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一種三七花藥愈傷組織的誘導方法.pdf

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一種 三七 花藥 組織 誘導 方法
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申請專利號:

CN201711451016.4

申請日:

20171227

公開號:

CN108064692A

公開日:

20180525

當前法律狀態:

有效性:

審查中

法律詳情:
IPC分類號: A01H4/00 主分類號: A01H4/00
申請人: 康美藥業(文山)藥材種植管理有限公司
發明人: 許冬瑾,嚴新
地址: 663099 云南省文山壯族苗族自治州文山市開化南路文山中國中藥生物谷4-21
優先權: CN201711451016A
專利代理機構: 廣州市越秀區哲力專利商標事務所(普通合伙) 代理人: 邵穗娟;湯喜友
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法律狀態
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CN201711451016.4

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法律狀態公告日:

法律狀態類型:

摘要

本發明公開了一種三七花藥愈傷組織的誘導方法,包括:消毒滅菌步驟:取三七的花蕾,依次用酒精和氯化汞溶液浸泡消毒滅菌后,用無菌水沖洗;然后取花藥接種于誘導培養基;誘導培養步驟:在光照度1500?2000LX,溫度21?25℃的條件下,進行愈傷組織誘導60?100d;增殖培養步驟:將經誘導培養的愈傷組織切塊后轉接入增殖培養基中,光照度1500?2000LX,溫度21?25℃的條件下,進行增殖培養20?60d,得到經增殖的愈傷組織;得到經增殖的愈傷組織;該誘導方法能夠大大提高組織培養的效率。

權利要求書

1.一種三七花藥愈傷組織的誘導方法,其特征在于包括:消毒滅菌步驟:取三七的花蕾,依次用酒精和氯化汞溶液浸泡消毒滅菌后,用無菌水沖洗;然后取花藥接種于誘導培養基;所述誘導培養基為以MS培養基作為基礎,加入2,4-D、激動素、蔗糖和瓊脂后得到的培養基;2,4-D在誘導培養基中的濃度為0.5-1.2mg/L,激動素在誘導培養基中的濃度為0.25-0.6mg/L,蔗糖在誘導培養基中的濃度為50-70g/L,誘導培養基的pH為5.4-5.8;誘導培養步驟:在光照度1500-2000LX,溫度21-25℃的條件下,進行愈傷組織誘導60-100d;增殖培養步驟:將經誘導培養的愈傷組織切塊后轉接入增殖培養基中,光照度1500-2000LX,溫度21-25℃的條件下,進行增殖培養20-60d,得到經增殖的愈傷組織。2.如權利要求1所述的誘導方法,其特征在于,消毒滅菌步驟中,用體積百分比為75%的酒精浸泡30s。3.如權利要求1所述的誘導方法,其特征在于,消毒滅菌步驟中,用質量百分比為0.1%的氯化汞溶液浸泡10min。4.如權利要求1所述的誘導方法,其特征在于,誘導培養步驟中,在光照度1600LX,光照時間12h/d,溫度22℃的條件下,進行愈傷組織誘導。5.如權利要求1所述的誘導方法,其特征在于,增殖培養步驟中,光照度1800LX,光照時間12h/d,溫度24℃的條件下,進行增殖培養。6.如權利要求1所述的誘導方法,其特征在于,2,4-D在誘導培養基中的濃度為1mg/L,激動素在誘導培養基中的濃度為0.5mg/L,蔗糖在誘導培養基中的濃度為60g/L,誘導培養基的pH為5.6。7.如權利要求1所述的誘導方法,其特征在于,所述增殖培養基為以MS培養基作為基礎,加入2,4-D、激動素、蔗糖和瓊脂后得到的培養基;2,4-D在增殖培養基中的濃度為0.7-1.8mg/L,激動素在增殖培養基中的濃度為0.25-0.6mg/L,增殖培養基的pH為5.4-5.8。8.如權利要求7所述的誘導方法,其特征在于,2,4-D在增殖培養基中的濃度為1.5mg/L,激動素在增殖培養基中的濃度為0.5mg/L,蔗糖在增殖培養基中的濃度為30g/L,增殖培養基的pH為5.6。9.如權利要求1或7所述的誘導方法,其特征在于,所述MS培養基包括按重量份計的以下成分:大量元素:硝酸鉀1640-1660份;硝酸銨1890-1910份;硫酸鎂360-380份;磷酸二氫鉀160-180份;微量元素:碘化鉀8-9份;硼酸60-63份;硫酸錳223-230份;硫酸鋅85-88份;鉬酸鈉2.4-2.6份;硫酸銅0.24-0.26份;氯化鈷0.24-0.26份;氯化鈣:330-350份;EDTA-Fe:63-67份;有機組分:肌醇98-102份;煙酸0.45-0.55份;鹽酸吡哆醇0.45-0.55份;維生素B0.095-0.105份;甘氨酸1.9-2.1份。

說明書

技術領域

本發明涉及一種三七花藥愈傷組織的誘導方法,屬于組織培養技術領域。

背景技術

三七Panax notoginseng(Burk.)F.H.Chen為五加科Araliacea e人參屬Panax Linn.多年生草本植物,是我國特有的名貴中藥材,主產于云南文山。具有止血散淤、消腫止痛、補虛強壯等功效。三七用作日常保健具有悠久的歷史,最早可追述到唐代。近年來由于三七在心腦血管方面的獨特療效越來越被人們所認可,需求量也越來越大。三七對生長生態環境具有特殊要求,其適宜栽培區域小。加之生長周期長、病蟲害嚴重等問題,使得三七品種選育十分困難。

采用植物組織培養技術對其進行無性繁殖是保存和利用該物種資源的重要途徑,且繁殖周期短、效率高。花藥培養可產生來源于花粉的單倍體植株,在作物育種上具有重要價值。不僅純合速度快,可選擇效率高,而且可提高育種效率,克服遠緣雜交不育,創造新種質等。現有技術中,對植物的誘導愈傷培養過程差別不大,但是如果對不同的植物采用同樣的組織培養過程,并不能很好地激發植物的特性而提高組織培養的速度,迄今,針對三七花藥的組織培養研究未見報道。

發明內容

為了克服現有技術的不足,本發明的第一個目的在于提供一種三七花藥愈傷組織的誘導方法,該誘導方法針對三七花藥進行愈傷組織的培養,能夠大大提高組織培養的效率。

實現本發明的目的可以通過采取如下技術方案達到:一種三七花藥愈傷組織的誘導方法,包括:

消毒滅菌步驟:取三七的花蕾,依次用酒精和氯化汞溶液浸泡消毒滅菌后,用無菌水沖洗;然后取花藥接種于誘導培養基;

所述誘導培養基為以MS培養基作為基礎,加入2,4-D、激動素、蔗糖和瓊脂后得到的培養基;2,4-D在誘導培養基中的濃度為0.5-1.2mg/L,激動素在誘導培養基中的濃度為0.25-0.6mg/L,蔗糖在誘導培養基中的濃度為50-70g/L,誘導培養基的pH為5.4-5.8;

誘導培養步驟:在光照度1500-2000LX,溫度21-25℃的條件下,進行愈傷組織誘導60-100d;

增殖培養步驟:將經誘導培養的愈傷組織切塊后轉接入增殖培養基中,光照度1500-2000LX,溫度21-25℃的條件下,進行增殖培養20-60d,得到經增殖的愈傷組織。

進一步地,消毒滅菌步驟中,用體積百分比為75%的酒精浸泡30s。

進一步地,消毒滅菌步驟中,用質量百分比為0.1%的氯化汞溶液浸泡10min。

進一步地,誘導培養步驟中,在光照度1600LX,光照時間12h/d,溫度22℃的條件下,進行愈傷組織誘導。

進一步地,增殖培養步驟中,光照度1800LX,光照時間12h/d,溫度24℃的條件下,進行增殖培養。

進一步地,2,4-D(2,4-二氯苯氧乙酸)在誘導培養基中的濃度為1mg/L,激動素在誘導培養基中的濃度為0.5mg/L,蔗糖在誘導培養基中的濃度為60g/L,誘導培養基的pH為5.6。

進一步地,所述增殖培養基為以MS培養基作為基礎,加入2,4-D、激動素、蔗糖和瓊脂后得到的培養基;2,4-D在增殖培養基中的濃度為0.7-1.8mg/L,激動素在增殖培養基中的濃度為0.25-0.6mg/L,增殖培養基的pH為5.4-5.8。

進一步地,2,4-D在增殖培養基中的濃度為1.5mg/L,激動素在增殖培養基中的濃度為0.5mg/L,蔗糖在增殖培養基中的濃度為30g/L,增殖培養基的pH為5.6。

進一步地,所述MS培養基包括按重量份計的以下成分:

大量元素:硝酸鉀1640-1660份;硝酸銨1890-1910份;硫酸鎂360-380份;磷酸二氫鉀160-180份;

微量元素:碘化鉀8-9份;硼酸60-63份;硫酸錳223-230份;硫酸鋅85-88份;鉬酸鈉2.4-2.6份;硫酸銅0.24-0.26份;氯化鈷0.24-0.26份;

氯化鈣:330-350份;

EDTA-Fe:63-67份;

有機組分:肌醇98-102份;煙酸0.45-0.55份;鹽酸吡哆醇0.45-0.55份;維生素B10.095-0.105份;甘氨酸1.9-2.1份。

相比現有技術,本發明的有益效果在于:

本發明的針對三七花藥的組織培養特點進行進一步的研究,改善了組織培養中的條件,能夠更好地刺激植物生長,大大提高了三七花藥愈傷組織的誘導率,本發明對三七花藥愈傷組織的誘導率達到90%以上。

附圖說明

圖1為實施例2誘導培養1d的組織生長情況;

圖2為實施例2誘導培養30d的組織生長情況;

圖3為實施例2誘導培養90d的組織生長情況;

圖4為實施例2增殖培養1d的組織生長情況;

圖5為實施例2增殖培養45d的組織生長情況。

具體實施方式

下面,結合具體實施方式,對本發明做進一步描述:

一種三七花藥愈傷組織的誘導方法,包括:

消毒滅菌步驟:取三七的花蕾,依次用體積百分比為75%的酒精浸泡30s和用質量百分比為0.1%的氯化汞溶液浸泡10min后,用無菌水沖洗6次;然后在無菌條件下,取花藥接種于誘導培養基;

誘導培養基為以MS培養基作為基礎,加入2,4-D、激動素、蔗糖和瓊脂后得到的培養基;2,4-D在誘導培養基中的濃度為0.5-1.2mg/L,激動素在誘導培養基中的濃度為0.25-0.6mg/L,蔗糖在誘導培養基中的濃度為50-70g/L,,誘導培養基的pH為5.4-5.8;

誘導培養步驟:在光照度1500-2000LX,光照時間12h/d,溫度21-25℃的條件下,進行愈傷組織誘導60-100d;

增殖培養步驟:將經誘導培養的愈傷組織切塊后轉接入增殖培養基中,光照度1500-2000LX,光照時間12h/d,溫度21-25℃的條件下,進行增殖培養20-60d,得到經增殖的愈傷組織。

作為優選的實施方式,增殖培養基為以MS培養基作為基礎,加入2,4-D、激動素、蔗糖和瓊脂后得到的培養基;2,4-D在增殖培養基中的濃度為0.7-1.8mg/L,激動素在增殖培養基中的濃度為0.25-0.6m g/L,蔗糖在增殖培養基中的濃度為30g/L;增殖培養基的pH為5.4-5.8。

作為優選的實施方式,MS培養基包括按重量份計的以下成分:

大量元素:硝酸鉀1640-1660份;硝酸銨1890-1910份;硫酸鎂360-380份;磷酸二氫鉀160-180份;

微量元素:碘化鉀8-9份;硼酸60-63份;硫酸錳223-230份;硫酸鋅85-88份;鉬酸鈉2.4-2.6份;硫酸銅0.24-0.26份;氯化鈷0.24-0.26份;

氯化鈣:330-350份;

EDTA-Fe:63-67份;

有機組分:肌醇98-102份;煙酸0.45-0.55份;鹽酸吡哆醇0.45-0.55份;維生素B10.095-0.105份;甘氨酸1.9-2.1份。

實施例1-3:

實施例1-3所使用的誘導培養基和增殖培養基均通過以下方法制備得到:

配制MS培養基溶液:分別配制大量元素溶液、微量元素溶液、氯化鈣溶液、EDTA-Fe溶液、有機組分溶液,然后混合;

配制激素溶液:分別配制2,4-D溶液和激動素溶液;

混合步驟:MS培養基溶液、2,4-D溶液、激動素溶液、蔗糖和瓊脂混合并溶解,調節pH至5.6后定容至1L即得。

其中EDTA-Fe通過EDTA-2Na和FeSO4制備得到。

最終得到的誘導培養基中各組分的濃度如表格1所示:

表格1 誘導培養基中的成分濃度

最終得到的增殖培養基中各組分的濃度如表格2所示:

表格2 增殖培養基中的成分濃度

實施例1的誘導方法為:

消毒滅菌步驟:取三七的花蕾,依次用體積百分比為75%的酒精浸泡30s和用質量百分比為0.1%的氯化汞溶液浸泡10min后,用無菌水沖洗6次;然后在無菌條件下,取花藥接種于誘導培養基;

誘導培養步驟:在光照度1600LX,光照時間12h/d,溫度21℃的條件下,進行愈傷組織誘導90d;

誘導培養30d花藥表面表淺褐色,似死亡狀態,培養至60d花藥上長出團狀針眼大小的愈傷組織,培養至90d花藥愈傷組織長至鉛筆頭大小,呈淺黃色或淺黃綠色,愈傷組織誘導率達89.03%;

增殖培養步驟:將經誘導培養的愈傷組織切塊后轉接入增殖培養基中,光照度1600LX,光照時間12h/d,溫度25℃的條件下,進行增殖培養45d,得到經增殖的愈傷組織;

增殖培養25d后,愈傷組織大量增殖,45d后增殖系數9.75,愈傷組織呈黃綠色或綠黃色,團狀,質地較疏松,具有分化叢芽的趨勢。

實施例2的誘導方法為:

消毒滅菌步驟:取三七的花蕾,依次用體積百分比為75%的酒精浸泡30s和用質量百分比為0.1%的氯化汞溶液浸泡10min后,用無菌水沖洗6次;然后在無菌條件下,取花藥接種于誘導培養基;

誘導培養步驟:在光照度1600LX,光照時間12h/d,溫度22℃的條件下,進行愈傷組織誘導90d;圖1為誘導培養1d的三七花藥誘導情況;

圖2為誘導培養30d,花藥表面表淺褐色,似死亡狀態,培養至60d花藥上長出團狀針眼大小的愈傷組織,圖3為誘導培養至90d,培養至90d花藥愈傷組織長至鉛筆頭大小,呈淺黃色或淺黃綠色,愈傷組織誘導率達91.03%;

增殖培養步驟:將經誘導培養的愈傷組織切塊后轉接入增殖培養基中,光照度1800LX,光照時間12h/d,溫度24℃的條件下,進行增殖培養45d,得到經增殖的愈傷組織;圖4為增殖培養1d的增殖情況;

增殖培養25d后,愈傷組織大量增殖,,圖5為增殖培養45d,增殖系數9.96,愈傷組織呈黃綠色或綠黃色,團狀,質地較疏松,具有分化叢芽的趨勢。

實施例3的誘導方法為:

消毒滅菌步驟:取三七的花蕾,依次用體積百分比為75%的酒精浸泡30s和用質量百分比為0.1%的氯化汞溶液浸泡10min后,用無菌水沖洗6次;然后在無菌條件下,取花藥接種于誘導培養基;

誘導培養步驟:在光照度1600LX,光照時間12h/d,溫度21℃的條件下,進行愈傷組織誘導90d;

誘導培養30d花藥表面表淺褐色,似死亡狀態,培養至60d花藥上長出團狀針眼大小的愈傷組織,培養至90d花藥愈傷組織長至鉛筆頭大小,呈淺黃色或淺黃綠色,愈傷組織誘導率達90.7%;

增殖培養步驟:將經誘導培養的愈傷組織切塊后轉接入增殖培養基中,光照度1800LX,光照時間12h/d,溫度22℃的條件下,進行增殖培養45d,得到經增殖的愈傷組織;

增殖培養25d后,愈傷組織大量增殖,45d后增殖系數9.88,愈傷組織呈黃綠色或綠黃色,團狀,質地較疏松,具有分化叢芽的趨勢。

對于本領域的技術人員來說,可根據以上描述的技術方案以及構思,做出其它各種相應的改變以及變形,而所有的這些改變以及變形都應該屬于本發明權利要求的保護范圍之內。

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