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用于預防和/或治療人中的HIV疾病的藥物組合物.pdf

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用于 預防 治療 人中 HIV 疾病 藥物 組合
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摘要
申請專利號:

CN201280026590.4

申請日:

20120406

公開號:

CN103732248A

公開日:

20140416

當前法律狀態:

有效性:

有效

法律詳情:
IPC分類號: A61K39/09,A61K39/21,A61K39/295,A61P31/18 主分類號: A61K39/09,A61K39/21,A61K39/295,A61P31/18
申請人: 拜歐瓦克西姆有限公司,巴黎笛卡爾大學,發育研究院
發明人: J-M·安德里厄,L·盧
地址: 英國倫敦
優先權: 61/534,088,61/609,051
專利代理機構: 北京戈程知識產權代理有限公司 代理人: 程偉
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法律狀態
申請(專利)號:

CN201280026590.4

授權公告號:

法律狀態公告日:

法律狀態類型:

摘要

本發明涉及包含特異性HIV抗原和非致病活細菌的混合物的藥物組合物。所述特異性HIV抗原包括一個或多個來自Gag和/或Pol蛋白的表位,且優選其在特定的形式下。所述細菌優選是植物乳桿菌(Lactobacillus?plantarum)。這些組合物對預防和/或治療人中的HIV疾病是有用的。

權利要求書

1.一種藥物組合物,其包含顆粒抗原和非致病細菌的混合物。2.根據權利要求1所述的藥物組合物,其中所述抗原具有一個或多個來自HIV?Gag和/或Pol蛋白的表位。3.一種藥物組合物,其包含具有一個或多個來自HIV?Gag和/或Pol蛋白表位的抗原和非致病細菌的混合物。4.根據權利要求3所述的藥物組合物,其中所述抗原是顆粒抗原。5.根據權利要求1至4任一項所述的藥物組合物,其中所述抗原至少大約110kDa大小。6.根據權利要求1至5任一項所述的藥物組合物,其中所述顆粒抗原選自病毒顆粒、病毒樣顆粒、重組病毒顆粒、綴合的病毒蛋白和多聯體病毒蛋白。7.根據權利要求6所述的藥物組合物,其中所述重組病毒顆粒或所述病毒顆粒是失活的。8.根據權利要求2至7任一項所述的藥物組合物,其中所述來自HIV?Gag蛋白的表位選自來自衣殼蛋白(p24)的表位和來自基質蛋白(p17)的表位。9.根據權利要求2至7任一項所述的藥物組合物,其中所述來自HIV?Pol蛋白的表位選自來自整合酶的表位、來自逆轉錄酶的表位和來自蛋白酶的表位。10.根據權利要求1至9任一項所述的藥物組合物,其中所述細菌是活的。11.根據權利要求1至10任一項所述的藥物組合物,其中所述細菌選自減毒的致病細菌、失活的(任選地,也是減毒的)致病細菌和非致病乳酸菌。12.根據權利要求11所述的藥物組合物,其中所述細菌是乳桿菌。13.根據權利要求12所述的藥物組合物,其中所述細菌是植物乳桿菌。14.根據權利要求6至13任一項所述的藥物組合物,其中所述顆粒抗原是病毒顆粒,且其中病毒顆粒的量是每ml所述混合物大約10至大約10。15.根據權利要求1至14任一項所述的藥物組合物,其中所述細菌的量是每ml所述混合物大約10至大約10CFU。16.根據權利要求6至15任一項所述的藥物組合物,其中所述顆粒抗原是病毒顆粒,且其中所述混合物中所述病毒顆粒對所述細菌的比是大約1:10至大約1:1000,優選大約1:100。17.根據權利要求1至16任一項所述的藥物組合物,其是粘膜的或皮內的或上皮內的藥物組合物。18.根據權利要求17所述的藥物組合物,其是口服藥物組合物。19.根據權利要求1至18任一項所述的藥物組合物,其用于預防和/或治療有需要的人中HIV疾病的方法中。20.根據權利要求1至18任一項所述的藥物組合物,其用于保護人免受HIV的方法中。21.根據權利要求1至18任一項所述的藥物組合物,其用于保護人免受HIV血清轉化的方法中。22.根據權利要求19至21任一項所述的藥物組合物,其中所述顆粒抗原是病毒顆粒,其中向所述人每天施用大約10至大約10個病毒顆粒的劑量。23.根據權利要求19至22任一項所述的藥物組合物,其中向所述人每天施用大約10至大約10CFU所述細菌的劑量。24.根據權利要求1至23任一項所述的藥物組合物,其誘導和優選地維持人中對抗HIV的抗原特異性免疫保護。25.根據權利要求24所述的藥物組合物,其中所述免疫保護的特征在于降低和優選地抑制所述人中的HIV病毒載量。26.根據權利要求24或25所述的藥物組合物,其中所述免疫保護的特征在于由CD8+調節性T細胞抑制所述人中HIV?Gag和/或Pol抗原提呈CD4+T細胞的激活。27.根據權利要求26所述的藥物組合物,其中在所述人中通過體外檢測來自所述人的CD8+調節性T細胞的存在或活性確定所述免疫保護。28.根據權利要求26或27所述的藥物組合物,其中所述CD8+調節性T細胞是MHC-1b/E限制的CD8+調節性T細胞。29.根據權利要求2至28任一項所述的藥物組合物,其中所述HIV是HIV-1或HIV-2。30.一種用于預防和/或治療有需要的人中HIV疾病的藥物試劑盒,其包含:-在第一容器中的顆粒抗原;和-在第二容器中的非致病活細菌,所述抗原和所述細菌在用于粘膜或皮內或上皮內施用的藥學上可接受的載體中。31.根據權利要求30所述的藥物試劑盒,其中所述抗原具有一個或多個來自HIV?Gag和/或Pol蛋白的表位。32.一種用于預防和/或治療有需要的人中HIV疾病的藥物試劑盒,其包含:-在第一容器中的抗原,所述抗原具有一個或多個來自HIV?Gag和/或Pol蛋白的表位,和-在第二容器中的非致病活細菌,所述抗原和所述細菌在用于粘膜或皮內或上皮內施用的藥學上可接受的載體中。33.根據權利要求32所述的藥物試劑盒,其中所述抗原是顆粒抗原。

說明書

技術領域

本發明涉及含有特異性HIV抗原和非致病細菌的混合物的藥物組合物。所述特異性HIV抗原包括一個或多個來自Gag和/或Pol蛋白的表位,且優選其在顆粒(particulate)的形式下。所述細菌優選是植物乳桿菌(Lactobacillus?plantarum)。這些組合物對預防和/或治療人中的HIV疾病是有用的。?

背景技術

在發現人免疫缺陷病毒(HIV)后超過25年,來自世界衛生組織和HIV/AIDS的聯合國聯合計劃的最新預測(projection)表明,如果大流行以目前的速度進展,到2011年將有超過3千萬人感染。?

但是,盡管為了發現對預防HIV感染有效的治療作出大量的研究努力,目前兩種測試的預防性疫苗或者失敗(Mc?Elrath等人,2008)或者產生中度效果(Rerks-Ngarm等人,2009)。?

Jae-Sung?Yu等人(Clinical?and?Vaccine?Immunology,2006十一月,13卷,No.11,1204-1211)描述了重組包皮垢分枝桿菌(Mycobacterium?smegmatis)載體,其構建用于表達作為表面、細胞內或分泌蛋白的M組HIV-1共有env基因CON6。作者能證明在小鼠中,重組包皮垢分枝桿菌(M.smegmatis)對在粘膜表面誘導HIV-1T細胞反應是免疫原性的。?

Ke-Qin?Xin等人(Blood,2003六月1,102卷,No.1,223-228)描述了在其細胞表面表達HIV-1Env?V2-V4環的重組乳酸乳球菌(Lactococcus?lactis)載體。用該載體口服免疫小鼠誘導:?

-粘膜和體液免疫反應,如通過檢測到高水平的HIV特異性血清IgG和排泄物IgA抗體所表明的;和?

-細胞免疫反應,如通過HIV特異性IFNγ分泌細胞的數量增加所表明的。?

為了在乳酸乳球菌(L.lactis)細胞表面正確表達,可以使用1kb或小于1kb的基因片段(segment)。?

大多數參與HIV發病機理和預防的科學家感覺在測試用于預防或治療人類HIV感染的HIV預防性疫苗或其它生物組合物之前,在非人的靈長目中測試其對應物將更有建設性意義(Morgan?C,等人,2008)。選擇的非人靈長目是恒河猴(macaques?rhesus),在獼猴(macaques)中,現在已經確鑿地表明感染猴免疫缺陷病毒(SIV)239的中國來源的獼猴是模擬多數人中HIV感染演化的臨床、病毒學和免疫方面最好的模型(Marcondes?MC等人,2006;Stahl-Hennig?C等人,2007;?Chen?S等人,2008)。?

最后,現在科學界認同,一旦在獼猴中發現抗SIV239有效的預防性生物組合物或疫苗,其應當完全可能成功地適用于人來保護其免受AIDS。?

盡管科學界持久的研究努力,仍然期待預防性和治療性有效的策略戰勝全世界的AIDS流行。?

已經描述了各種細菌具有施用于受試者時的令人感興趣的佐劑性和免疫調節性的特性。尤其是,報道了乳酸細菌促進對免疫系統的耐受作用。?

例如,公布于2006年11月23日,在Stallergenes?S.A名下的WO2006/123230,描述了選自雙歧桿菌(Bifidobacteria)和乳酸細菌的細菌作為免疫原性組合物中的佐劑的用途,其能夠在舌下、經舌、或口服施用于受試者時誘導抗原特異性耐受。建議免疫原性組合物用于治療過敏、自體免疫性疾病、或用于預防移植排斥。?

然而,例如公布于2009年7月30日,在食品和營養高級研究所(Stichting?Top?Institute?Food?and?Nutrition)名下的WO2009/093900,描述了含有大量對數中期乳酸細菌的致耐受性組合物。當施用于受試者時,該組合物誘導非抗原特異性免疫耐受。建議該組合物用于預防、延緩和/或治療與導致組織損傷的炎癥反應相關的病癥或疾病,例如,過敏、自體免疫性疾病、以及腸的炎癥疾病。?

發明內容

令人驚奇地,發明人能夠表明如以下實施例中描述的原始藥物組合物在獼猴中誘導有效的對SIV的抗原特異性免疫保護。而且,當所述SIV特異性免疫保護被誘導時,發明人表明其預防了SIV復制/傳播以及隨后的體內感染的建立。?

實際上,發明人驚奇地表明將文中公開的藥物組合物粘膜地或由皮內或上皮內途徑施用時,顯著地抑制或甚至消除或防止病毒復制。?

實際上,發明人第一次觀察到在獼猴中非細胞毒CD8+T細胞反應抑制SIV抗原提呈的CD4+T細胞的早期激活。因而,不希望束縛于理論,當粘膜或皮內或上皮內施用于受試者時,根據本發明的藥物組合物誘導意想不到的新型病毒特異性免疫耐受。該免疫耐受看起來是HIV?Gag和/或Pol抗原特異性抑制性CD8+T細胞誘導的免疫耐受(文中也命名為“T抑制性”免疫耐受的“Ts”免疫耐受),其是MHC(為“主要組織相容性復合物”)-1b/E限制的和非細胞毒的。?

鑒于文中所報道的結果,本發明提供了一種能夠實現如上所定義的“Ts”免疫耐受的新型藥物組合物,其用于預防和/或治療人的HIV疾病。?

因而,本發明的一個目的是提供含有抗原和非致病活細菌的混合物的藥物組合物,其中,優選所述抗原是顆粒的和/或其具有一個或多個來自HIV?Gag和/或Pol蛋白的表位,且其中所述細菌優選是植物乳桿菌。?

本發明的另一個目的是提供文中所述的藥物組合物,用作疫苗。?

本發明的另一個目的是提供用于預防和/或治療有需要的人的HIV疾病的方?法,其包括至少粘膜地(優選口服)或皮內地或上皮內地將有效量的上述藥物組合物施用于所述人的步驟。?

本發明的又一個目的是提供用于保護人免受HIV的方法,其包括至少粘膜地(優選口服)或皮內地或上皮內地將有效量的上述藥物組合物施用于所述人的步驟。?

本發明的又一個目的是提供用于保護人免受HIV血清轉化的方法,其包括至少粘膜地(優選口服)或皮內地或上皮內地將有效量的上述藥物組合物施用于所述人的步驟。?

本發明的又一個目的是提供用于預防和/或治療有需要的人的HIV疾病的藥物試劑盒,其包含?

-在第一容器中的抗原;和?

-在第二容器中的非致病細菌,?

其中所述抗原和所述細菌在用于粘膜或皮內或上皮內施用的藥學上可接受的載體中,其中優選所述抗原是顆粒的和/或其具有一個或多個來自HIV?Gag和/或Pol蛋白的表位,且其中所述細菌優選植物乳桿菌。?

附圖說明

通過以下的附圖說明本發明,其可參照以下非限制的實施例。?

圖1:用陰道內iSIV/BCG預處理的恒河猴的靜脈內(i.v.)SIVmac239挑戰。?

圖2:用陰道內iSIV/BCG預處理的恒河猴的直腸內(i.r.)SIVmac239挑戰。?

圖3:用陰道內iSIV/BCG預處理的恒河猴的重復SIVmac239挑戰(3次由i.v.和2次由i.r.)。?

圖4:用陰道內iSIV/BCG加皮內加強預處理的恒河猴的靜脈內SIVmac239挑戰。?

圖5:用陰道內iSIV/BCG加皮內加強預處理的恒河猴的直腸內SIVmac239挑戰。?

圖6:用口服iSIV/BCG預處理的恒河猴的直腸內SIVmac239挑戰。?

圖7:從用陰道內iSIV/BCG預處理的恒河猴獲得的CD8+T細胞體外抗病毒活性。?

圖8:從用口服iSIV/BCG預處理的4只恒河猴獲得的CD8+T細胞體外抗病毒活性。?

圖9:通過從用口服iSIV/BCG預處理的4只恒河猴獲得的自體同源(autologous)CD8+T細胞的CD4+T細胞激活的SIV特異性抑制。?

圖10a:取自用iSIV/LP、iSIV或LP預處理的恒河猴的血漿樣品中的抗SIV?IgG抗體滴度。?

圖10b:取自用iSIV/LP、iSIV或LP預處理的恒河猴的PBMC樣品中的SIV?特異性T細胞增殖。?

圖10c:在存在或不存在CD8或CD25T細胞時在體外刺激下SIV特異性IFNγ分泌T細胞。?

圖10d:與用口服LP(n=4)或iSIV(n=3)預處理的動物相比,通過用口服iSIV/LP預處理的8只恒河猴獲得的自體同源CD8+T細胞的CD4+T細胞激活的SIV特異性抑制。?

圖10e:胃內施用iSIV/LP制劑后60天的SIV特異性CD8+T細胞:在CD8+T細胞或存在人自然殺傷細胞(hNK)(對照)的K562存在時,在具有或不具有SEB和抗CD3/CD28刺激時,AT-2SIV脈沖的CD4+T細胞的細胞毒性。?

圖11a:與用口服LP(n=4)或iSIV(n=3)預處理的動物相比,通過用口服iSIV/LP預處理的8只恒河猴獲得的自體同源CD8+T細胞的體外抗病毒活性(在CD4細胞中)。?

圖11b:從口服iSIV/LP處理后80天的8只恒河猴中的4只獲得的異種(heterologous)或同種異體(allogenic)CD8+T細胞的體外抗病毒活性(在CD4細胞中)。?

圖11c-g:口服免疫后60天CD8+T細胞的抗SIV活性,在延緩的(c)、插入(d)、同種異體(e)的培養系統中,在抗MHC-la/ABC或抗MHC-lb/E抗體(f)存在時、以及在去除TCRγδ+或Vβ8+亞群的CD8+T細胞中(g)。?

圖12a:與用口服LP或iSIV預處理的動物相比,用口服iSIV/LP預處理的恒河猴中直腸內和靜脈內SIVmac239挑戰后,血漿的病毒載量水平(每ml血漿的SIV?RNA拷貝)。?

圖12b:與用口服LP或iSIV預處理的動物相比,用口服iSIV/LP預處理的恒河猴中直腸內和靜脈內SIVmac239挑戰后,細胞的病毒載量水平(每100萬PBMC的SIV?DNA拷貝)。?

圖13:通過輸注抗CD8抗體cMT807,去除8只iSIV/LP處理的獼猴的外周血和淋巴結CD8+T細胞。a,在接受三次cMT807注射之前和之后的外周血CD8+T細胞計數;b,在接受三次cMT807注射之前和之后的淋巴結CD8+T細胞%;c,在接受三次cMT807注射之前和之后的血漿病毒載量;d,在接受三次cMT807注射之前之后的PMBC?DNA?SIV載量;e,在接受三次cMT807注射之前和之后的淋巴結SIV?DNA載量。?

圖14:在8只用由iSIV和LP制成的口服制劑免疫的恒河猴和2只另外的未處理()的猴子中用SIVB670直腸內進行第三次直腸內挑戰后,血漿(a)和PBMC(b)的病毒載量。?

圖15:用iSIV和LP胃內免疫后(iSIV/LP免疫No.2),在體外和體內CD8+T細胞介導的抗病毒活性。a,在將被直腸內挑戰的8只恒河猴中,在免疫后的60-420天期間,CD8+T細胞的抗SIV活性(病毒抑制的倍數);b和c,用口服iSIV/LP?免疫的那8只恒河猴和僅用LP(n=4)或僅用iSIV(n=4)處理的8只對照猴中,直腸內SIVmac239挑戰后,血漿和細胞的病毒載量。?

圖16:在8只獼猴(iSIV/LP免疫No.2)中,在SIVmac239直腸內挑戰后,直腸粘膜上皮內淋巴細胞(IPL)中(a-b),固有層(lamina?propria)細胞中(LPC)(c-d)和盆腔淋巴結中(PLN)(e)的SIV?DNA和RNA載量。?

具體實施方式

發明的詳細描述?

本發明涉及包含抗原和非致病活細菌的混合物的藥物組合物。?

抗原?

由于HIV基因組中突變、重組、插入和/或缺失所致的高度變異性,HIV被分類為組、亞組、型、亞型和基因型。有兩個主要的HIV組(HIV-1和HIV-2)和許多亞組,原因是HIV基因組不斷地突變。組和亞組間的主要不同與病毒包膜(envelope)相關。HIV-1被分類為主要的亞組(M),所述亞組M被分類為命名為A到J的9個亞型(分支(clade)或亞型)(Hu等人,JAMA275:210-216,1996;Korber等人,Science280:1868-1871,1998),以及第10個之外的亞組(O)。還存在來自于前一個的體內重組的許多其它亞組(Papathanasopoulos?MA等人,Virus?Genes2003,26:151-163)。優選,HIV病毒是HIV-1或HIV-2,包括所有已知的和至今未知的其分支。然而,優選的是HIV-1。?

在本發明的上下文中,“抗原”來自HIV來源,這意味著其與特異性HIV組、亞組、型、亞型或一些亞型的組合相關。優選地,所述HIV抗原是HIV-1或HIV-2抗原。?

所述抗原是非感染性的。?

很長時間科學界懷疑CD4+T細胞(既是HIV-1又是SIV的主要靶點)的激活直接導致病毒復制(Andrieu和Lu,1995;Korin和Zack,1999)。但是,僅僅在最近,才澄清了CD4+T細胞激活和SIV或HIV感染過程的連續步驟之間的相互作用。在靜態的CD4+T細胞中,在進入后2小時內,跟隨病毒穿透之后的是在質膜上提呈來自進入的病毒粒子的Gag和Pol蛋白表位,而Env和Nef蛋白需要重新合成(Sacha等人,2007)。但是,感染過程隨后的階段,即,病毒整合之后的逆轉錄,在靜態細胞中發展得非常沒有效率(Vatakis等人,2009a和2009b)。相反地,當在質膜上提呈Gag和Pol表位之前或之后的48小時之內激活CD4+T細胞,HIV/SIV逆轉錄和DNA整合完全活化,其允許非常有效的病毒復制和釋放(Vatakis等人,2009a和2009b)。?

因而,發明人假定,在HIV/SIV暴露后,體內特異性阻斷早期發生的HIV/SIV?Gag或Pol特異性CD4+T細胞的激活,將導致防止活化的病毒復制。?

考慮到這一點,為了誘導HIV?Gag和/或Pol抗原提呈CD4+T細胞激活的抑制,?繼而在病毒暴露的人中防止體內HIV復制和傳播,本發明的藥物組合物包含HIV抗原,其優選具有一個或多個來自HIV?Gag和/或Pol蛋白的表位。這樣的抗原有利地或含有或衍生自HIV?Gag和/或Pol。?

因而,術語“含有或衍生自HIV病毒的Gag和/或Pol的抗原”指HIV抗原:?

-包含至少一個Gag和/或Pol(作為“含有Gag和/或Pol的抗原”);或?

-包含一個或多個由GAG,例如衣殼蛋白(p24)和基質蛋白(p17),編碼的蛋白,和/或一個或多個由POL,例如整合酶、逆轉錄酶和蛋白酶,編碼的蛋白(作為“衍生自Gag和/或Pol的抗原”);或?

-包含一個或多個來自這些蛋白的表位(也作為“衍生自Gag和/或Pol的抗原”)。?

特別地,選自如下的任何其它病毒蛋白或其表位不是包含于文中公開的藥物組合物的必要組分:ENV、VIF、VPR、HIV-1的VPU、HIV-2的VPX、REV、NEF、TAT等等。如果存在,這些蛋白的任一個僅僅是用于文中公開的藥物組合物中的任選組分。?

優選抗原是顆粒抗原。這意味著其優選選自病毒顆粒、重組病毒顆粒、病毒樣顆粒、表達Gag和/或Pol的重組細菌或真菌、在其表面提呈一個或多個病毒蛋白或肽或表位(含有或衍生自HIV?Gag和/或Pol)的聚合微顆粒。優選地,一個或多個來自Gag和/或Pol的表位由所述抗原產生或表達或包含于所述抗原。當使用重組病毒顆粒或病毒顆粒或表達Gag和/或Pol的重組細菌或真菌時,其優選是失活的微生物。?

抗原可以是病毒顆粒、重組病毒顆粒、病毒樣顆粒或表達Gag和/或Pol的重組細菌或真菌。其還可以是一個或多個病毒蛋白或肽(含有或衍生自HIV的Gag和/或Pol)、重組的或非重組的、可以是綴合物(conjugate)或多聯體(concatemer)的形式。然后,抗原是病毒核酸非依賴的,即,其是非病毒DNA或非病毒RNA依賴的。?

抗原可以來自有利地包含于適當的重組微生物中的病毒核酸序列的表達。?

如果包含于本發明藥物組合物中的抗原是表達Gag和/或Pol的重組細菌,那么所述重組細菌優選不同于也包含在組合物中的非致病活細菌。?

當根據本發明的藥物組合物中的抗原是一個或多個病毒蛋白或肽(含有或衍生自HIV的Gag和/或Pol)時,其優選是顆粒的形式。實踐中,適當的顆粒抗原,可由活的微生物(例如,酵母),以與重組DNA?B型肝炎疫苗相同的方式生產,在重組DNA?B型肝炎疫苗的情況中,表達的HBsAg多肽自我組裝成免疫原性球形顆粒,其非常類似慢性HBV感染患者血清中發現的天然22-nm顆粒(Plotkin等人,2008)。?

或者,當根據本發明的藥物組合物中的抗原是一個或多個病毒蛋白或肽(含有或衍生自HIV?Gag和/或Pol)時,其是綴合物的形式。在這樣的實施方式中,?如本領域公知的,感興趣的蛋白或肽共價綴合于適當的載體。可商業獲得的常規載體尤其是蛋白,如KLH(鑰孔戚血藍蛋白)蛋白、BSA(牛血清白蛋白)蛋白、OVA(卵清蛋白)蛋白等(優選其可以安全地口服施用于人類)。生產適當的綴合物的方法對本領域技術人員是熟悉的。?

但是,或者,當根據本發明的藥物組合物中的抗原是一個或多個病毒蛋白或肽(含有或衍生自HIV?Gag和/或Pol)時,其是多聯體的形式。如本領域中公知的,多聯體由感興趣蛋白或肽的多個拷貝形成,其在一個大分子中物理連接在一起。在多聯體中,感興趣蛋白或肽的一個拷貝可以直接地或被合成手臂分隔而連接至其它拷貝。因而,多聯體包含至少兩個拷貝,優選多至10個拷貝或更多,的感興趣蛋白或肽。生產適當多聯體的方法屬于本領域技術人員的普通常識。?

如文中使用的,“病毒樣顆粒”(VLP)指非常類似成熟病毒粒子的顆粒,但是其不含有所述病毒的病毒基因組物質。更準確地,VLP,也稱為假病毒粒子,代表由病毒衣殼和/或其它病毒蛋白的多個拷貝組成的亞單元結構。這些病毒蛋白能夠在體內自我組裝成明確的球形對稱的VLP。這些VLP不包含編碼病毒蛋白的任何核酸分子,更準確地,其不包含任何核酸分子。因而,VLP在自然中是非復制且非感染的,這使得其安全地以藥物組合物的形式施用。用于生產VLP的方法是本領域技術人員公知的(參見,例如,Liew等人,2010;Plummer和Manchester,2010)。用于生產VLP的適當方法的非限制的例子在US5,919,458、EP386882、WO91/07425、US5,861,282和WO91/05864中描述了,其公開了不包含HIV基因組也不包含任何核酸分子的HIV?VLP(假病毒粒子)。?

如文中所述的,“重組病毒顆粒”指包含來自不同病毒的蛋白、或在其表面暴露來自不同病毒的蛋白的病毒顆粒。而且,重組病毒顆粒還可以指細菌或其它宿主細胞,其包含、生產或在其表面暴露一個或多個含有或衍生自HIV?Gag和/或Pol的病毒蛋白或肽或表位。?

事實上,重組病毒顆粒的大多數是其中原始結構蛋白(即,主要包膜蛋白和核心蛋白)的一部分被來自另一病毒的對應(counterpart)蛋白取代的病毒顆粒。作為例子,包膜蛋白可互換。在這樣的情況中,重組病毒顆粒包含存在于病毒基因組中的“嵌合”基因組,其具有與編碼來自另一病毒的包膜蛋白的序列互換的編碼包膜蛋白的序列。大多數重組病毒顆粒是可復制的、且有感染性的。?

如文中所使用的,包含來自另一病毒的蛋白的重組病毒指,在內部或呈現在其表面,含有一個或多個含有或衍生自HIV?Gag和/或Pol的病毒蛋白或肽或表位的重組病毒顆粒。描述了用于生產重組病毒顆粒的方法的非限制例子:?

*甲病毒(Alphavirus):WO02/053757中,公開了表達HIV(ENV蛋白)的重組甲病毒。?

*逆轉錄病毒:EP1499736中,公開了表達嵌合糖蛋白的慢病毒(lentiviral)載體。?

*腺病毒(例如5、7或35型):US2007/077257、US2007/054395、JP2007037402、WO2006/120034、US2004/253210、US2004/170647、US2005/070017、US2003/228329、US2004/101957、US2003/219458、US2004/009936、US2004/028652、WO03/050238、WO03/038057、WO03/020893、WO02/31168、WO02/22080、WO01/02607和US6716823中,公開了表達HIV蛋白的重組腺病毒。?

*痘病毒(金絲雀痘(canarypox)、牛痘、Ankara牛痘和禽痘病毒):US5,766,598、EP0592546、US2007/048861、US2006/188961、US2006/134133、EP1789438、WO2005/017208、WO2004/035006、US2004/146528、JP2003321391、EP1378516、WO95/07099、JP7170982、DE4141741、EP0449116、JP1148183、JP1085072、EP0592546、EP0243029、US2005/287162、JP2004105187、JP2004089185、WO03/095656、EP0592546、WO96/40880、US6,136,318、US5,670,367中,其公開了表達包含HIV蛋白的病毒蛋白的重組痘病毒。?

*含有、生產或在其表面暴露至少一個來自病毒的蛋白的細菌:US7,189,402和WO96/11708中,其公開了表達HIV糖蛋白(即,包膜蛋白)的沙門菌屬(Salmonella)或大腸桿菌(E.coli)。?

優選地,重組病毒顆粒對應于痘病毒,該痘病毒優選選自金絲雀痘(例如,ALVAC病毒載體,如描述于專利US5,766,598和EP0592546中的)、牛痘(例如牛痘病毒,如公開于國際專利申請WO95/07099中的)、Ankara牛痘(如,NYVAC病毒載體,如公開于專利申請EP1789438中的)和禽痘病毒(如,TROVAC病毒載體,如公開于國際專利申請WO03/095656中的)。?

更優選地,所述痘病毒是金絲雀痘病毒。作為對應于金絲雀痘病毒且表達HIV肽/蛋白的重組病毒顆粒的一個例子,可以引用公開于專利US5,766,598(從第6欄第18行至第82欄第36行在此引入作參考)中的ALVAC病毒載體,其中該ALVAC載體作為例子表達HIV-1gp120、HIV-1gp160、HIV-1env非切割的分泌形式、用跨膜序列錨定的HIV-1gp120、HIV-1gag/pol、HIV-1gag/pol和env(gp120)、HIV-1gag/pol和env(gp160)、以及HIV-1gag/pol和env(帶有跨膜錨定的gp120)。優選地,所述ALVAC載體表達HIV-1gag/pol和env(gp120),最優選地所述ALVAC載體是ALVAC?vCP1521。?

“病毒顆粒”優選是SIV或HIV顆粒,如含有突變的病毒基因組(例如,通過核酸突變、取代或插入)導致產生非感染的病毒顆粒的SIV或HIV病毒顆粒。?

包含突變的病毒基因組的病毒顆粒公開于US7,229,625、US6,121,021、US6,923,970、US6,544,527、US6,451,322和US6,080,408。?

有利地,為了使病毒顆粒或重組病毒顆粒安全施用于人,所述病毒顆粒或重組病毒顆粒在施用前是失活的。這樣的失活對重組病毒顆粒、甚至對非復制的那些,可能是必要的。?

如文中使用的“失活的病毒顆粒”,所述病毒顆粒是重組或非重組的,指不再感染的,優選不再復制的病毒顆粒。?

用于失活病毒顆粒或重組病毒顆粒的方法對本領域技術人員是公知的。病毒失活的非限制的例子包括化學失活例如福爾馬林、牛磺酸氯胺、甲醛、多聚甲醛、丙內酯、β丙內酯(REMUNE)或aldrithiol-2(無對應中譯文)(AT-2,參見US6,001,155)處理、熱失活、物理失活如U.V或γ輻射或微波暴露、及其組合。對于HIV失活的參照,參見RAVIV等人(J.Virol.,vol.79(19),p:12394-12400,2005)。?

根據一個實施方式,所述失活是化學失活,其選自福爾馬林、牛磺酸氯胺、甲醛、多聚甲醛、丙內酯、β丙內酯(REMUNE)或aldrithiol-2失活。?

或者,或額外地,所述失活是熱失活。這樣的失活是技術人員公知的,作為該方法的例子,可以引用實施例中公開的。實際上,發明人令人驚奇地在獼猴中建立了化學地(即,AT-2)和/或熱失活的病毒,當與非致病活性菌聯合時,其誘導保護性免疫耐受。?

有利地,為了施用于人的目的,病毒顆粒至少失活兩次,典型地使用至少以上提及的兩種失活方法。?

優選地,如以上提及的,用作本發明的藥物組合物中的抗原的病毒顆粒(重組或非重組的,VLP或非VLP)是核酸(即,DNA或RNA)非依賴的,這意味著病毒顆粒不含有任何病毒DNA或RNA,或者如果其含有DNA或RNA,其在免疫原性中沒有作用。?

或者,多種結構的聚合微顆粒(以微膠囊、微球等的形式)且在其表面提呈一個或多個含有或衍生自HIV?Gag和/或Pol的病毒蛋白或肽或表位,可用作根據本發明的藥物組合物中的抗原。這樣的微顆粒可由適當的生物或化學的聚合物形成,例如,甲基丙烯酸葡聚糖、甲基丙烯酸聚乙二醇酯和/或明膠,含有或衍生自HIV?Gag和/或Pol的HIV病毒或病毒蛋白或肽或表位可粘附于其上。聚合微顆粒的例子可見于文獻中(例如Wei?Li?Lee等人,(2010),Sandri等人(2007),Goldberg等人(2003),Delie?F.(1998),Ponchel等人(1998),Mathiowitz等人(1997),Fasano等人(1997),Chickering等人(1997))。?

在一個優選的實施方式,根據本發明的HIV-1藥物組合物中的抗原是能夠表達一個或多個含有或衍生自HIV-1Gag和/或Pol的病毒蛋白或肽或表位的一個或多個病毒顆粒。或者,根據本發明的HIV-1藥物組合物中的抗原是在其表面提呈一個或多個含有或衍生自HIV-1Gag和/或Pol的病毒蛋白或肽或表位的一個或多個聚合微顆粒。?

優選地,用于根據本發明的藥物組合物中的抗原是至少大約110kDa大小。優選,至少大約120、130、140、150、160、170、180、190、200kDa大小,甚至更大。?

使用常規的一般知識,以及在以下公開的實施例的基礎上,結合SIV或HIV?病毒,技術人員很容易確定用于本發明上下文中的病毒抗原的有效量。?

作為實例,當所述抗原是顆粒抗原、且更特別地是病毒顆粒時,病毒顆粒的量是大約106至大約1012每mL所述混合物。?

非致病細菌?

如本發明人用獼猴中的SIV所示的,當通過粘膜或皮內或上皮內的途徑與如上所定義的適當的抗原一起施用時,包含在藥物組合物中的非致病活細菌能夠誘導并優選地維持對上述抗原的免疫耐受的狀態。在人中,這使得可能預防和/或治療HIV疾病。?

因而,所述細菌可被認為是特定的佐劑,其在文中可被指定為“致耐受的佐劑”或“致耐受載體(carrier)”或“致耐受載體(vehicle)”或“耐受性載體”或“耐受作用(tolerization)載體”或“用于耐受的載體”,這些術語是同義的。?

優選地,所有這些等同的術語指,為了獲得對抗原的特異性免疫保護(優選,免疫耐受),從而預防和/或治療人中的HIV疾病,與如上定義的HIV抗原組合使用的非致病活細菌。?

更優選地,“致耐受載體”是非致病活細菌,其與如上定義的HIV抗原混合施用,以實現下述免疫保護的效果的一個或多個、優選2或多個、更優選3或多個:?

1)“致耐受載體”不誘導全身HIV抗原特異性抗體的顯著產生:?

特別地,沒有觀察到全身抗HIV?IgM和/或IgG抗體的顯著產生。例如,沒有顯著的全身體液反應,就是說通過經典臨床實驗室方法如ELISA沒有檢測到特異性可檢測的全身抗體反應,或者如果檢測到全身抗體,對于抗HIV病毒感染也不是保護性的。?

2)“致耐受載體”不誘導顯著的HIV抗原特異性CD4+T細胞增殖:?

特別地,通過例如所附實施例中描述的標準分析測量的,在體外HIV抗原刺激時,沒有觀察到顯著的HIV抗原特異性CD4細胞增殖。?

3)“致耐受載體”在體外HIV抗原刺激時,不誘導顯著的由CD8+T細胞產生的γ干擾素:?

特別地,在體外HIV抗原刺激時,觀察到的由CD8+T細胞分泌的γ干擾素水平在ELIspot分析的閾值水平以下。?

4)“致耐受載體”誘導抑制HIV抗原提呈CD4+T細胞激活的顯著CD8+T細胞反應:?

特別地,如隨附實施例所示,可通過測量由CD8+T細胞抑制的病毒復制水平(指示“顯著的”CD8+T細胞反應)的體外測試確定該反應。這些CD8+T細胞還稱為CD8+“調節”T細胞。但是,特別地,考慮到,例如該反應不誘導γ干擾素的顯著產生,該反應是非細胞毒性的。但是,特別地,該反應是MHC-1b/E限制的。但是,特別地,TCRαβ看起來參與抑制病毒復制的CD8+T細胞反應。但是,?特別地,與去除CD8+T細胞的相同細胞群相比,該反應抑制HIV抗原提呈CD4+T細胞的激活。優選地,所述反應抑制HIV抗原提呈CD4+T細胞的早期激活,其中所述“早期”激活是通過Ki67+標記物測量的(Scholzen和Gerdes.J.Cell?Physiol182,311-322(2000三月))。?

通過以上在1)、2)和3)中使用的術語“不誘導”,意指對于適當的定量檢測分析,低于閾值水平的結果,其中所述“閾值水平”是依據陰性對照在分析中確定的值:在該值以下,結果是陰性結果。該值可根據分析不同而不同,以及檢測方法不同而不同。?

有利地,致耐受載體選自活的:?

-非致病細菌,特別是益生菌(probiotics)和共生細菌;?

-減毒的致病細菌;和?

-失活(可選地,也是上述減毒的)致病細菌。?

致耐受載體可以是重組或非重組的。?

在本發明的上下文中用作致耐受載體的“非致病細菌”通常在人中不誘導任何病理。這也是其通常被認為安全(GRAS)的原因。當然,這樣的細菌應當是可施用于人的。?

用作致耐受載體的優選非致病細菌是共生細菌。這樣的細菌是技術人員公知的。非限制的例子包括芽孢桿菌屬(Bacillus?sp)(例如,芽泡桿菌B.coagulans)、動物雙歧桿菌(Bifidobacterium?animalis)、短雙歧桿菌(Bifidobacterium?breve)、嬰兒雙歧桿菌(Bifidobacterium?infantis)、長雙歧桿菌(Bifidobacterium?longum)、兩歧雙歧桿菌(Bifidobacterium?bifidum)、乳雙歧桿菌(Bifidobacterium?lactis)、大腸桿菌(Escherichia?coli)、嗜酸乳桿菌(Lactobacillus?acidophilus)、保加利亞乳桿菌(Lactobacillus?bulgaricus)、干酪乳桿菌(Lactobacillus?casei)、副干酪乳桿菌(Lactobacillus?paracasei)、約氏乳桿菌(Lactobacillus?johnsonii)、植物乳桿菌(Lactobacillus?plantarum)、羅伊氏乳桿菌(Lactobacillus?reuteri)、鼠李糖乳桿菌(Lactobacillus?rhamnosus)、短乳桿菌(Lactobacillus?brevis)、加氏乳桿菌(Lactobacillus?gasseri)、唾液乳桿菌(Lactobacillus?salivarius)、乳酸乳球菌(Lactococcus?lactis)、嗜熱鏈球菌(Streptococcus?thermophilus)等等。?

用作本發明上下文中的致耐受載體的“共生細菌”有利地是乳酸菌或雙歧桿菌,其更特別地選自以上列表,還包括其組合。一個優選的共生細菌是乳桿菌屬(Lactobacillus?sp.),以及更優選地是植物乳桿菌。以下報道的實施例第一次表明植物乳桿菌是致耐受載體,當與如上定義的抗原一同施用時,導致病毒免疫耐受。?

有利地,非致病細菌的組合,如兩種或多種共生細菌,可用作致耐受載體。?

如文中使用的,術語“致病細菌”指在人中誘導病理的細菌。這樣的細菌對技術人員是公知的,包括尤其是李斯特菌屬(Listeria?species)(例如單核細胞增生李斯特氏菌(Listeria?monocytogenes))、棒狀桿菌屬(Corynebacterium?species)、?分枝桿菌屬(Mycobacterium?species)、紅球菌屬(Rhococcus?species)、真細菌屬(Eubacteria?species)、博德特氏菌屬(Bortadella?species)和諾卡氏菌屬(Nocardia?species)。優選地,致病細菌選自分枝桿菌屬(Mycobacterium?species),更優選為牛分枝桿菌(Mycobacterium?bovis)。?

如文中使用的,“減毒致病細菌”是由于一個或多個突變或一種或多種減毒處理(例如,化學處理和/或在特定介質上的連續傳代),與其野生型對應物相比毒性(virulent)較低的致病細菌。該減毒致病細菌是本領域技術人員公知的。減毒致病細菌非限制的例子包括減毒的鼠傷寒沙門氏菌(Salmonella?typhimurium)和優選減毒的分枝桿菌的分枝桿菌。作為減毒分枝桿菌的例子,可以引用“卡介苗(Bacille?de?Calmette?Guerin)”,也被稱為“BCG”,而且,更特別地,其中,六個廣泛應用的BCG株-進化早期株BCG?Japanese、DU2組III中的兩個進化晚期株(BCG?Danish和Glaxo),和DU2組IV中的三個進化晚期株(BCG?Connaught、Pasteur和Tice)。作為減毒分枝桿菌的其它的例子,還可以引用重組BCG,如公開于HOFT等人(2008)中的株rBCG30,公開于WANG等人(2008)中的重組BCG,以及公開于國際專利申請WO2005/111205和WO02/102409以及公開于專利US7,122,195和US6,261,568中的重組BCG。?

有利地,不是減毒的或減毒的同時,致病細菌可以被失活以用作本發明上下文的致耐受載體,但是,減毒致病細菌在被失活后也可以被使用。?

“失活致病細菌”是本領域技術人員公知的。該失活致病細菌的制備方法構成本領域常規普通知識的一部分。作為這種方法的例子,能舉出噬菌體介導的裂解、化學失活如福爾馬林處理(見US7,393,541)、熱失活、如冷凍干燥(例如,擴展冷凍干燥)或U.V或γ輻射(參見WO2008/128065)或微波暴露的物理失活,以及它們的組合。?

優選地,所述致耐受載體是致病細菌如BCG的減毒衍生物。以下報道的例子第一次表明BCG是致耐受載體,當與如上定義的抗原一同施用時導致病毒的免疫耐受。?

當重組時,根據本發明的致耐受載體不表達任何HIV蛋白或肽或表位。?

優選地,至少用作致耐受載體的活細菌的顯著量在對數中期。更優選地,至少大約50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%或甚至大約100%的細菌細胞總數在對數中期。?

技術人員能夠容易地確定致耐受載體的有效量,該有效量的例子在以下公開。?

作為例子,本發明藥物組合物中所述細菌的量是大約104到大約1014CFU每ml所述混合物。?

藥物組合物?

所述組合物文中還作為“致耐受組合物”或“耐受-免疫原組合物”,這些術語是等同的。?

致耐受載體和含有或衍生自HIV病毒的Gag和/或Pol的抗原是兩個分別的、不同的組分,其作為混合物包含在本發明的藥物組合物中。這意味著所述致耐受載體和所述抗原作為不同的組分存在于所述組合物中。?

有利地,本發明的藥物組合物不包含作為佐劑的任何寡核苷酸(例如,CpG或dsRNA)。?

由于致耐受載體是細菌,相同屬和/或種的細菌可在重組形式下分別用作抗原的來源。例如,重組細菌將含有位于適當的調節序列(包括啟動子,可誘導的或組成性的)控制下的編碼抗原的核酸,該核酸可以在包含于細胞內的核酸載體上,或者作為整合的核酸序列整合至細菌染色體。從而,重組細菌將能夠表達或產生所述抗原。因而,根據特定的實施方式,本發明的藥物組合物包含是細菌的致耐受載體,以及是一個或多個含有或衍生自HIV?Gag和/或Pol的病毒蛋白或肽或表位的抗原,且其分開地由與致耐受載體屬于相同的屬和/或種的重組細菌產生。?

在根據本發明的藥物組合物中,當所述抗原是顆粒抗原且更特別地是病毒顆粒時,在所述混合物中所述病毒顆粒(表示為每ml所述混合物中的顆粒)對所述細菌(表示為每ml所述混合物中CFU)的比是大約從1:10到大約1:1000,優選從大約1:25到大約1:750,然而優選地從大約1:50到大約1:500,甚至更優選地從大約1:75到大約1:250,然而更優選地為大約1:100。?

施用本發明的藥物組合物?

有可能同時地、或分開地或相繼地施用致耐受載體和抗原。?

因而,本發明的一個目的是提供用于預防和/或治療有需要的人中HIV疾病的藥物試劑盒,其含有:?

-在第一容器中,如上定義的抗原;和?

-在第二容器中,如上定義的非致病活細菌,?

其中所述抗原和所述細菌在用于粘膜或皮內或上皮內施用的藥學上可接受的載體中。?

本發明的另一個目的是提供產物,產物含有:?

-如上定義的作為致耐受載體的非致病活細菌;和?

-如上定義的具有一個或多個來自HIV?Gag和/或Pol蛋白的表位的顆粒抗原或抗原,?

作為用于同時的、分開的或相繼使用的組合藥物組合物,用于預防和/或治療有需要的人中HIV疾病。通過粘膜地或皮內地或上皮內地向所述人施用所述組合的藥物組合物實現所述預防和/或治療。為了該目的,可以同時地、或分開地、或相繼地施用致耐受載體和抗原。?

作為實例,非致病活細菌可以口服(例如,作為口服藥物或食物補充劑),而抗原是粘膜地、或皮內地或上皮內地施用。?

當然,為了保證每次適當的遞送至預期位點(例如,粘膜表面),可以使用?適當的藥物載體。技術人員將輕易調整施用各致耐受載體和抗原的時間和劑量。?

優選地,根據本發明的藥物組合物是粘膜或皮內或上皮內的藥物組合物。但是優選地,其是口服的藥物組合物。?

如文中使用的,“粘膜或皮內或上皮內的藥物組合物”是用于粘膜或皮內或上皮內施用的藥物組合物,這意味著其被配制用于這樣的施用。?

特別地,藥物組合物可進一步包括用于粘膜或皮內或上皮內遞送所述抗原和所述細菌的一個或多個適當的藥物載體(或支持物)。?

優選地,文中的“粘膜遞送”選自鼻、口、舌下、氣管、咽、支氣管、食管、胃、十二指腸、小腸、直腸、包皮和陰道遞送。“粘膜遞送”是遞送到粘膜表面,如鼻、口、舌下、氣管、支氣管、咽、食管、胃、和十二指腸、小和大腸的粘膜、包括直腸粘膜,以及包皮和陰道粘膜。在本上下文中,粘膜表面還包括眼睛的外表面,即,眼睛及其周圍的粘膜。然而,優選地,粘膜表面是指陰道和消化道粘膜,更優選消化道粘膜。然而優選的是,粘膜遞送是口服遞送。?

因而,藥物組合物還可以包含一個或多個取決于施用途徑的藥物載體。藥學領域的普通技術人員熟知,或能容易確定用于藥物遞送至粘膜表面的載體,或用于皮內或上皮內遞送的載體。關于這方面,有用的參考是Chien(Novel?Drug?delivery?system,第三章從6至9,Marcel?Dekker,1992),Ullmann′s?Encyclopedia?of?Industrial?Chemistry,第六版(多位編輯,1989-1998,Marcel?Dekker);以及Pharmaceutical?Dosage?Forms?and?Drug?Delivery?Systems(ANSEL等人,1994,WILLIAMS&WILKINS)。?

對于本發明中有用的藥物遞送的示例性方法和途徑在以下簡述。?

至支氣管、細支氣管、氣管、鼻、口、包皮或咽粘膜的施用可通過將藥物組合物配制成吸入、噴霧等(例如,噴鼻、氣霧噴霧或泵噴霧等)、溶液、凝膠等而獲得。適用于將藥物組合物遞送至鼻粘膜、氣管和支氣管的噴霧器裝置是本領域已知的,因此在這里將不進行詳細說明。那么,藥物組合物可包括選自溶液、乳液、微乳液、水包油型乳液、無水脂質和水包油型乳液、以及其它類型的乳液的載體。?

至陰道粘膜的施用可通過將藥物組合物配制成溶液、灌腸劑、泡沫、栓劑、陰道片劑或局部凝膠而獲得。優選用于陰道遞送的載體包括親水的和疏水的載體,例如常用在配制乳液或凝膠制劑中的那些(例如,油/水乳液凝膠)。?

至消化道粘膜的施用可通過將藥物組合物配制成膠囊、微膠囊獲得。用于消化道遞送的優選載體對應著通常經口給藥的膠囊和微膠囊(例如,果膠和/或藻酸鹽的膠囊和微膠囊),如通常用于配制消化道遞送制劑的那些(例如,公開于國際專利申請WO2007/140613中的微膠囊)。或者,可通過消化或施用適當的液體和/或食品,例如飲料、酸奶等獲得消化道遞送。?

皮內或上皮內施用是技術人員公知的。例如可以使用針裝置進行皮內施用(例?如,注射),例如專利US6,933,319和國際專利申請WO2004/101025中公開的,或者用適當的無針裝置進行。?

藥物組合物可進一步包含至少一個吸收劑。“吸收劑”是本領域技術人員熟知的。例如,可以舉例表面活性劑,例如山梨糖醇酐脂肪酸偏酯的聚氧乙烯衍生物(例如,吐溫80、硬脂酸聚烴氧40酯、聚氧乙烯50硬脂酸酯、聚氧乙烯-9-月桂基醚和辛苯聚醇)、膽汁鹽如甘氨膽酸鈉、混合膠束、烯胺、一氧化氮供體(如,S-亞硝基-N-乙酰基-DL-青霉胺、NOR1、NOR4-其優選與NO清除劑如羧基PITO或雙氯芬酸鈉聯合施用)、水楊酸鈉、乙酰乙酸的甘油酯(例如,甘油基-1,3-二乙酰乙酸酯或1,2–異亞丙基甘油-3-乙酰乙酸酯)、環糊精或β-環糊精衍生物(例如,2-羥丙基-β-環糊精和七(2,6-二-O-甲基-β-環糊精))、中鏈脂肪酸,如單-和二甘油酯(例如,椰子油的癸酸鈉提取物,Capmul)、或甘油三酸酯(如,淀粉糊精、Estaram299、Miglyol810)、聚合物如羧甲基纖維素、卡波姆、聚卡波非、黃蓍膠和藻酸鈉、以及其它適合于粘膜或皮內或上皮內的遞送的吸收劑。關于已經成功用于粘膜或皮內或上皮內藥物遞送的吸收劑的一般原則的參考,參見Chien,Novel?Drug?Delivery?Systems?Ch.4(Marcel?Dekker,1992)。?

藥物組合物可進一步包含一個或多個添加劑(例如,稀釋劑、賦形劑、穩定劑、防腐劑等)。一般地,參見,Ullmann′s?Encyclopedia?of?Industrial?Chemistry,第六版(多位編輯,1989-1998,Marcel?Dekker);和Pharmaceutical?Dosage?Forms?and?Drug?Delivery?Systems(ANSEL等人,1994,WILLIAMS&WILKINS)。?

如以下公開的,將被施用于人受試者的根據本發明的藥物組合物的適當劑量可以根據所述受試者的一個或多個特征確定,如性別、年齡、體重、健康等。?

作為例子,當抗原是顆粒時,更特別地,當其是病毒顆粒時,可以每天向所述人施用大約108至大約1014個病毒顆粒的劑量。作為另一個例子,可以每天向所述人施用大約106至大約1016CFU的非致病活細菌的劑量。?

本發明藥物組合物的應用?

本發明的一個目的是提供如上所述的藥物組合物,作為藥物,優選作為疫苗的用途。?

本發明還涉及用于預防和/或治療有需要的人中HIV疾病的方法,包括至少向所述人粘膜地或皮內地或上皮內地施用有效量的如上定義的藥物組合物的步驟。?

根據本發明,為了預防的目的,“有需要的人”可以是任何人,優選至少大約2歲的人。為了治療的目的,“有需要的人”是由于他/她患有HIV疾病將被治療的人。?

“HIV疾病”指任何與HIV相關的免疫疾病,包括AIDS以及疾病進展的早期階段,包括血清轉化(慢性感染的建立)。?

本發明進一步涉及保護人免受HIV的方法,包括至少向所述人粘膜地或皮內地或上皮內地施用有效量的如上定義的藥物組合物的步驟。?

特別地,如果粘膜地暴露于HIV,該方法能夠保護人免受HIV感染,和/或如果靜脈暴露于HIV,該方法能夠保護人免于HIV復制。?

本發明還進一步地涉及保護人免受HIV血清轉化的方法,包括至少向所述人粘膜地或皮內地或上皮內地施用有效量的如上定義的藥物組合物的步驟。從而,所述人將不會變成血清陽性,并不會表現出顯著的HIV抗體水平。?

術語“接種”指采取的預防和/或治療人HIV疾病的行動(特別地,施用本發明的藥物組合物)。優選地,本發明的藥物組合物對于誘導和,優選地,維持人對含有或衍生自HIV病毒的Gag和/或Pol的抗原的免疫耐受是有用的,即,換言之,對接種(或“致耐受”)所述人是有用的。因而,使用本發明的藥物接種人被認為是“致耐受接種”(或“耐受作用”或“耐受”)。?

如果在粘膜或皮內或上皮內施用本發明的藥物組合物后(即,在致耐受接種后),在人中成功地誘導了免疫耐受,所述人被認為是“被接種的”(或“被耐受的”或“耐受的”)。對體內病毒感染挑戰的反應,即,如通過“被接種”人的血漿病毒RNA載量所評估的病毒復制,與對照人(對其單獨施用了抗原、或抗原與標準佐劑(如上定義的)、或沒有施用藥物組合物或安慰劑)血漿病毒RNA載量相比,降低了至少大約50%、更優選至少大約70%、然而更優選至少大約75%、或80%或85%或90%或95%或98%或99%,或甚至更多(99.5%、99.8%、99.9%、100%)。?

根據本發明,致耐受接種可以包括一次或多次藥物組合物的連續施用。優選地,致耐受接種可以包括至少兩次或多次連續施用(即,接種),更優選地,兩次以上連續施用所述組合物。?

有利地,連續致耐受接種之間的間隔是1分鐘到3個月之間,優選15分鐘到2個月之間。?

但是,有利地,本發明的致耐受接種還可以包括第一次粘膜或皮內或上皮內的致耐受接種之后一年或多年,再次致耐受接種(例如1到10年)。?

第一次粘膜或皮內或上皮內的致耐受接種之后新的致耐受接種可以選自粘膜、皮內和上皮內的致耐受接種。明顯的,如果新的致耐受接種是上皮內或皮內注射,那么特異性全身體液和/或細胞毒(產生γ干擾素)反應是可檢測的,但是對疾病的預防或治療沒有作用。?

根據本發明,藥物組合物的有效量施用至有需要的人。術語“有效量”指足以實現所需生物效果的量,此處的生物效果是通過誘導免疫耐受,優選“Ts”免疫耐受的治愈或保護作用(換言之,免疫保護效果)。可理解有效劑量將取決于將被治療的受試者的年齡、性別、健康和體重、如有的話,同時治療的種類、治療的頻率和預期效果的性質。以下提供的有效劑量的范圍沒有意圖限制發明,代表優選的劑量范圍。但是,如本領域技術人員理解的且能夠確定的,可調整優選劑量以適應受試者,這不需要過度(undue)實驗。參見,例如,Ebadi,Pharmacology,?Little,Brown?and?Co.,Boston,Mass.(1985)。?

例如,關于HIV,對于成年人的典型劑量是每劑量大約106-1012HIV病毒顆粒(即,VLP,重組或非重組病毒顆粒),優選108-1010。當然,無論使用多少劑量,其應當是被已知的方法確定為安全有效的量,如本文所述。?

而且,本領域技術人員還能夠根據他/她的一般知識確定為了實現所需的生物效果,將被施用于人的致耐受載體的有效量。?

作為例子,所述致病細菌(例如BCG)的減毒衍生物的有效量是每劑量104至1012的范圍,優選105至1010CFU(克隆形成單元),更優選106至108CFU。作為其它的例子,所述致病細菌或失活的致病細菌(例如BCG)的減毒衍生物的有效量是每劑量0.001mg至1g的范圍,優選0.01至100mg,更優選0.1至10mg。?

作為其它的例子,所述非致病細菌(例如乳桿菌屬)的有效量是每劑量大約106-1014CFU的范圍,更優選大約1010-1012CFU。?

如上所述,本發明的藥物組合物適于預防人將來的HIV疾病,或治療已患HIV疾病的人。?

對于治療的目的,如上定義的“抗原,含有或衍生自HIV病毒的Gag和/或Pol”,可以是自體同源的,也就是說,其可以衍生自感染將被治療的人的HIV病毒。在這種情況中,例如,HIV病毒可以分離自人,然后,可以培養病毒并使其失活(優選至少失活兩次),最后與致耐受載體結合從而獲得如上所述的藥物組合物。?

然而,例如,含有自體同源或非自體同源的含有或衍生自HIV?Gag和/或Pol的抗原的藥物組合物可以在常規的抗病毒治療期間施用給人,其將首先導致檢測不到的病毒載量。然后,只要通過自體同源病毒特異性CD8細胞實現了非自體同源急性感染的CD4細胞的適當離體病毒復制抑制,或者只要實現了由CD8T細胞誘導的CD4T細胞激活的適當抑制,就在一次或多次使用藥物組合物的致耐受接種后,停止常規抗病毒治療。?

特別地,為了治療目的,藥物組合物可以在被治療人的生命期間僅施用一次。或者,其可以在被治療人的生命期間施用兩次或多次,在同一天或者隔開一定期間的不同天,所述期間的范圍例如從大約1天到大約1年,或更長。更特別地,其可以每天或定期地施用,期間的范圍例如從大約1天到大約1年,或更長。如果有必要,藥物組合物可以在被治療的人的終生施用。?

本發明進一步提供了用于體外確定人是否被保護免受HIV病毒的方法,包括:?

a)從所述被接種人的血液樣品中分離外周血CD8T細胞;?

b)在適當的條件下培養:?

(i)所述分離的CD8T細胞和同種異體或自體同源的CD4+T細胞,CD4+T細胞在體外急性地被與所述HIV病毒等同的病毒株感染;和?

(ii)所述體外急性感染的同種異體或自體同源的CD4+T細胞;?

c)回收培養上清;?

d)測量所述上清中的病毒載量;和?

e)確定所述人是否被保護免受所述HIV病毒。?

通過“等同于待測試HIV病毒的病毒株”,其意味著所述病毒株源于野生病毒,并具有與待測試HIV病毒相似的本質特征(例如,可以例舉源于個體HIV-1的病毒株HTLVIIIB:HTLVIIIB可被認為是“等同于HIV-1的病毒株”)。優選地,所述病毒株源自是待測試HIV病毒的野生病毒。因而,所述病毒株代表了研究包括HIV病毒,特別是野生HIV病毒的適當模型。當然,病毒株被很好地調整以適應這樣的研究,特別是在安全性方面。?

以上所有的步驟能夠使用本領域技術人員熟知的標準技術進行。特別是,對于步驟b)的適當培養條件是本發明領域中普通知識的一部分(如以下實施例中描述的常規方法)。?

通過如以下實施例中描述的那些常規方法能測量步驟d)中的病毒載量。?

從根據亞步驟b)(ii)的所述體外急性感染的同種異體或自體同源的CD4+T細胞培養物回收的上清中的病毒載量將被用作步驟e)中的確定的參照。通過例如比較僅含有來自體外急性感染的同種異體或自體同源的CD4+T細胞的一式兩份(或一式三份或一式四份或更多)的孔的上清中的病毒濃度的幾何平均值,與含有CD8T細胞和來自體外急性感染的同種異體或自體同源的CD4+T細胞的一式兩份(或一式三份或一式四份或更多)的孔的上清中的病毒濃度的幾何平均值,將有利地計算“抑制百分比(%)”或“抑制率”或“抗病毒效果”。?

那么,步驟e)中的所述確定優選如下進行:?

-如果抑制率高于大約100,可以得出結論所述人是被保護的。典型地,這將是如下情況:如果HIV非感染的人被施用了有效的預防性抗病毒治療,或者如果HIV感染的人被施用了有效的治療性治療,所述有效的預防性或治療性治療包含優選根據本發明的藥物組合物,因而,只要其仍然被保護,則沒有必要進一步向人施用任何預防性或治療性治療。?

-如果抑制率低于大約100,可以得出結論所述人沒有被保護免受所述病毒。那么,人,HIV非感染的人或HIV感染的人,將有利地分別被施用包含根據本發明的藥物組合物的預防性或治療性治療,而且,以適當的時間間隔,將進行一次或多次以上的體外方法,來確保人成為被保護的。?

而且,本發明提供了用于體外確定人是否被保護免受HIV病毒的試劑盒,其包含能夠被病毒株感染的同種異體或自體同源的CD4+T細胞,所述病毒株如上所定義的,等同于待測試所述HIV病毒。試劑盒還可以含有適當濃度的足夠的病毒株,以感染上述同種異體或自體同源的CD4+T細胞,和/或適當的試劑和/或對照和/或介質(如用于細胞懸浮、細胞培養、細胞儲存等的介質)。本發明的試劑盒可特異于HIV病毒特定型,或者其可被調整以適用于病毒的多種型,所述病毒的?型是接近的(特別是,系統發生上接近的)。?

可以容易地調整本發明以適用于預防和/或治療任何慢性感染疾病。這樣的疾病的非限制的例子是:B和C型肝炎、人乳頭瘤病毒(HPV)、EBV和其它皰疹病毒、肺結核、麻風、利什曼病等等。?

全局地,每一次當與上述感染或疾病相關的一個或幾個致病抗原參與CD4+T細胞(所述CD4+T細胞提呈衍生自上述致病蛋白或肽的表位)特異性激活時,非細胞毒性CD8+T細胞(所述CD8+T細胞由粘膜或上皮內或皮內的結合上述抗原和文中所述致耐受載體的藥物組合物產生)能夠引起對CD4+T細胞激活的特異性抑制/防止。?

文中表明使用本發明的藥物組合物能夠預防和/或治療哺乳動物/人中的病毒感染和相關疾病。根據這一教導,有可能提供其它的藥物組合物,其包含:(i)如文中公開的致耐受載體;和(ii)任何來自病毒、細菌、真菌、原生動物或寄生蟲來源的抗原。這樣的藥物組合物被配制用于適當的遞送(優選,粘膜或皮內或上皮內)所述致耐受載體和所述抗原。其對于預防和/或治療由抗原所衍生自的病毒、細菌、真菌、原生動物或寄生蟲所引起的哺乳動物中的慢性感染是有用的。一個例子是細菌藥物組合物,其包含(i)如文中所述的致耐受載體;和(ii)衍生自結核分枝桿菌(Mycobacterium?tuberculosis)的抗原。該細菌藥物組合物被配制用于適當的遞送(優選,粘膜或皮內或上皮內)所述抗原和所述致耐受載體。特別感興趣地,用于預防和/或治療人結核的是這樣的細菌藥物組合物,其中分枝桿菌抗原衍生自Koch氏桿菌。?

通過本發明的藥物組合物實現的免疫保護?

耐受是免疫系統的一種生理能力,以識別通過粘膜系統進入的抗原,以及產生對再次遭遇相同抗原的無反應性(anergy)(一般地與其它免疫修飾相關)。經常表明耐受誘發粘膜抗原的粘膜sIgA容許的抗體遏制,而不刺激全身免疫區域。TGF-β,一種調節性細胞因子,有時也參與耐受的產生。也經常表明CD25+調節性T細胞的活性抑制作為粘膜耐受的潛在機制(Faria和Weiner,2005;Mestecky等人2007)。但是,在本發明描述的藥物組合物誘導的免疫耐受中沒有觀察到這些免疫修飾,其主要特征在于抑制提呈病毒表位抗原的CD4+T細胞的激活的CD8+T細胞活性,該免疫反應類型迄今沒有認識到,更特別地,其是一種全新類型的免疫耐受。?

表述“耐受”、“免疫學耐受”、“免疫耐受”、“對病毒的免疫耐受”、“新型病毒特異性耐受”、“對病毒抗原的免疫耐受”、“對病毒免疫原的免疫耐受”和““Ts”免疫耐受”是同義的。發明人已經表明這對應著獼猴中活躍誘導的強的非細胞毒性、MHC-1b/E限制的CD8+T細胞反應,其抑制HIV?Gag和/或Pol抗原提呈CD4+T細胞的早期激活,且與CD4+T細胞增殖的缺失相關,以及當失活的SIV抗原刺激時沒有CD8+T細胞分泌的γ干擾素,并且沒有全身抗SIV?IgM和IgG抗體的產生。而且,發明人能表明TCRγδ和Vβ8不參與病毒復制的CD8+T細胞抑制,表明了TCRαβ應當在識別感染的CD4+T細胞上MHC-1b/E肽提呈中起主要作用。?

尤其,當用包含含有或衍生自HIV病毒的Gag和/或Pol的抗原的常規預防性疫苗組合物和標準的或常規的佐劑(即,目的是刺激和/或有助于和/或增加與抗原相關的免疫反應的物理、化學或生物佐劑的任何形式,如S.Plotkin等人在"Vaccines"中標題為"Adjuvants"章中描述的)接種時,可觀察到“通常的對衍生自病毒的抗原的免疫反應”。該“通常的對衍生自病毒的抗原的免疫反應”包括體液的、細胞的、或體液和細胞的免疫反應,其通常的特征為:?

(i)在特異性體外刺激下,病毒特異性CD4細胞增殖;和/或?

(ii)通過產生抗病毒抗原蛋白和/或肽的全身抗體誘導特異性全身體液反應;和/或?

(iii)誘導與CD8T細胞產生γ干擾素相關的特異性細胞反應,和/或?

(iv)沒有非細胞毒性的、抑制HIV?Gag和/或Pol抗原提呈CD4+T細胞激活的CD8+T細胞反應。?

相反,如本發明提供的,包含含有或衍生自HIV病毒的Gag和/或Pol的抗原和致耐受載體的藥物組合物產生“對病毒的免疫耐受”,且,更特別地,產生““Ts”免疫耐受”,在以下關于獼猴中SIV的實施例中確定了其特征在于:?

(i)在特異性體外刺激下,沒有病毒特異性CD4細胞增殖;和?

(ii)沒有任何顯著的全身體液反應,也就是說,通過經典臨床實驗室方法如ELISA,沒有檢測到特異性可檢測的全身抗體反應,或者如果檢測到全身抗體,其對SIV病毒感染也沒有保護性;和?

(iii)在足夠的體外刺激下,沒有與產生γ干擾素相關的任何細胞毒性CD8+T細胞反應(例如,由ELIspot可檢測的),或者如果檢測到細胞毒性CD8T細胞反應,其對SIV病毒感染也沒有保護性;和?

(iv)作為一個重要特征,活躍誘導的強的非細胞毒性、非CD25MHC-1b/E限制的CD8+T細胞反應,抑制SIV抗原提呈CD4+T細胞的早期激活。?

如上所述,本發明的藥物組合物包含致耐受載體和抗原,所述抗原含有,或衍生自HIV病毒的Gag和/或Pol。實際上,結合至病毒抗原的致耐受載體誘導人中病毒特異性免疫耐受的狀態,而不激發如上定義的通常的免疫反應。因而,通過粘膜或皮內或上皮內途徑施用的抗原,單獨或與標準佐劑聯合,一般能夠激發通常的免疫反應,然而,其與如本發明的藥物組合物中的致耐受載體聯合則不同。在這些特定的情況中,本發明藥物組合物中致耐受載體/抗原的聯合誘導了如上定義的免疫耐受。這意味著免疫耐受僅能通過施用(通過粘膜或皮內或上皮內途徑)適當的致耐受載體和抗原(含有,或衍生自HIV病毒的Gag和/或Pol)的混合物實現。如果向人施用一種而沒有另一種,那么人將不被“接種”或“被耐受”。?

如以下的實施例所示(使用獼猴模型中的SIV),通過施用根據本發明的藥物組合物誘導的或實現的免疫耐受(也稱為“Ts”免疫耐受)特征在于抑制SIV?Gag和/或Pol抗原提呈CD4+T細胞激活(特別是早期激活)的CD8+T細胞反應(特別是非細胞毒性的和/或MHC-1b/E限制的);以及有利地,特征在于一個或多個:1)沒有CD4+T細胞的增殖;2)在SIV抗原刺激下沒有顯著的CD8+T細胞分泌的γ干擾素;和3)沒有顯著產生全身抗SIV?IgM和IgG抗體。?

通過術語“在HIV或SIV抗原刺激下沒有顯著的CD8+T細胞分泌的γ干擾素”,文中這意味著在HIV或SIV抗原刺激下觀察到的CD8+T細胞分泌的γ干擾素水平是0或弱的。在HIV或SIV抗原刺激下CD8+T細胞分泌γ干擾素是“弱的”典型地指每2×105個PBMC少于大約80SFC。?

通過術語“沒有顯著產生全身抗HIV或抗SIV?IgM和IgG抗體”,文中意味著觀察到的全身抗HIV或抗SIV?IgM和IgG抗體產生水平是0或弱的。全身抗HIV或抗SIV抗體產生是“弱的”典型地指抗HIV或抗SIV滴度是大約300或更少。?

因而,根據本發明的藥物組合物誘導,優選地維持人中對HIV的抗原特異性免疫保護,其中所述免疫保護優選特征在于:?

-與適當的實驗對照相比,所述人中HIV病毒載量降低,優選抑制;和/或?

-與適當的實驗對照相比,所述人中抑制HIV?Gag和/或Pol抗原提呈CD4+T細胞激活的CD8+T細胞。?

有利地,通過體外檢測來自所述人的CD8+調節性T細胞的存在或活性,確定所述人中的所述免疫保護。可通過標準的體外技術,例如在以下實施例中描述的那些,進行這種檢測。?

以上引用的所有專利、專利申請和出版物在文中并入作參考。?

實施例

部分A-通用的材料和方法

A-I動物。依據國立健康研究所(National?Institutes?of?Health)的“Guide?for?the?Care?and?Use?of?Laboratory?Animals”條例飼養群養的中國恒河猴普通獼猴(Macaca?mulatta)。所有動物健康良好,2-4歲,體重4-6kg,是SIV、SRV、猴T細胞嗜淋巴細胞病毒1、B型肝炎病毒、和B病毒血清陰性。在進入時對所有動物進行X射線和皮膚試驗(PPD),以排除潛在的結核攜帶者。?

A-II?I類MHC分型。如之前所述的(Muhl等人,2002;Loffredo等人,2007),使用對代表性Mamu-A和Mamu-B序列的序列特異性引物(SSP)PCR分析在外周血單核細胞(PBMC)樣品中對恒河猴典型I類MHC等位基因進行基因分型。?

A-III抗原病毒的制備。?

III-1.在用SIVmac239(P.A.Marx饋贈)接種的CEM174細胞上進行SIV生產。收集培養物上清挑選病毒產生。?

III-2.AT-2失活的SIVmac239:SIVmac239由250μM?aldrithiol(AT-)(Sigma)失活2小時,通過超離心洗滌3次。AT2失活的病毒以109病毒顆粒的最終劑量用于每次施用(即,接種)。?

III-3.熱失活的SIVmac239:SIVmac239在56℃下失活30分鐘。熱失活的病毒以109病毒顆粒的最終劑量用于每次施用。?

III-4.AT-2熱失活的SIVmac239:SIVmac239由250μM?aldrithiol(AT-2)(Sigma)失活2小時,通過超離心洗滌3次。然后,病毒接受56℃溫度下30分鐘。失活的病毒以109病毒顆粒的最終劑量用于每次施用。?

III-5.將失活的病毒制劑接種于CEM174細胞,以證實病毒感染性的100%抑制。?

A-IV對SIV的抗體反應的分析。通過免疫熒光抗體(IFA)分析(Mederle等人,2003)滴定血漿中的抗SIV?IgG、IgM和IgA抗體。簡言之,在37℃下,2倍系列稀釋的測試血漿和SIV感染的CEM174細胞粘附的玻片孵育30分鐘。用Hanks洗滌后,加入FITC-綴合的山羊抗獼猴IgG(Sigma)、IgM(ADI,San?Antonio,Texas)、或IgA(ADI),再持續30分鐘(于37℃)。抗體滴度確定為達到陽性免疫熒光染色的最高稀釋的倒數。IFA分析的靈敏度對于IgG是20滴度,對于IgM和IgA是5滴度。當血漿樣品的IFA是陰性時(在分析的靈敏度以下),為了有助于數據分析,值被指定為1。?

如之前所述(Tsai等人,1993),通過用胃滴入導管、用PBS沖洗直腸來收集粘膜分泌物。簡言之,向樣品中加入胰蛋白酶抑制劑(10μg/ml)和EDTA(5×10-4M)(Sigma),然后在10000×g下,在4℃離心10分鐘。收集上清,并補充苯甲基磺酰氟(10-3M)和疊氮化鈉(0.01%)(Sigma)。將樣品儲存于-80℃,直至使用。通過上述的IFA分析檢測直腸中的抗SIV?IgA滴度。?

A-V流式細胞術。用FACScalibur(BD?Biosciences,San?Jose,California),使用抗如下的熒光標記的單克隆抗體進行流式細胞分析:CD3-PE-Cy7(克隆SP34-2)、CD4-PE(克隆MT477)、CD8-PerCP(克隆RPA-T8)和兔抗小鼠-APC二抗(BDBiosciences)。Ki-67-PE(BD?Biosciences)和FITC綴合的抗P27單克隆抗體(Fitzgerald,Concord,MA)或偶聯有APC-SAv(BD?Biosciences)的生物素綴合的抗P27單克隆抗體(Fitzgerald)用于透化后的細胞內染色。?

抗TCRγδ(克隆B1)、Vβ8、和CD抗原(CD7、CD16、CD28、CD62L、CD95、CD122、CD137、CD150、CD183、CD184、CD195、CD196、CD197、CD226、CD272和CD305)的PE綴合的單克隆抗體購自BD?Biosciences;抗CD抗原(CD11a、CD25、CD27、CD39、CD101、CD129、CD215、CD277和CD357)的PE綴合的單克隆抗體購自BioLegend(San?Diego,CA,USA);和抗CD抗原(CD127、CD247和CD279)的PE綴合的單克隆抗體購自eBioscience(San?Diego,CA,USA)。?

A-VI細胞增殖。如之前所述(Lu等人2003)獲得PBMC。通過羧基熒光素二乙?酸酯、琥珀酰亞胺酯(CFSE)標記分析(Molecular?Probes,Eugene,Oregon),根據廠商的說明書評估SIV特異性CD4+或CD8+T細胞的增殖。用3μM?CFSE在37℃下染色PBMC15分鐘。洗滌后,用10μg/ml重組SIV核心蛋白P27(ImmunoDiagnostics,Wobun,MA)、2μg/ml?SIV?gag15-mer肽(GLS,中國上海)、109/ml?AT-2失活的SIV或單獨的介質對CFSE標記的細胞刺激5天。用抗CD3和抗CD4或抗CD8抗體標記后,在1%多聚甲醛中固定PBMC,用于流式細胞術。?

A-VII細胞激活。通過磁珠去除(或沒有去除)CD8或CD25的新鮮PBMC被AT-2處理的SIVmac239以1010/ml的病毒濃度單輪感染2小時。用金黃色葡萄球菌腸毒素B(2.5μg/ml)和抗CD3(2.5μg/ml)/抗CD28(2.5μg/ml)抗體過夜刺激感染的細胞。刺激后48小時進行SIV?P27和Ki-67的細胞內染色,以確定感染的(P27+)CD4+細胞內激活(Ki-67+)的百分比。?

A-VIII?ELISPOT分析。使用商售的試劑盒(Cell?Sciences,Canton,MA),在存在或不存在P27或AT-2失活的SIV時,在未培養的PBMC中進行恒河猴IFN-γ和IL-10ELISPOT分析。TGF-b1ELISPOT試劑盒購自R&D?Systems(Minneapolis,MN)。用自動ELISPOT閱讀器(AID,GmbH,Straβberg,Germany)讀取數據。通過減去介質單獨存在時的非特異性SPC,計算SIV特異性點形成細胞(SFC)的數目。?

A-IX抗病毒分析。在存在或不存在磁性純化的CD8+T細胞時,以1:2的CD4/CD8的比,用SIVmac239(10-3MOI)急性感染磁陽性標記(MicroBeads,Miltenyi?Biotec)純化的來自每一動物的自體同源CD4+T細胞,然后用SEB(Sigma)刺激16小時。洗滌后,在每孔最終體積200μl的含有100IU人rIL2的RPMI1640介質(Invitrogen,中國上海)中,在96孔板上在存在5%CO2時,在37℃下一式四份培養細胞5天。在第3天,用一半的新鮮介質替換細胞培養物一次。在第5天收集的培養物上清用于通過實時RT-PCR測量病毒載量(如以下)。通過比較來自僅含有CD4+感染細胞的一式兩份孔的培養物上清中病毒濃度的幾何平均值,與來自含有混合的CD8+和CD4+細胞的一式四份孔的上清中病毒濃度的幾何平均值,計算抑制百分比(%)。為了確定病毒抑制與HLA限制之間的相關性,CD4+T細胞也與同種異體的CD8+T細胞共培養。?

A-X病毒載量的測量。使用對SIVmac239和SIVmac251特異優化的引物(正義,SEQ?ID?No.1:5′-GAGGAAAAGAAATTTGGAGCAGAA-3′;反義,SEQ?ID?No.2:5′-GCTTGATGGTCTCCCACACAA-3′)和探針(SEQ?ID?No.3:5′-FAM-AAAGTTGCACCCCCTATGACATTAATCAGATGTTA-TAMRA-3′),通過實時RT-PCR或PCR定量血漿中SIV?RAN或細胞相關的SIV?DNA。?

A-XI?SIV特異抑制的T細胞分析。根據廠商(Miltenyi?Biotec)提供的方案,通過磁珠綴合的抗CD8或抗CD25抗體去除(或沒有去除)CD8或CD25的新鮮PBMC,被SIVmac239在0.5感染復數(MOI)下感染2小時。用金黃色葡萄球菌腸毒素B(SEB)(2.5μg/ml)(Sigma)和抗CD3(2.5μg/ml)/抗CD28(2.5μg/ml)?抗體(BD?Biosciences)過夜處理感染的細胞。在體外刺激后48小時進行SIV?P27和Ki-67的同時細胞內染色,以確定感染的(P27+)細胞群內T細胞激活(Ki-67+)的百分比(%)。?

A-XII病毒挑戰。?

XII-1.在用SIVmac239(P.A.Marx饋贈)接種的獼猴PBMC上進行SIV生產。收集培養物上清挑選病毒產生。?

XII-2.直腸內挑戰(IRC):在接種后,動物直腸內接種(重復)5000MID100,即,5×105TCID50的致病SIVmac239。這種感染的劑量通常導致中國恒河猴100%的全身感染,在第10至14天之間具有血漿病毒載量峰值(106-107拷貝/ml)。一個月每兩周、之后每一個月臨床和生物學地評估所有SIV挑戰的動物。?

XII-3.靜脈內挑戰(IVC):在接種后,動物靜脈內接種(重復)5MID100,即,500TCID50(在CEM174細胞系中滴定)的致病SIVmac239(來自Aaron?Diamond?AIDS?Research?Center,New?York,USA的P.A.Marx博士的饋贈)。感染的劑量通常導致中國恒河猴100%的全身感染,在第10至14天之間具有血漿病毒載量峰值(106-107拷貝/ml)。一個月每兩周、之后每一個月臨床和生物學地評估所有SIV挑戰的動物。?

A-XIII統計學分析。在免疫之前和之后,分別通過Mann-Whitney或Wilcoxon檢驗比較不同組動物間不成對的數據或成對的數據。?

部分B-特異性材料和方法

B-I-BCG用作致耐受載體?

B-I-I?BCG的制備?

I-1.活BCG:在哥本哈根的Statens?Serum?Institut制備的活BCG(SSI1331株)購自Laboratories?Sanofi-Pasteur?Merck,Sharp?and?Dome(無對應中譯文)(SPMSD),并以最終濃度5×106cfu用于腸內或陰道內施用,或以最終濃度5×105cfu用于每次皮內加強施用。?

I-2.擴展冷凍干燥(EFD)失活的BCG:在小于20μm?Hg的真空下通過5天的擴展冷凍干燥(EFD)殺死活的SSI133BCG株,以對應著每次腸內或陰道內施用5×106cfu或每次皮內施用5×105cfu的最終劑量使用。?

I-3.熱失活BCG:在115℃下,在硼酸鹽緩沖液中高壓滅菌活的SSI133BCG株15分鐘,以對應著每次腸內或陰道內施用5×106cfu或每次皮內施用5×105的最終劑量使用。?

B-I-II藥物組合物?

使用含有SIV抗原和致耐受載體之一的RPMI1640(Invitrogen中國上海)新鮮制備組合物。?

B-I-III動物免疫?

在免疫時,用鹽酸替來他明和唑拉西泮(0.7mg/kg)肌肉內注射麻醉動物。?

III-1.陰道內免疫(IVI):在麻醉下通過陰道內注射1毫升藥物組合物或作為對照的以上公開的一種致耐受載體,免疫雌性動物4小時。在第8周在相同的位點以相同的劑量給予藥物組合物或致耐受載體的加強免疫。在第一次免疫后每兩周臨床和生物學地評估所有動物。?

III-2.口服(胃內)免疫(IGI):在攝入藥物組合物或一種如上公開的作為對照的致耐受載體之前,在麻醉下向雄性或雌性動物胃內施用15分鐘15ml0.1M碳酸氫鈉。在施用后立即給予另外15ml碳酸氫鈉溶液。以一個月的間隔向每只動物重復兩次與初次相同的致耐受接種。第一次免疫后每兩周臨床和生物學地評估所有動物。?

III-3.皮內加強免疫(IDI):第一次免疫后的第90天,在麻醉下給予雌性陰道內免疫的動物(參見上述IVI部分)0.1ml藥物組合物的皮內加強,所述藥物組合物含有109拷貝的AT-2失活SIV和5×105cfu的活BCG。在第一次免疫后每兩周臨床和生物學地評估所有動物。?

B-I-IV抗病毒分析.對應著直腸內挑戰后無菌免疫的閾值是至少20。?

B-II-植物乳桿菌用作致耐受載體

B-II-I細菌制備(致耐受載體的制備)。在37℃下、在MRS介質上以200rpm的轉速培養植物乳桿菌(LP)(ATCC8014)。為獲得細菌培養對數(對數中間)期的LP,培養細菌直至600nm下的光密度達到1.0,最終LP濃度大約1010cfu/ml(在大約3.5小時獲得)。?

B-II-II由口服(胃內)遞送的動物免疫。動物過夜禁食(沒有早餐)。在口服施用時,用鹽酸替來他明和唑拉西泮(0.7mg/kg)肌肉內注射麻醉動物。?

免疫No.1:8只動物胃內施用30ml病毒-細菌制成的制劑,其含有4×107拷貝/ml?DI-SIV和麥芽糊精(20%)溶液中的3×109cfu/ml活的LP。在該第一次免疫后,猴子每30分鐘接受胃內25ml相同的病毒-細菌制劑(即,藥物組合物),持續3小時。該口服遞送方案在5個連續的工作日進行5次。作為對照,4只動物被施用單獨的活LP,其它3只平行地僅接受兩次失活SIV。?

免疫No.2:12只動物(iSIV/LP#9-20)胃內施用30ml4×107拷貝/ml?iSIV(AT-2/熱失活SIVmac239)制劑和麥芽糊精(20%)溶液中的3×109cfu/ml活的LP。然后,在5個連續的工作日,動物每30分鐘接受25ml相同的制劑,持續3小時(6次)。六只動物(LP#5-10)胃內施用30ml麥芽糊精(20%)溶液中的3×109cfu/ml活的LP。然后,在5個連續的工作日,動物每30分鐘接受25ml相同的制劑,持續3小時(6次)。最后,另外6只動物(iSIV#5-10)胃內施用30ml4×107拷貝/ml的單獨的iSIV制劑。然后,在5個連續的工作日,動物每30分鐘接受25ml相同的制劑,持續3小時(6次)。?

B-II-III去除體內CD8+T細胞。首先麻醉獼猴,然后,如之前所述(Schmitz等人,1999),在第0、4、7天給予靜脈內注射5mg/kg的嵌合抗CD8單克隆抗體(cMT-807,Centocor?Research&Development,Inc.,Malvern,Pennsylvania,USA)。在第0天以及抗體注射后的各時間點從每個動物采取外周血樣品(5ml)。?

B-II-IV抗病毒分析。對應于直腸內挑戰后的無菌免疫的閾值是至少100。?

B-II-V?CD8+細胞SIV抑制分析。存在或不存在磁純化的CD8+T細胞時,以1:3的CD4/CD8的比,用SIVmac239(10-3感染復數)急性感染磁陽性標記(MicroBeads,Miltenyi?Biotec)純化的來自每一動物的自體同源CD4+T細胞,然后用SEB和抗CD3/抗CD28抗體刺激16小時。洗滌后,在96孔板上一式四份培養細胞。在每孔最終體積200μl的含有100IU人rIL2(Roche?Diagnostics?GmbH,Mannheim,Germany)的RPMI1640介質中,培養物維持5天。在第5天收集的培養物上清用于通過實時RT-PCR測量病毒載量(見以下)。如以下計算抑制倍數:來自僅感染CD4+靶細胞的培養物上清中病毒濃度的幾何平均值/來自混合的CD8+和CD4+T細胞上清中病毒濃度的幾何平均值)。?

在一些實驗中,通過使用Multiwell?Insert?System(BD?Biosciences)沒有細胞-細胞接觸地培養CD8+和CD4+T細胞(CD8在插入孔,而CD4在底部的孔);CD4+T細胞與同種異體的CD8+T細胞共培養,以便確定病毒抑制和MHC限制之間的相關性;CD8+和CD4+T細胞也在抗MHC-ABC(BioLegend)或抗MHC-E(Cell?Science)抗體存在時共培養,以定義MHC限制的模式。為了定義與抗病毒活性相關的CD8+T細胞亞群(subset),使用通過LD柱(Miltenyi?Biotec)的抗PE微珠,用PE綴合抗TCRγδ、抗Vβ8或其它抗CD抗原抗體進行去除后,立即從PBMC純化CD8+T細胞。?

B-II-VI?SIV特異性CD8+T細胞的細胞毒性分析。純化的CD8+T細胞(效應細胞)和用102AT-2處理的SIVmac239脈沖的純化的CD4+T細胞(靶細胞)在37℃下用40nM3,3′二己氧基羰花青(DiOC6)(Marchetti等人,1996)(Molecular?Probes)標記10分鐘。靶細胞在冰上用PerCP-Cy5綴合的抗CD4(BD?Bioscience)標記20分鐘。洗滌3次后,在U底96孔板中以不同的E/T比(3:1,1:1,0.3:1)一式三份地混合效應細胞和靶細胞。來自4個健康供體的具有APC綴合的抗CD32(BD?Bioscience)和純化的CD56+(NK)細胞(效應物)被納入用作分析的對照。在SEB和抗CD3/抗CD28存在時,在37℃下孵育4小時后,收獲細胞,并由流式細胞術分析。如下計算細胞毒性百分比:100×(%總凋亡靶細胞-%自發凋亡的靶細胞)/(100-%自發凋亡的靶細胞)。?

B-II-VII病毒的挑戰。?

首次研究:在第一批實驗中(免疫No.1),口服施用疫苗或對照后4個月,8只免疫動物和其7只對照直腸內接種2500MID100(100.000TCID50)的致病SIVmac239。兩個月之后,4只接種的和已經被保護的猴子通過直腸內途徑再次挑?戰(100.000TCID50),而另外4只被保護的猴子用5MID100(200TCID50)SIVmac239靜脈內再次挑戰。作為對照,2只猴子接受直腸內挑戰,另外2只接受靜脈內挑戰。這些感染的劑量通常在第10至14天之間導致100%中國恒河猴的全身感染,血漿病毒載量達到峰值(107-109vp/ml)。?

第二次研究(免疫No.2):在第二組研究中在免疫后第420天,16只動物(用iSIV和LP免疫的8只猴子)和8只對照(4只iSIV和4只LP)用100,000TCID50的SIVmac239直腸內挑戰。?

部分C-結果

C-I?BCG是致耐受載體

C-I-I陰道內施用后對靜脈內SIVmac239挑戰的保護:?

六只動物(組合物_1、2、3、4、5和6)陰道內施用1毫升含有作為抗原的AT2失活的病毒和活BCG的致耐受組合物。在第8周在相同位點用相同的致耐受組合物給予加強施用。?

同時地,5只其它的動物(對照_1、2、3、4和5)陰道內給予1毫升僅含活BCG的組合物。也在第8周在相同的位點用相同的組合物給予加強施用。?

初次施用后4個月,所有11只動物(組合物_1-6和對照_1-5)被靜脈內病毒接種挑戰。?

常規地在處理動物的血漿中測量病毒載量。?

圖1表明在接受組合物(組合物_1-6)的動物中和在對照動物(對照_1-5)中,在單次靜脈內病毒挑戰后,病毒載量(血漿SIV?RNA拷貝/ml)作為時間(天)的函數。?

結果表明,在靜脈內病毒挑戰后,5只對照動物(對照_1-5)表現典型的原發感染,如預期地,在挑戰后10-14天之間具有血漿病毒載量峰值(106-107拷貝/ml)。該對照動物組的血漿病毒載量經過病毒挑戰后60天以及其后仍持續高(>105vp/ml)。?

相反地,陰道內接受由AT-2失活的SIVmac239和BCG制成的致耐受組合物的4/6的動物表現非常低的血漿病毒載量峰值(在10-14天之間,<1000vp/ml),其很快變得不可檢測(<10vp/ml)(病毒挑戰后1個月)。在第60天,具有高血漿病毒載量峰值(>106拷貝/ml)的2只動物比對照組(>105拷貝/ml)具有較低的定點(set-point)病毒載量水平(<1000拷貝/ml)。?

C-I-II-陰道內施用組合物后對直腸內SIVmac239挑戰的保護:?

七只動物(組合物_7、8、9、10、11、12和13)陰道內施用1毫升含有作為抗原的AT2失活的病毒和作為致耐受載體的活BCG的組合物。在第8周在相同的位點用相同的組合物給予加強施用。?

同時地,5只其它的動物(對照_6、7、8、9和10)陰道內給予1毫升僅含活?BCG的組合物。也在第8周相同的位點用相同的組合物給予加強施用。?

初次施用后4個月,所有12只動物(組合物_7-13和對照_6-10)通過直腸內病毒接種被SIVmac239挑戰。?

在處理的和對照動物的血漿中常規地測量病毒載量。?

圖2表明在直腸內病毒挑戰后,在接受組合物(組合物_7-13)的動物中和在對照動物(對照_6-10)中,病毒載量(血漿SIV?RNA拷貝/ml)作為時間(天)的函數。?

結果表明,在直腸內病毒挑戰后,接受單獨的活BCG陰道內施用的5只動物(對照_6-10)表現典型的原發感染,如預期地,在挑戰后10-14天之間具有血漿病毒載量峰值(106-107vp/ml)。該對照動物組的血漿定點病毒載量經過病毒挑戰后60天仍持續高(>105拷貝/ml)。?

相反地,陰道內接受AT-2失活的SIVmac239和活BCG的4/7的動物在挑戰后的60天期間令人驚奇地表現出檢測不到病毒載量水平(<10拷貝/ml)。3只其它的動物表現出典型的原發感染,在挑戰后10-14天之間具有血漿病毒載量峰值。但是,其定點病毒載量(103-105拷貝/ml)顯著低于對照動物的水平(>105)。?

C-I-III-陰道內施用藥物組合物后對重復靜脈內或直腸內SIVmac239挑戰的保護:?

兩及八個月后,靜脈內挑戰后具有不能檢測到的病毒載量的3只動物(組合物_1、_2、和_3)接受相同劑量病毒接種物的第二和第三次靜脈內挑戰。?

該組猴子的第二和第三次靜脈內病毒挑戰后,在第10天觀察到相似的低的血漿病毒載量峰值。但是,到病毒挑戰后30天,病毒載量再次變成不可檢測(圖3)。?

組合物初始施用后的16和23個月,一共已經有3次靜脈內挑戰的3只動物(組合物_1、_2、和_3)再一次被直腸內接種挑戰。?

如預期地,在2次連續的直腸內病毒挑戰后,這3只動物(其初始接受陰道內AT-2-失活SIVmac239加BCG)再次表現出檢測不到的(<10拷貝/ml)血漿病毒載量(圖3)。?

這些結果確立,抑制病毒復制的效率是穩定的,理由是該抑制在初始組合物施用后20個月以上仍然可以觀察到。?

C-I-IV-陰道內施用藥物組合物以及皮內加強后,對靜脈內或直腸內SIVmac239挑戰的保護:?

如預期的,跟隨靜脈內(對照17和18,圖4)或直腸內(對照19和20,圖5)病毒挑戰后,4只接受單獨活BCG陰道內施用的動物表現出典型的原發感染,如預期地,在挑戰后10-14天之間具有血漿病毒載量峰值(106-107vp/ml)。該對照動物組的血漿定點病毒載量到病毒挑戰后60天仍然高(>105拷貝/ml)。?

相反地,陰道內接受由AT-2失活的SIVmac239和活BCG制成的組合物以及用相同組合物皮內加強的3/4(75%)的動物(組合物14、15和17),在靜脈內?挑戰后60天期間,表現檢測不到的血漿病毒載量(<10拷貝/ml)(參見圖4)。剩余的1只動物(組合物16)表現原發感染,在挑戰后10-14天之間具有血漿病毒載量峰值(>105拷貝/ml)(參見圖4)。但是,其定點病毒載量在第60天達到相對低的水平(104拷貝/ml)。?

而且,接受陰道內由AT-2失活的SIVmac239和活BCG制成的組合物以及用相同組合物皮內加強的4/4(100%)的動物(組合物18-21),在直腸內挑戰后60天期間,表現檢測不到的血漿病毒載量(<10拷貝/ml)(參見圖5)。?

C-I-V-口服施用藥物組合物后對直腸內SIVmac239挑戰的保護:?

4只動物(組合物_22、_23、_24和_25)胃內施用1毫升含有AT2失活的病毒和活BCG的組合物。?

同時地,4只其它的動物(對照21-24)胃內給予1毫升單獨的活BCG。?

初次給予每個動物的相同的施用,在第一次施用步驟后第15天、30天和60天,再重復3次。?

結果表明,在直腸內病毒挑戰(在第90天進行)后,4只接受單獨的活BCG的動物(對照21-24)表現典型的原發感染,在挑戰后10-14天之間具有血漿病毒載量峰值(106-107拷貝/ml),而4只接受AT-2失活的SIV和活BCG的組合物的動物(組合物_22-25)令人驚奇地表現出檢測不到的血漿病毒載量(<10拷貝/ml;在第10-14天之間)(圖6)。?

C-I-VI-施用由AT2失活的病毒和活BCG制成的組合物后免疫相關和對SIVmac239挑戰的保護:?

在處理動物的血液中沒有檢測到針對SIV的全身抗體。但是,當使用皮內加強組合物施用時,檢測到一些特異性全身體液反應。因而,觀察到的對處理動物的抗SIV感染的保護并不是來自全身的體液反應。?

而且,通過ELIspot沒有檢測到常規的產生SIV特異性γ干擾素的細胞毒性T淋巴細胞(數據未顯示)。為了評估SIV特異性非常規細胞反應是否存在的目的,對每個處理或對照動物提取血液樣品,根據常規方法從每個樣品純化CD4+和CD8+細胞。培養事先獲得的CD4+細胞,然后根據常規方法用SIV?mac239感染。然后,在存在或不存在事先獲得的自體同源CD8+細胞時培養SIV感染的CD4+細胞5天。通過定量實時PCR分析上清SIV濃度。?

圖7表明在存在或不存在圖2表示的實驗的過程中獲得的自體同源CD8+細胞時,獲得的SIV感染的CD4+中病毒復制的抑制倍數。測試的CD8獲自通過陰道內途徑接受AT2失活的病毒和BCG組合物(組合物_7-13)的動物或來自對照動物(對照6-10)。?

結果表明來自被保護免受病毒感染的動物(組合物_7、組合物_8、組合物_10和組合物_11)的CD8T細胞在SIV感染的CD4細胞中提供了大于20倍的病毒抑制水平,而來自沒有被保護免受病毒感染的動物(組合物_9、組合物_12、和組合?物_13)的CD8T細胞提供了小于或等于10倍的病毒抑制水平(圖7)。而且,也在圖1所示的被保護免受靜脈內病毒挑戰的4只動物中觀察到大于20倍的病毒抑制(數據未顯示)。?

圖8表明在存在或不存在圖6表示的實驗的過程中獲得的自體同源CD8+細胞時,獲得的SIV感染的CD4+中病毒抑制水平。測試的CD8獲得自通過口服施用AT2失活的病毒和BCG接受組合物(組合物_22-25)的4只動物或來自4只對照動物(對照21-24)。?

圖9表明在存在或不存在圖6表示的實驗的過程中獲得的自體同源CD8+細胞時獲得的SIV(P27+)感染的CD4細胞群中T細胞激活(Ki-67+)水平。測試的CD8獲得自通過口服施用AT2失活的病毒和BCG接受組合物(組合物_22-25)的4只動物或來自4只對照動物(對照21-24)。在4只接受組合物的動物中觀察到由自體同源CD8+T細胞的CD4+T細胞激活的SIV特異性抑制。?

這些結果確認了,由陰道內或口服施用AT2失活的和BCG獲得的全身或粘膜SIV感染的預防,誘導了一種免疫耐受狀態,該免疫耐受狀態的特征在于與SIV感染的CD4細胞無反應性相關的非細胞毒性的CD8+T細胞反應。結合這些結果,因而,BCG被鑒定為致耐受佐劑。?

總之,這些發現第一次證實了通過陰道內或口服(或胃內)施用由失活的SIV病毒和活BCG制成的組合物實現對SIV抗原免疫耐受的穩定狀態。同時,其還第一次表明陰道內或口服施用根據本發明的含有AT2失活的SIV病毒和活BCG的藥物組合物有效地(>50%)預防直腸內或靜脈內挑戰后的慢性病毒感染。?

C-II植物乳桿菌用作致耐受載體

C-II-I-由口服聯合施用雙失活的SIV和植物乳桿菌(iSIV/VP)誘導的SIV特異性免疫耐受

在一方面,在用口服iSIV/LP處理的動物中沒有檢測到SIV特異性抗體(IgG、IgM和IgA)(圖10a)。在另一方面,在iSIV/LP處理的動物中沒有觀察到顯著的SIV?P27-特異性外周血CD4+T細胞增殖,而iSIV處理的動物表現出顯著的P27特異性外周血CD4+T細胞增殖。?

C-II-II-非細胞毒性CD8+細胞的抗激活和抗病毒活性

在iSIV/LP處理的和iSIV處理的動物中均觀察到SIV?P27-特異性外周血CD8+T細胞增殖(圖10b)。但是,在iSIV/LP處理的動物中沒有檢測到γ干擾素分泌T細胞(在細胞外刺激時),去除CD8+或CD25+細胞并不能改變P27-特異性效應T細胞的無反應性(圖10c)。而且,在來自iSIV/LP處理動物的急性體外感染的PBMC中還觀察到由非細胞毒性CD8+T細胞強烈地抑制感染的(P27+)CD4+T細胞激活(Ki-67+),去除CD25+細胞并不改變CD25-CD8+T細胞產生的對感染的CD4+T細胞激活的強烈抑制(圖10d)。?

注意這樣一個事實:在存在或不存在SEB和抗CD3/抗CD28抗體時,在共同孵育CD8+T細胞和用非復制的SIVmac239脈沖的CD4+T細胞后,通過高靈敏度的細胞毒性分析(Marchetti等人,1996)沒有檢測到細胞裂解(圖10e)。?

最后,來自iSIV/LP處理≥2個月的動物的外周血CD8+T細胞表現出強的對抗急性體外感染的自體同源CD4+T細胞中病毒復制的抑制活性(圖11a)。而且,在急性體外感染的異源CD4+T細胞中也觀察到這種CD8+T細胞強的抗病毒活性(圖11b),表明非經典的HLA1限制機制參與CD8+T細胞的抑制性/抑制活性。?

取自用LP/iSIV≥2個月免疫早期的獼猴的純化外周血CD8+T細胞,對自體同源急性SIVmac239感染的CD4+T細胞(用SEB和抗CD3/抗CD28抗體過夜刺激,并共同培養5天)具有強的抗病毒活性。一旦SIV特異性CD4+T細胞激活建立(刺激后48小時),添加CD8+T細胞不再能抑制病毒復制(圖11c)。該觀察辯解了如之前的在人1型自體免疫型糖尿病的研究中表明的(Jiang等人,2010),在延長的培養中CD8+T細胞對靶(有效(productively)感染的)CD4+T細胞潛在的裂解。該CD8+T細胞介導的抗病毒活性需要細胞-細胞間的接觸(圖11d),而且也是經典MHC1a非限制的,如通過來自其它免疫動物或來自對照動物的急性感染的CD4+T細胞上由CD8+T細胞產生的強的病毒復制的抑制所示的(圖11e)。最后,CD8介導的抗病毒活性被抗MHC-1b/E抗體阻斷,而不被抗MHC-1a/ABC抗體阻斷,表明非經典的MHC-1b/E限制的CD8+T細胞活性(圖11f)。?

確立了CD8+T細胞TCR表達對識別由靶CD4+T細胞攜帶的MHC-1b/E肽復合物是必要的(Sarantopoulos等人,2004;Van?Kaer,2010)。使用通過綴合抗體的磁微珠體外去除,表明TCRγδ和Vβ8不參與病毒復制的CD8+T細胞抑制(圖11g)。因而,TCRαβ看起來在識別感染的CD4+T細胞上提呈的MHC-1b/E肽中起重要作用。而且,通過用與非人靈長類膜CD(參見“分化群(Cluster?Differentiation)”)(CD7、CD11a、CD16、CD25(IL-2RA)、CD27、CD28、CD39、CD62L、CD95、CD101、CD122(IL-2RB)、CD127(IL-7R)、CD129(IL-9R)、CD137、CD150、CD183(CXCR3)、CD184(CXCR4)、CD195(CCR5)、CD196(CCR6)、CD197(CCR7)、CD215(IL-15Ra)、CD218(IL-18Ra)、CD223(LAG3)、CD226、CD247、CD272、CD277、CD279(PD-1)、CD305(LAIR1)和CD357)抗原交叉反應的可獲的抗人抗體去除CD8+T細胞,沒有鑒定到與MHC-1b/E限制的CD8+T細胞活性相關的CD抗原(表1)。以下的表1表明首次免疫研究(免疫No.1)中、在CD抗原限定的亞群去除之前和之后*,取自8只iSIV/LP免疫動物的CD8+T細胞的抗病毒活性(抑制倍數,幾何平均值±SE)。?

表1?

*在實驗的每個批次,進行來自8只iSIV/LP免疫動物的、用2個抗CD抗原的抗體去除(或不去除)的CD8+T細胞的抗病毒活性(抑制倍數,幾何平均值±SE。?

C-II-III通過口服免疫耐受保護動物免于直腸內挑戰

施用口服iSIV/LP或對照制劑后3個月,用單次高劑量(100,000TCID50)SIVmac239直腸內挑戰8只iSIV/LP免疫的和7只對照動物。8只iSIV/LP處理動物中8只被保護免于致病SIVmac239的直腸內挑戰,而4只iSIV處理的和4只LP處理的動物被相同的直腸內病毒挑戰感染(圖12a和b,圖的左部分)。?

C-II-IV通過口服免疫耐受保護動物免于靜脈內挑戰

第一次挑戰后兩個月,8只猴子中的4只通過靜脈內途徑接受第二次挑戰(200TCID50)。在挑戰后第10天,其所有均顯示輕度的復制峰值(≤200SIV?DNA拷貝/百萬PBMC以及200SIV?RNA拷貝/ml血漿);但是,到第30天,PBMC?SIV?DNA降低至≤10拷貝/百萬細胞,以及血漿SIV?RNA不可檢測(≤10拷貝/ml),表明沒有體內病毒的活性復制(圖12a和b,圖的右部分)。相反地,接受相同靜脈內SIVmac239挑戰(200TCID50)的2只未處理動物被成功地感染。4只剩余的猴子被直腸內再次挑戰(100.000TCID50),其全部被完全保護(圖12a和b,圖?的右部分)。?

C-II-V確認體內CD8+T細胞的作用

該第二次挑戰后5個月,為了確認CD8+T細胞的體內作用,在一周的期間(免疫后第300、304和307天)向8只已經被挑戰的猴子給予3次小鼠-人嵌合單克隆抗CD8抗體(cMT-807,Centocor)靜脈內注射,以暫時地從其外周血和淋巴樣器官中去除其CD8+T細胞(圖13a&b)。在4只由直腸內途徑再挑戰的獼猴中沒有檢測到病毒RNA或DNA的出現,再一次證明其完全的無菌保護;相反地,如其血漿病毒載量峰值為106RNA拷貝/ml、以及其PBMC和淋巴結原病毒載量到第15天達到104DNA拷貝/106個細胞(CD8+T細胞去除的最低點)所示的,從4只靜脈內挑戰的動物淋巴樣器官去除CD8+T細胞伴隨強的病毒復制;到第60-90天,當4只猴子恢復基線CD8+T細胞濃度時,血漿SIV?RNA和PBMC和淋巴結SIVDNA也恢復至基線水平(圖13c、d&e)。這確認了iSIV/LP誘導的CD8+T細胞在控制靜脈內SIV挑戰動物體內病毒復制中的獨特作用,其中推測有復制能力的病毒潛伏在靜止的記憶CD4+T細胞中。?

第二次挑戰后8個月,4只直腸內再挑戰的猴子以及4只靜脈內再挑戰的猴子接受第三次挑戰,此次用SIVB670(100,000TCID50)一種不同的感染性SIV株,經直腸途徑。如其檢測不到的SIVB670DNA和RNA水平,而2只未處理動物被相同的SIVB670挑戰成功地感染所示,在隨后的12個月8只動物保留了完全的保護,這表明LP/iSIVmac239產生的MHC-1b/E限制的CD8+T細胞,通過防止被其它SIV株感染的CD4+T細胞激活,是交叉保護的(圖14a&b)。?

為了確定iSIV/LP處理的動物中預防SIV疾病的有效期間,在8只新的中國來源的獼猴中進行了用iSIV/LP的第二次免疫,沒有SIV挑戰檢測了隨時間的其CD8+T細胞的體外抗病毒活性。與用LP(n=4)或單獨的iSIV(n=4)處理的對照動物比較,檢測了來自免疫后60天的該體外抗病毒活性。?

8只猴子中的7只直至第420天保持了離體抗SIV活性水平,而1只猴子的抗病毒活性從第360天漸進地下降,到第420天達到對照猴子的基線水平(圖15a)。在免疫后第420天,用100,000TCID50SIVmac239直腸內挑戰16只動物。8只iSIV/LP免疫動物中的7只獲得了無菌免疫,在血漿和PBMC中(圖15b&c)、以及在直腸粘膜的淋巴細胞中(其從挑戰后第1天測量)和盆腔淋巴結中(圖16a至16e)沒有任何SIV?RNA和DNA出現,而1只免疫的猴子完全感染。重要地,8只接種猴子的離體抗病毒活性的進化允許根據7只被保護的猴子和1只未被保護的猴子免疫后360天進行預測(即,其挑戰前60天)(圖15a至c)。?

C-II-VI結論

文中公開了,在獼猴模型中,失活的SIVmac239(iSIV)和共生植物乳桿菌(LP)(稱為致耐受佐劑)的施用產生了MHC-1b/E限制的CD8+T細胞,其誘導SIV抗原提呈CD4+T細胞激活的抑制,從而抑制SIV復制,并保護獼猴免受SIV挑戰。?

由失活的iSIV和LP制成的混合物胃內施用至一共16只動物和15只對照。4至14個月后,用致病SIVmac239直腸內挑戰所有動物。?

16只iSIV/LP施用的動物中15只中觀察到完全的抗SIV感染保護;相反地,在所有對照動物和1只接種猴子中確立了感染。在直腸內挑戰前60天可通過離體抗病毒分析預測未被保護的猴子。在4只猴子中靜脈內給予第二次SIVmac239挑戰和另外4只猴子中直腸內給予第二次SIVmac239挑戰后,8只被保護的動物保留了被保護性。?

8只iSIV/LP遞送的猴子完全沒有SIV特異性外周血CD4+T細胞增殖,并且沒有產生任何全身的SIV特異性抗體(IgG、IgM或IgA)。?

而且,其SIV特異性外周血CD8+T細胞具有一些特點:?

1)在體外刺激時其很好地增殖但是沒有γ干擾素分泌;?

2)其強烈地抑制急性感染的自體同源CD4+T細胞的激活;?

3)去除CD25+細胞后兩種功能均保持不變;?

4)其還抑制急性感染的同種異體CD4+T細胞中SIV復制;和?

5)其抑制性/抑制作用是MHC-1b/E限制的。?

這些結果表明胃內聯合施用iSIV和LP允許獼猴產生病毒特異性非細胞毒性MHC-1b/E限制的CD8+調節性T細胞,其產生SIV特異性免疫耐受,而且非常令人驚奇地,該病毒特異性免疫耐受與抗SIV感染確立的動物的疫苗保護相關。?

以上表明根據本發明的藥物組合物預防人/哺乳動物中HIV和SIV的感染。該預防的作用通過誘導致耐受接種的受試者(即,施用了藥物組合物的哺乳動物)中“Ts”免疫耐受在獼猴中獲得。所述“Ts”免疫耐受文中指包括病毒特異性非細胞毒性MHC-1b/E限制的抑制性CD8調節性T細胞,其存在和活性表明:?

-抑制已經施用本發明的藥物組合物的獼猴的急性感染的CD4+T細胞中SIV的復制(體外);和/或?

-預防用感染的SIV挑戰的致耐受接種的獼猴中SIV復制(體內)。?

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