,抗腫瘤形成等。IRF9又稱為P48,干擾素刺激基因因子(IFN-stimulatedgenefactor3γ,ISGF3γ)。目前有IRF9的研究主要集中在抗病毒,IRF-9和HBV干擾素刺激應答元件樣結構域結合后,其表達迅速上調可以增強IFN-α誘導的HBVmRNA水平的顯著抑制。最近有報道,小鼠在IRF9基因敲除(Knockout,KO)后,表現為增加小腸粘液和淋巴結里的T細胞及中性粒細胞數目,這提示IRF9與炎癥有著密切聯系。(LohoffM等,NaturereviewsImmunology.2005;5(2):125-35;HondaK等,NaturereviewsImmunology.2006;6(9):644-58.)

發明內容

為解決上述現有技術的缺陷和不足,本發明的首要目的在于提供一種IRF9作為藥物靶標在篩選治療腦卒中疾病的藥物中應用。

本發明的另一目的在于提供一種IRF9的抑制劑在制備治療腦卒中疾病藥物中的應用。

本發明的目的通過下述技術方案實現:

本發明以IRF9基因敲除小鼠和神經細胞特異性IRF9轉基因小鼠為實驗對象,通過大腦中動脈缺血再灌注模型,結果表明與野生型C57小鼠對比,IRF9基因敲除小鼠腦梗死明顯被抑制,神經功能也明顯好轉,而神經細胞特異性IRF9轉基因小鼠的梗死體積則明顯增加,且神經功能明顯惡化。這提示IRF9基因具有惡化神經系統功能的作用,能惡化腦缺血引起的神經損傷,為研究防治腦缺血的新靶點和新策略提供了理論依據和臨床基礎。

針對IRF9的上述功能,提供一種IRF9作為藥物靶標在篩選治療腦卒中疾病的藥物中應用。

針對IRF9的上述功能,提供一種IRF9的抑制劑在制備治療腦卒中疾病藥物中應用。

一種治療腦卒中疾病的藥物,包含IRF9。

所述的IRF9的抑制劑為IRF9基因的siRNA、IRF9基因的RNA干擾載體或IRF9的抗體中的一種。

本發明相對于現有技術具有如下的優點及效果:

1.本發明發現IRF9基因的新功能,即IRF9基因能夠惡化腦卒中疾病的作用。

2.IRF9在惡化腦卒中疾病中的作用,為研制腦卒中疾病的藥物提供靶標。

附圖說明

圖1是神經特異性IRF9轉基因小鼠的構建及鑒定結果圖

A為神經特異性IRF9轉基因小鼠的構建圖;

B為神經特異性IRF9轉基因小鼠的鑒定結果圖;

圖2是WT和IRF9-KO小鼠的TTC染色結果圖。

A為TTC染色結果圖;

B為腦梗體積統計柱狀圖;

C為神經功能評分統計柱狀圖;

圖3是IRF9-TG和NTG小鼠的TTC染色結果圖。

A為TTC染色結果圖;

B為腦梗體積統計柱狀圖;

C為神經功能評分統計柱狀圖;

圖4是腦組織梗死周邊區神經元細胞凋亡情況測定結果圖。

圖A為FluoroJadeB和TUNEL細胞凋亡檢測顯示圖;

圖B為圖AFluoroJadeB和TUNEL細胞凋亡檢測的統計結果圖;

具體實施方式

下面結合實施例及附圖對本發明作進一步詳細的描述,但本發明的實施方式不限于此。

實驗用動物及飼養

實驗動物:選用11-12周齡、體重在25-30g,背景為雄性C57BL/6品系的野生型小鼠(WT,購自北京華阜康生物科技有限公司,質量合格證號:949431)、IRF9基因敲除小鼠(IRF9-KO,C57BL/6J背景,購買自RIKENBRC公司(BRC編號:RBRC00916))、非轉基因小鼠(NTG,Neuron-specificCretransgenicmice(CaMKIIα-Cre;購自JacksonLaboratory,StockNo.005359))及神經特異性IRF9轉基因小鼠(IRF9-TG,由IRF9-flox小鼠和CaMKIIα-Cre小鼠雜交得到,IRF9-flox小鼠由武漢大學心血管病研究所李紅良教授實驗室構建,IRF9-flox小鼠的構建過程如下文中所述)。

飼養環境:所有實驗小鼠均飼養在武漢大學心血管病研究所SPF級實驗動物中心。小鼠專用飼料由中國軍事醫學科學院動物中心提供。飼養條件:室溫在22-24℃之間,濕度在40-70%之間,明暗交替照明時間為12h,自由飲水攝食。

【實施例1】神經特異性IRF9轉基因小鼠的構建

IRF9-flox小鼠的構建過程:

轉基因載體構建信息:用上游引物,即5’-CCAGATTACGCTGATATGGCATCAGGCAGGGCACG-3’(SEQIDNO.1);下游引物,5’-AGGGAAGATCTTGATTCAGCAGGCTCTACACAGGG-3’(SEQIDNO.2),擴增小鼠IRF9全長基因(NCBI,GeneID:16391,NM_001159417.1),把cDNA插入pCAG-CAT-LacZ載體,這個載體包含一個CMV增強子和一個雞的β-actin基因(CAG,chickenβ-actingene)的啟動子,并且連接到氯霉素乙酰轉移酶基因(CAT,chloramphenicolacetyltransferase),loxP位點位于CAT兩側,神經細胞IRF9的表達由CAG啟動子驅動得到(圖1A)。IRF9-floxed小鼠:將構建的pCAG-IRF9-CAT-LacZ載體通過顯微注射構造成受精胚胎(C57BL/6J背景),得到IRF9-floxed小鼠。神經元特異性IRF9轉基因小鼠通過IRF9-flox小鼠和CaMKIIα-Cre小鼠(非轉基因小鼠NTG)雜交繁殖得到。

轉基因小鼠通過剪尾巴取基因組DNA,使用PCR鑒定,PCR鑒定引物信息為:檢測正向引物5’-CCAGATTACGCTGATTGTGACCGGAACGGCGGGCG-3’(SEQIDNO.3),檢測反向引物5’-AGGGAAGATCTTGATTTAGACGGTGATCTGTTGAT-3’(SEQIDNO.4)。通過蛋白質印跡法(WesternBlot)實驗鑒定不同轉基因鼠腦袋中IRF9蛋白的表達量:提取不同轉基因鼠腦組織蛋白,通過聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE),驗證IRF9過表達(圖1B)。

為進一步研究IRF9過表達對于腦缺血/再灌注損傷的影響,我們構建了幾株神經特異性IRF9轉基因小鼠(IRF9-TG)。為了反映病理生理狀態下IRF9的改變,我們選擇了IRF9-TG3小鼠,WesternBlot及定量分析顯示,其腦組織中IRF9表達量約為正常組織4.3倍。

【實施例2】小鼠腦梗死模型(I/R)獲得

1.實驗動物分組:雄性C57BL/6品系野生型小鼠、IRF9基因敲除小鼠及腦袋特異性IRF9轉基因小鼠和非轉基因小鼠,通過大腦中動脈缺血再灌注建立腦梗死模型(I/R)。隨機分為8組,每組10只小鼠:C57BL/6品系野生型小鼠假手術組(WTSHAM)及I/R術組(WTI/R)、IRF9基因敲除小鼠假手術組(KOSHAM)及I/R術組(KOI/R)、非轉基因小鼠假手術組(NTGSHAM)及I/R術組(NTGI/R)、神經細胞特異性IRF9轉基因小鼠假手術組(TGSHAM)及I/R術組(TGI/R)。

2.線栓法腦梗死I/R手術采用MCAO(middlecerebralarteryocclusion,大腦中動脈閉塞)模型操作流程:

(1)抓取小鼠,使用3%異氟烷麻醉小鼠,8%硫化鈉脫去頸部的鼠毛,顱頂鼠毛用手術剪迅速剪掉,3%活力碘消毒頸部及顱頂皮2次,75%酒精脫碘1次;

(2)在小鼠的顱頂部位橫向切口,暴露顱骨,用鑷子輕輕剝離顱骨表面的結締組織。將激光多普勒血流儀的光纖探頭用生物膠固定在前囟后方2mm,左側5mm的部位;

(3)將小鼠仰臥固定,頸正中線切口,沿胸鎖乳突肌內緣分離肌肉和筋膜,分離左側頸總動脈(CCA)、頸外動脈(ECA)和頸內動脈(ICA)。在ECA遠心端用8-0線結扎,ECA近心端處掛線備用。用微動脈夾暫時夾閉ICA、CCA;然后在ECA遠心端結扎和近心端掛線中間剪一小口,將線栓由剪口送入到CCA,并將ECA近心端的掛線在剪口處打一活結,松緊度以線栓可自由進出但略帶摩擦感為宜,再松ICA動脈夾,將線栓送入ICA,從血管分叉處開始算距離,當插入深度在9-11mm左右至血流下降遇阻力停。這時將繞在ECA近心端處活結輕輕系牢拴線,整個過程必須維持小鼠的肛溫在37±0.5℃;

(4)從線栓進入腦血管至血流下降遇阻力停時開始計時,45min后先松開ECA近心端處活結,將線栓拔出,并將ECA近心端處活結扎緊,迅速松開CCA處動脈夾,并將ECA近心端結扎(Sham組在從線栓進入腦血管至血流下降遇阻力時抽出線栓)。注意觀察血流恢復情況,選擇血流下降75%以上,血流恢復達70%以上的小鼠納入實驗;

(5)縫合小鼠頸部及頭部皮膚,并用活力碘消毒傷口。手術結束后,將小鼠放在溫箱中,箱溫維持在28℃,給水和飼料至取材。

【實施例3】腦梗死模型(I/R)小鼠腦梗死體積測定

腦缺血/再灌注損傷嚴重程度的評估指標主要包括大腦梗死體積和神經功能評分,這些指標均與缺血/再灌注損傷嚴重程度正相關。

(1)分別在手術后24h,72h,7d取材前進行神經功能及行為學評分;

基于Berderson神經功能評分改進方法(9分制):

0分:無神經受損的癥狀;

1分:提尾時對側前肢蜷曲,或者不能完全到達患側前肢;

2分:提尾時對側肩膀內收;

3分:平推:向對側推動時阻力下降;

4分:可自發的向各個方向運動,但在脫尾巴時只向對側轉彎;

5分:自發運動時轉圈或只向對轉;

6分:無自主運動,只在刺激時運動;

7分:無自主運動,刺激時也無運動;

8分:與腦缺血有關的死亡。

(2)抓取小鼠,腹腔注射3%戊巴比妥鈉麻醉小鼠,剪開小鼠胸腔,剪破心臟放血;

(3)體積分數75%酒精消毒后頸部皮膚,剪開后頸部皮膚,暴露頭及頸部,從頸椎處剪斷頸髓,分離除去后頸部肌肉,眼科剪縱向剪開腦干小腦外顱骨,用紋齒鉗剝開顱骨,分離大腦表面的硬腦膜,避免硬腦膜劃傷腦組織。取腦時從延髓開始,小心分離顱底組織,避免損傷大腦;

(4)將取下的腦組織放入裝有PBS的培養皿中潤洗,用紗布吸干PBS,將腦組織放入1mm小鼠腦模,置于-20℃冰箱凍存(不超過4h);

(5)腦組織2,3,5-三苯基氯化四氮唑(2,3,5-Triphenyltetrazoliumchloricej,TTC)染色:從-20℃冰箱取出腦組織,立即切成1mm厚的切片,包括前囟前方切4片,后方切3片,共切7片。將切片立即置于10ml2%TTC溶液的血清瓶中,37℃恒溫孵育10min。不時翻動切片,使組織均勻染色。正常腦組織染色后呈鮮紅色,而梗死區呈蒼白色;

(6)腦組織固定:將燒杯里的腦組織及溶液一同轉入做好標記的杯中,棄去TTC溶液,用10%中性福爾馬林溶液固定腦組織切片,24h后拍照并用IPP軟件分析;

(7)腦梗體積計算:梗死體積%=(對側大腦半球體積-梗死側未梗死體積)/(對側大腦半球體積×2)×100%;

總梗死體積為各自7張腦片結果數據之和。

TTC是脂溶性光敏感復合物,它是呼吸鏈中吡啶—核苷結構酶系統的質子受體,與正常組織中的脫氫酶反應而呈紅色,而缺血組織內脫氫酶活性下降,不能反應,故不會產生變化呈蒼白色。

TTC染色結果如圖2所示,經過I/R缺血45min再灌注24小時后IRF9-KO小鼠梗死體積較野生型小鼠降低;且這種保護作用在I/R術后72小時、7天仍然持續,腦組織梗死比野生型小鼠均低,而神經功能評分在I/R術后24小時、72小時和7天均改善。

如圖3所示,經過I/R缺血45min再灌注24小時后IRF9-TG小鼠梗死體積較野生型小鼠明顯加重;且這種惡化作用在I/R術后72小時仍然持續,腦組織梗死比野生型小鼠均高。而神經功能評分在I/R術后24小時和72小時均惡化。

【實施例4】腦組織梗死周邊區神經元細胞凋亡情況測定

1.腦組織冰凍切片制備

1)實驗小鼠按50mg/kg劑量腹腔注射戊巴比妥鈉麻醉;

2)開胸暴露心臟,用注射針頭穿刺如左心室,同時剪開右心房;

3)用0.1mol/LμPBS(pH7.4)100mmHg壓力灌流至肝臟變蒼白后,用4%多聚甲醛灌流15min;

4)開顱迅速取出小鼠大腦,室溫4%多聚甲醛后固定6-8h;

5)切除腦組織的嗅球和小腦,再延正中線將大腦分為先后兩個部分,用先前的固定液再固定15min;

6)隨后浸沒于含30%蔗糖的磷酸鹽緩沖液中,4℃冰箱沉底過夜;

7)30%蔗糖與OCT按1:1混合后,倒適量到包埋框中,將前一步的組織取出,在紗布上吸去液體后在該包埋框中浸泡一會兒,再將其轉入到先已加入2滴OCT的另一個包埋框中,調整組織的位置,使其正好位于包埋框的正中;

8)將盛組織的包埋框,移入干冰中,盡量使其處于水平位,稍待一會兒后,繼續加入OCT,浸沒組織一定的高度,待OCT凝固后,將其儲存于-80℃的冰箱中;

9)用冰凍切片機的標準程序切5μm的冰凍切片備用。

2.TUNEL試劑盒染色檢測凋亡。

用TUNEL試劑盒染色檢測凋亡。(TUNEL試劑盒:ApopTag?PlusInSituApoptosisFluoresceinDetectionKit(S7111,Chemicon)):

1)將冰切組織切片置于(pH7.4)1%的多聚甲醛中,室溫固定水解10分鐘;

2)PBS洗兩次,每次5min;

3)置于預冷的乙醇:乙酸(2:1)溶液中,-20℃浸泡5分鐘,去除多余液體,但注意不要干燥;

4)PBS洗兩次,每次5min;

5)濾紙小心吸去多余液體,立即在切片上按75μL/5cm2直接加入平衡緩沖液,室溫孵育1-5min;

6)濾紙小心吸去多余液體,立即在切片上按55μL/5cm2直接加入TdT酶反應液,置于避光保濕盒中作用1h(陰性對照加入不含TdT酶的反應液);

7)將切片置于終止/洗滌緩沖液中,輕輕搖動15sec,室溫孵育10min;此時準備適量抗地高辛抗體,預熱至室溫,注意避光;

8)PBS洗三次,每次1min;

9)濾紙小心吸去多余液體,直接在切片上按65μL/5cm2加入抗地高辛抗體,室溫下于避光保溫濕盒中作用1h;

10)PBS洗四次,每次2min;

11)SlowFadeGoldantifadereagentwithDAPI(Invitrogen,S36939)封片;

12)在熒光顯微鏡下觀察計數凋亡神經元細胞。

3.FJB(FluoroJadeB)染色

1)將冰切組織切片在烘箱中烘干1小時;

2)1%NaOH+80%無水乙醇5min;

3)70%無水乙醇2min;

4)ddH2O2min;

5)FlouroJadeB稀釋液(AG310,Millipore,Billerica,MA),室溫,避光20min;

6)ddH2O1minX3;

7)在烘箱中烘片5-10min;

8)二甲苯>1min;

9)封片,拍照。

腦組織梗死周邊區神經元細胞凋亡情況測定結果見圖4所示,我們檢測了IRF9-KO小鼠和野生型小鼠I/R術后24小時腦組織梗死周邊區神經元細胞凋亡情況。FluoroJadeB和TUNEL細胞凋亡檢測顯示,IRF9-KO組小鼠的凋亡細胞數量明顯比WT組小鼠少,而IRF9-TG組小鼠的凋亡細胞數量明顯比NTG組小鼠多。進一步提示IRF9與神經元細胞缺血/再灌注時死亡相關。這些結果表明,抑制IRF9表達可以改善腦組織缺血/再灌注損傷,且可能與神經元細胞凋亡密切相關。

我們的研究成果表明,IRF9KO小鼠在大腦中動脈缺血再灌注引起的損傷中,我們發現IRF9敲除后,小鼠梗死體積顯著減少,神經功能明顯改善,神經細胞凋亡也明顯減少。證明IRF9基因在腦卒中疾病模型中有著重要的惡化作用。

上述實施例為本發明較佳的實施方式,但本發明的實施方式并不受上述實施例的限制,其他的任何未背離本發明的精神實質與原理下所作的改變、修飾、替代、組合、簡化,均應為等效的置換方式,都包含在本發明的保護范圍之內。

SEQUENCELISTING

<110>武漢大學

<120>干擾素調節因子9(IRF9)及其抑制劑在腦卒中疾病中的應用

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<212>DNA

<213>Artificial

<223>IRF9上游引物

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ccagattacgctgatatggcatcaggcagggcacg35

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<212>DNA

<213>Artificial

<223>IRF9下游引物

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<210>3

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<212>DNA

<213>Artificial

<223>檢測正向引物

<400>3

ccagattacgctgattgtgaccggaacggcgggcg35

<210>4

<211>35

<212>DNA

<213>Artificial

<223>檢測反向引物

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