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一種NKT細胞凍存液及其制備方法.pdf

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一種 NKT 細胞 凍存液 及其 制備 方法
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摘要
申請專利號:

CN201711465081.2

申請日:

20171228

公開號:

CN108064840A

公開日:

20180525

當前法律狀態:

有效性:

審查中

法律詳情:
IPC分類號: A01N1/02 主分類號: A01N1/02
申請人: 重慶斯德姆生物技術有限公司
發明人: 王健,熊華強,秦連榮,熊榮騫,熊川粵
地址: 400020 重慶市江北區港城東環路6號6幢1-1
優先權: CN201711465081A
專利代理機構: 重慶百潤洪知識產權代理有限公司 代理人: 劉立春
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法律狀態
申請(專利)號:

CN201711465081.2

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法律狀態公告日:

法律狀態類型:

摘要

本發明公開了一種NKT細胞凍存液及其制備方法,該凍存液包括以下組分:人血白蛋白注射液、二甲基亞砜、聚乙二醇、葡萄糖注射液、生理鹽水注射液、車前草提取液、苦蕎黃銅、銀耳多糖、海帶多糖和羥乙基淀粉。該凍存液凍存液中不含有動物源血清,可避免引入污染和過敏原的風險,與常規細胞凍存液相比具有更高的臨床安全性。其凍存液配方簡單,各組分相互配合,協同作用可保持凍存復蘇后細胞狀態基本接近凍存前的狀態,活力也較高,可明顯提高NKT細胞的凍存效果。

權利要求書

1.一種NKT細胞凍存液,其特征在于,包括以下組分:人血白蛋白注射液、二甲基亞砜、聚乙二醇、葡萄糖注射液、生理鹽水注射液、車前草提取液、苦蕎黃銅、銀耳多糖、海帶多糖和羥乙基淀粉;其中,人血白蛋白注射液、二甲基亞砜、聚乙二醇、葡萄糖注射液、生理鹽水注射液的體積比為15-25:8-15:6-10:5-10:5-10;車前草提取液、苦蕎黃銅、銀耳多糖、海帶多糖、羥乙基淀粉的濃度分別為5-15mg/ml、1-4mg/ml、1-5mg/ml、2-4mg/ml和15-20mg/ml。2.根據權利要求1所述的NKT細胞凍存液,其特征在于,人血白蛋白注射液、二甲基亞砜、聚乙二醇、葡萄糖注射液、生理鹽水注射液的體積比為20:12:8:8:8。3.根據權利要求1或2所述的NKT細胞凍存液,其特征在于,人血白蛋白注射液中白蛋白的質量體積百分濃度為20%。4.根據權利要求1所述的NKT細胞凍存液,其特征在于,車前草提取液、苦蕎黃銅、銀耳多糖、海帶多糖、羥乙基淀粉的濃度分別為8mg/ml、2mg/ml、4mg/ml、3mg/ml和18mg/ml。5.根據權利要求1或4所述的NKT細胞凍存液,其特征在于,車前草提取液取通過以下方法制備得到:取車前草,清洗干凈后晾干,粉碎至80-100目,將粉末與無水乙醇以重量比為1-3:1混合,然后進行CO超臨界萃取,最后離心除雜,得脂溶性萃取物,向萃取余物中加入5-6倍重量的蒸餾水,在90-95℃加熱6-8h,然后過濾,濃縮,最后真空冷凍干燥得水溶性萃取物,合并兩次萃取物得車前草提取液。6.如權利要求1-5任一項所述的NKT細胞凍存液的制備方法,其特征在于,包括:(1)將二甲基亞砜、聚乙二醇和羥乙基淀粉混合,得溶液A;(2)將葡萄糖注射液和生理鹽水注射液混合,然后加入車前草提取液、苦蕎黃銅、銀耳多糖和海帶多糖,混勻,得溶液B;(3)將溶液A和溶液B混合,再加入人血白蛋白注射液中,混勻,制得。

說明書

技術領域

本發明屬于細胞凍存液技術領域,具體涉及一種NKT細胞凍存液及其制備方法。

背景技術

NKT(natural killer T)細胞是一群細胞表面既有T細胞受體TCR,又有NK細胞受體的特殊T細胞亞群。近幾年在NKT細胞的表型特征、分布及發育、免疫學效應及與疾病的關系、腫瘤治療和自身免疫性治療等方面的研究有了很大的發展。由于NKT細胞在腫瘤及免疫性疾病治療等方面的研究也決定了NKT細胞培養后凍存的重要性,在治療方面可以避免延時培養造成的細胞活性低,在經濟方面,避免了延時培養造成的成本增加,在研究方面,可將不同時期的NKT細胞凍存起來,研究其不同凍存時間的NKT細胞的活性。

但目前,通常采用添加不同比例的胎牛血清和二甲基亞砜配制成的凍存液來凍存NKT細胞,但添加二甲基亞砜只是為了從凍存過程中防止胞內冰晶的形成損傷細胞,而添加胎牛血清是為了保護細胞不受二甲基亞砜的損傷,同時還為細胞提供營養。但是胎牛血清屬于異源性物質,成分復雜,并存在引入污染和過敏原的風險,不適合臨床應用,特別是在細胞治療中,異源性蛋白的存在,可能會引起未知的不良反應,嚴重影響治療結果。

發明內容

針對現有技術中的上述不足,本發明提供了一種NKT細胞凍存液及其制備方法,該凍存液臨床安全性高,同時又能很好的保持凍存細胞的活性。

為實現上述目的,本發明解決其技術問題所采用的技術方案是:

一種NKT細胞凍存液,包括以下組分:人血白蛋白注射液、二甲基亞砜、聚乙二醇、葡萄糖注射液、生理鹽水注射液、車前草提取液、苦蕎黃銅、銀耳多糖、海帶多糖和羥乙基淀粉;其中,人血白蛋白注射液、二甲基亞砜、聚乙二醇、葡萄糖注射液、生理鹽水注射液的體積比為15-25:8-15:6-10:5-10:5-10;車前草提取液、苦蕎黃銅、銀耳多糖、海帶多糖、羥乙基淀粉的濃度分別為5-15mg/ml、1-4mg/ml、1-5mg/ml、2-4mg/ml和15-20mg/ml。

進一步地,人血白蛋白注射液、二甲基亞砜、聚乙二醇、葡萄糖注射液、生理鹽水注射液的體積比為20:12:8:8:8。

進一步地,人血白蛋白注射液中白蛋白的質量體積百分濃度為20%。

進一步地,車前草提取液、苦蕎黃銅、銀耳多糖、海帶多糖、羥乙基淀粉的濃度分別為8mg/ml、2mg/ml、4mg/ml、3mg/ml和18mg/ml。

進一步地,車前草提取液取通過以下方法制備得到:取車前草,清洗干凈后晾干,粉碎至80-100目,將粉末與無水乙醇以重量比為1-3:1混合,然后進行CO2超臨界萃取,最后離心除雜,得脂溶性萃取物,向萃取余物中加入5-6倍重量的蒸餾水,在90-95℃加熱6-8h,然后過濾,濃縮,最后真空冷凍干燥得水溶性萃取物,合并兩次萃取物得車前草提取液。

上述NKT細胞凍存液的制備方法,包括:

(1)將二甲基亞砜、聚乙二醇和羥乙基淀粉混合,得溶液A;

(2)將葡萄糖注射液和生理鹽水注射液混合,然后加入車前草提取液、苦蕎黃銅、銀耳多糖和海帶多糖,混勻,得溶液B;

(3)將溶液A和溶液B混合,再加入人血白蛋白注射液中,混勻,制得。

本發明提供的NKT細胞凍存液及其制備方法,具有以下有益效果:

(1)該凍存液凍存液中不含有動物源血清,可避免引入污染和過敏原的風險,與常規細胞凍存液相比具有更高的臨床安全性。

(2)本發明凍存液配方簡單,各組分相互配合,協同作用可保持凍存復蘇后細胞狀態基本接近凍存前的狀態,活力也較高,可明顯提高NKT細胞的凍存效果。

具體實施方式

實施例1

一種NKT細胞凍存液,包括以下組分:人血白蛋白注射液、二甲基亞砜、聚乙二醇、葡萄糖注射液、生理鹽水注射液、車前草提取液、苦蕎黃銅、銀耳多糖、海帶多糖和羥乙基淀粉;其中,人血白蛋白注射液、二甲基亞砜、聚乙二醇、葡萄糖注射液、生理鹽水注射液的體積比為15:8:6:5:5;人血白蛋白注射液中白蛋白的質量體積百分濃度為20%;車前草提取液、苦蕎黃銅、銀耳多糖、海帶多糖、羥乙基淀粉的濃度分別為5mg/ml、1mg/ml、1mg/ml、2mg/ml和15mg/ml。

其中,車前草提取液取通過以下方法制備得到:取車前草,清洗干凈后晾干,粉碎至100目,將粉末與無水乙醇以重量比為1:1混合,然后進行CO2超臨界萃取,最后離心除雜,得脂溶性萃取物,向萃取余物中加入5倍重量的蒸餾水,在90℃加熱8h,然后過濾,濃縮,最后真空冷凍干燥得水溶性萃取物,合并兩次萃取物得車前草提取液。

上述NKT細胞凍存液的制備方法,包括:

(1)將二甲基亞砜、聚乙二醇和羥乙基淀粉混合,得溶液A;

(2)將葡萄糖注射液和生理鹽水注射液混合,然后加入車前草提取液、苦蕎黃銅、銀耳多糖和海帶多糖,混勻,得溶液B;

(3)將溶液A和溶液B混合,再加入人血白蛋白注射液中,混勻,制得。

實施例2

一種NKT細胞凍存液,包括以下組分:人血白蛋白注射液、二甲基亞砜、聚乙二醇、葡萄糖注射液、生理鹽水注射液、車前草提取液、苦蕎黃銅、銀耳多糖、海帶多糖和羥乙基淀粉;其中,人血白蛋白注射液、二甲基亞砜、聚乙二醇、葡萄糖注射液、生理鹽水注射液的體積比為25:15:10:10:10;人血白蛋白注射液中白蛋白的質量體積百分濃度為20%;車前草提取液、苦蕎黃銅、銀耳多糖、海帶多糖、羥乙基淀粉的濃度分別為15mg/ml、4mg/ml、5mg/ml、4mg/ml和20mg/ml。

其中,車前草提取液取通過以下方法制備得到:取車前草,清洗干凈后晾干,粉碎至100目,將粉末與無水乙醇以重量比為3:1混合,然后進行CO2超臨界萃取,最后離心除雜,得脂溶性萃取物,向萃取余物中加入6倍重量的蒸餾水,在95℃加熱6h,然后過濾,濃縮,最后真空冷凍干燥得水溶性萃取物,合并兩次萃取物得車前草提取液。

上述NKT細胞凍存液的制備方法,包括:

(1)將二甲基亞砜、聚乙二醇和羥乙基淀粉混合,得溶液A;

(2)將葡萄糖注射液和生理鹽水注射液混合,然后加入車前草提取液、苦蕎黃銅、銀耳多糖和海帶多糖,混勻,得溶液B;

(3)將溶液A和溶液B混合,再加入人血白蛋白注射液中,混勻,制得。

實施例3

一種NKT細胞凍存液,包括以下組分:人血白蛋白注射液、二甲基亞砜、聚乙二醇、葡萄糖注射液、生理鹽水注射液、車前草提取液、苦蕎黃銅、銀耳多糖、海帶多糖和羥乙基淀粉;其中,人血白蛋白注射液、二甲基亞砜、聚乙二醇、葡萄糖注射液、生理鹽水注射液的體積比為20:12:8:8:8;人血白蛋白注射液中白蛋白的質量體積百分濃度為20%;車前草提取液、苦蕎黃銅、銀耳多糖、海帶多糖、羥乙基淀粉的濃度分別為8mg/ml、2mg/ml、4mg/ml、3mg/ml和18mg/ml。

其中,車前草提取液取通過以下方法制備得到:取車前草,清洗干凈后晾干,粉碎至100目,將粉末與無水乙醇以重量比為2:1混合,然后進行CO2超臨界萃取,最后離心除雜,得脂溶性萃取物,向萃取余物中加入7倍重量的蒸餾水,在95℃加熱6h,然后過濾,濃縮,最后真空冷凍干燥得水溶性萃取物,合并兩次萃取物得車前草提取液。

上述NKT細胞凍存液的制備方法,包括:

(1)將二甲基亞砜、聚乙二醇和羥乙基淀粉混合,得溶液A;

(2)將葡萄糖注射液和生理鹽水注射液混合,然后加入車前草提取液、苦蕎黃銅、銀耳多糖和海帶多糖,混勻,得溶液B;

(3)將溶液A和溶液B混合,再加入人血白蛋白注射液中,混勻,制得。

對比例1

對比例1為常規細胞凍存液,為含10%FBS的DMSO。

對比例2

對比例2與實施例3相比,缺少車前草提取液,其余與實施例3相同。

對比例3

對比例3與實施例3相比,缺少銀耳多糖和海帶多糖,其余與實施例3相同。

對比例4

對比例4與實施例3相比,缺少苦蕎黃銅,其余與實施例3相同。

試驗例

1、外周血單核細胞的分離

(1)抽取外周血,將生理鹽水和外周血按體積比為1:1混合,得到外周血稀釋液;

(2)按照淋巴細胞分離液與外周血稀釋液體積比為1:2比例把外周血稀釋液緩慢沿管壁加入淋巴細胞分離液上方,然后800g離心30min;

(3)離心結束后,從下到上分為4層,分別為粒細胞層與紅細胞層、淋巴細胞分離液層、PBMC層和血漿層,用吸管吸取PBMC層到另一離心管中,加入生理鹽水清洗,400g離心5min;

(4)離心結束后,棄上清,剩余的細胞沉淀即為PBMC,用RPMI1640培養基重懸細胞沉淀,并對細胞進行計數。

2、NKT細胞的培養

(1)將上述收集的PBMC用RPMI1640培養基進行重懸,按1×106個/mL的密度接種于培養瓶中,同時并添加生長因子IL-2500U/mL,IL-1530ng/mL,置于37℃、5%CO2培養箱中培養;

(2)誘導培養5天后,進行補液,全量補加IL-2500U/mL,IL-1530ng/mL,補液前細胞密度不大于3×106個/mL,補液后細胞密度在0.5-1.0×106個/mL,每隔3天補液和補加細胞生長因子,這樣培養直至14天后,收集細胞。

3、凍存實驗

分別用實施例1-3和對比例1-4制備的凍存液對培養后的NKT細胞進行重懸,使細胞密度為1.0×106個/mL,每個凍存管1mL,然后將凍存管先放入凍存盒中,再將凍存盒放入程序降溫儀中進行凍存,然后再將凍存管迅速轉移至液氮中凍存。

4、復蘇

(1)將恒溫水浴鍋加熱至37℃,迅速取出上述各組在液氮中凍存了1年的細胞凍存管,轉移至水浴鍋中并連續震蕩,直至完全溶解,再將溶解后的細胞懸液移至加有完全培養基的離心管中洗滌離心;

(2)將上述離心后的細胞用完全培養基重懸培養24h,按1.0×106個/mL細胞接種于培養瓶中,全量添加IL-2500U/mL和IL-1530ng/mL細胞生長因子,置于37℃、5%CO2培養箱中培養。

5、細胞形態檢測

將凍存前后各組NKT細胞在顯微鏡下觀察其細胞形態,結果表明復蘇后的細胞形態與凍存前細胞形態無明顯差異,細胞飽滿,透亮光澤,而且有較多的細胞結團。

6、細胞活率檢測

將凍存前后的NKT細胞進行染色計數,計算出細胞活率,實施例1-3和對比例1-4的細胞活率分別為96.7%、97.4%、98.9%、81.5%、90.1%、85.2%、88.7%。由此可知,本發明制備的凍存液凍存后復蘇的細胞活率接近凍存前,尤其是實施例3效果最佳,而相比對比例,實施例的細胞活率則明顯較高,而當本發明凍存液成分不全時,細胞活率明顯降低,但要高于常規凍存液凍存結果。

7、細胞殺傷活力檢測

采用乳酸脫氫酶法,以K562細胞為靶細胞,效靶比分別為40:1、20:1、10:1和5:1,檢測凍存前后的NKT細胞殺傷活力。檢測結果可知,各組NKT細胞對K562細胞的殺傷活力隨效靶比的增高而增強,實施例1-3的細胞復蘇后與凍存前細胞殺傷活力均無明顯差異,而對比例1-4復蘇后的細胞在不同的效靶比時殺傷力均低于凍存前的細胞,對比例1殺傷力最低。

8、凍存前后免疫表型檢測

將凍存前與復蘇后收集的NKT細胞用PBS重懸NKT細胞,密度為1.0×106個/mL,加入FITC標記的CD3和PE標記的CD56抗體,室溫避光孵育30min后,用流式細胞儀檢測。由檢測結果可知,實施例1-3比對比例1-4的免疫表型檢測結果高,對比例1結果最低,說明采用本發明提供的凍存液可明顯提高NKT細胞的凍存效果。

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