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一種篩選轉基因植物種子的方法.pdf

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一種 篩選 轉基因 植物種子 方法
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摘要
申請專利號:

CN201310677142.7

申請日:

20131212

公開號:

CN103651078A

公開日:

20140326

當前法律狀態:

有效性:

有效

法律詳情:
IPC分類號: A01G31/00,A01H1/04 主分類號: A01G31/00,A01H1/04
申請人: 浙江師范大學
發明人: 王長春,苗爽,馮彩芬,湯湖斌,閔康康,楊玲,胡海濤,張維林
地址: 321004 浙江省金華市迎賓大道688號
優先權: CN201310677142A
專利代理機構: 浙江杭州金通專利事務所有限公司 代理人: 向慶寧
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法律狀態
申請(專利)號:

CN201310677142.7

授權公告號:

法律狀態公告日:

法律狀態類型:

摘要

本發明提供一種篩選轉基因種子的方法,該方法包括:(1)、對需要篩選的種子進行消毒處理;(2)、提供無菌培養皿,在無菌培養皿中放置一張或多張無菌濾紙,使抗生素溶液濕潤每一張濾紙;(3)將經過步驟1消毒的種子播種在步驟2的培養皿中的濾紙表面上;其中,所述的種子為T0代煙草或擬南芥轉基因種子。通過該方法,可以提高后期苗的成活率,大大降低篩選成本和提交生產效率,特別的,在配置抗生素的時候,采用未滅菌的蒸餾水替代滅菌的水作為溶劑。

權利要求書

1.一種篩選轉基因種子的方法,該方法包括:(1)、對需要篩選的種子進行消毒處理;(2)、提供無菌培養皿,在無菌培養皿中放置一張或多張無菌濾紙,使抗生素溶液濕潤每一張濾紙;(3)將經過步驟1消毒的種子播種在步驟2的培養皿中的濾紙表面上;其中,所述的種子為T0代煙草或T0代擬南芥轉基因種子。2.根據權利要求1所述的方法,其特征在于,當種子為T0代煙草種子的時候,其中該轉基因種子中部分種子含有抗潮霉素的基因,濕潤所述濾紙的抗生素為40?mg/L的潮霉素溶液,讓每克濾紙吸收7毫升的潮霉素溶液,?其中,配置抗生素的溶劑為未滅菌的蒸餾水。3.根據權利要求1所述的方法,其特征在于,當種子為T0代擬南芥種子的時候,其中該轉基因種子中部分種子含有抗卡納霉素的基因,濕潤所述濾紙的抗生素為100?mg/L的卡納霉素溶液,讓每克濾紙吸收14毫升的卡納霉素溶液,其中,配置抗生素的溶劑為未滅菌的蒸餾水。4.根據權利要求2或3所述的方法,其特征在于,所述的消毒處理的步驟如下:先將適量待播的轉基因種子倒入1.5?mL無菌離心管中,加入75%乙醇處理30?s;棄去75%乙醇,加入20%次氯酸鈉處理20?s;棄去20%次氯酸鈉,用無菌蒸餾水洗滌種子3-4次。5.根據權利要求4所述的方法,其特征在于,在步驟3后,用封口膜密封無菌培養皿,并讓密封的培養皿處于黑暗環境,溫度24?±1℃,濕度為60%-75%下暗培養2-3天進行發芽。6.根據權利要求5所述的方法,其特征在于,對種子進行黑暗培養后,待種子萌發至剛露出胚根,且胚根的長度為1-3毫米時,進行光照培養,光照培養的條件為:溫度24?±?1℃、光照強度2000?Lux,光周期為16?h,直至轉基因幼苗長出兩片綠色子葉且陰性對照出現黃化后,將葉片呈綠色的幼苗播于營養土中。

說明書

技術領域

本發明屬于轉基因技術,特別的,屬于一種植物轉基因種子篩選技術。

背景技術

隨著基因工程技術的快速發展,植物轉基因技術被廣泛應用于現代生物技術研究及農業生產中。如何快速、便捷、高通量的篩選與種植轉基因植物是其中的一個重要環節。

傳統的方法是將T0代種子播種于含相應抗生素的培養基中,生長一定時間后出現表型分離,一般,帶有目標基因的陽性植株呈正常綠色,陰性植株則出現黃化。繼續生長至適宜苗齡時,從瓶中移出陽性植株栽種。該法雖被廣泛使用,但存在如下缺點:首先,要制備大量的培養基,這些培養基需要經過濕熱滅菌后,再加抗生素,最后倒制平板,然后再把種子播種在還有抗生素的培養基上,同時,種子也必須經過嚴格的消毒。這樣做不僅增加了試劑成本,且對無菌操作技術也提出了較高要求,整個過程都需要在無菌換進下進行操作,而且篩選的時間長。整個過程繁瑣,耗時長;其次,將組培苗移至營養土中時,由于根系扎入培養基,在去除殘留培養基時易損傷根系,及其顯著降低組培苗成活率;第三,在培養基中生長的小苗如果移栽太早,苗小,長勢弱,成活率非常低,需苗在組培瓶中生長至較大時再進行移栽,這樣做雖增加了移栽的成活率,卻延誤了時間;第四,種子消毒必須徹底,與清水相比,在培養基的長時間培養更易導致污染。有鑒于此,需要開發快速、高效與簡潔的播種及篩選轉基因種子技術。

發明內容

為了克服傳統方法的缺陷,本發明提供一種新型的轉基因種子播種及篩選技術,它有效地解決了傳統方法存在的上述弊端。

一方面,該本發明提供一種轉基因植物種子的篩選方法,該方法包括:對需要篩選的種子進行消毒處理;2、提供無菌培養皿,在無菌培養皿中放置一張或多張無菌濾紙,使抗生素溶液濕潤每一張濾紙;3、將經過步驟1消毒的種子播種在步驟2的培養皿中的濾紙表面上;其中,所述的種子為T0代煙草或擬南芥轉基因種子。

在一些優選的方式中,當種子為T0代煙草種子的時候,其中該轉基因種子中部分種子含有抗潮霉素的基因,濕潤所述濾紙的抗生素為40?mg/L的潮霉素溶液,讓每克濾紙吸收7毫升的潮霉素溶液。

在一些優選的方式中,,當種子為T0代擬南芥種子的時候,其中該轉基因種子中部分種子含有抗卡納霉素的基因,濕潤所述濾紙的抗生素為100?mg/L的卡納霉素溶液,讓每克濾紙吸收14毫升的卡納霉素溶液。

在一些優選的方式中,消毒處理的步驟如下:先將適量待播的轉基因種子倒入1.5?mL無菌離心管中,加入75%乙醇處理30?s;棄去75%乙醇,加入20%次氯酸鈉處理20?s;棄去20%次氯酸鈉,用無菌蒸餾水洗滌種子3-4次。

在另一些優選的方式中,先對種子進行黑暗培養,待種子萌發至剛露出胚根,且胚根的長度為1-3毫米時,進行光照培養,光照培養的條件為:溫度24?±?1℃、光照強度2000?Lux,光周期為16?h,直至轉基因幼苗長出兩片綠色子葉且陰性對照出現黃化后,將葉片呈綠色的幼苗播于營養土中。優選的,培根的長度小于2毫米的時候進行光照培養。優選的,用封口膜密封無菌培養皿,并讓密封的培養皿處于黑暗環境,溫度24?±1℃,濕度為60%-75%下暗培養2-3天進行發芽。

在一些優選的方式中,種子是轉基因煙草T0代種子。這里所所的T0代種子是目標基因被插入到組織或細胞基因組中獲得的當代種子,例如,當通過組織培養的方法,對某個植物的愈傷組織進行農桿菌介導法把某個目的外源基因插入到該植物的組織細胞中的基因序列中的某一個位置,然后通過培養獲得小苗,該小苗上的種子為T0代。在T0的種子中,有些可能還有目的基因,有的可能不含有目的基因。另外,在進行目的基因轉化中,可以把一些抗抗生素的基因與目的基因連接,如果轉化的種子中含有抗生素基因,就表示目的基因也被包含在該轉基因植物的種子中,當然,單獨的抗潮霉素或卡納霉素的基因也可以被轉入到植物中。常用的抗生素為抗潮霉素或卡納霉素的基因,這些基因的序列為現有公知的技術,轉基因植物的獲得方法也是本領域的公知技術。

在一些優選的方式中,消毒處理的步驟如下:先將適量待播的轉基因種子倒入1.5?mL無菌離心管中,加入75%乙醇處理30?s;棄去75%乙醇,加入20%次氯酸鈉處理20?s;棄去20%次氯酸鈉,用無菌蒸餾水洗滌種子3-4次。

在一些優選的方式中,濕潤濾紙的抗生素為40?mg/L,讓每克濾紙吸收大約7毫升的抗生素溶液,也可以是讓每克濾紙吸收大約6-9毫升的抗生素溶液。處理濾紙的抗生素溶液的量特別關鍵,我們發現,如果是煙草種子,且抗生素的濃度為40?mg/L的情況下,每克濾紙處理抗生素的量處于7毫升左右時篩選效果最好,有85-98%的正確率。相反,不在此篩選濃度左右下,篩選效果差,幾乎不能滿足篩選目的。含量太低,假陽性的種子特別多,絕大多數種子均發芽并正常生長,也不能滿足要求;含量太高,幾乎所有的種子(90%-95%)都不能萌發或正常的后期生長。

在優選的方式中,抗生素為潮霉素或卡納霉素。在一些優選的方式中,種子為煙草或擬南芥T0代轉基因種子。當轉基因種子為T0代擬南芥種子的時候,且種子中含有抗卡納霉素的基因的時候,讓每克濾紙吸收大約14毫升的100?mg/L含卡納霉素的溶液。

在一些優選的方式中,用封口膜密封無菌培養皿,并讓密封的培養皿處于黑暗環境,溫度24?±1℃,濕度為60%-75%下暗培養2-3天進行發芽。

在另一些優選的方式中,待種子萌發至剛露出胚根后,胚根的長度為1-3毫米下,進行光照培養,培養的條件為:溫度24?±?1℃、光照強度2000?Lux,光周期為16?h,直至轉基因幼苗長出兩片綠色子葉且陰性對照出現黃化后,將葉片呈綠色的幼苗播于營養土中,蓋保鮮膜以減少水分蒸發,繼續光照培養,培養的條件為:培養溫度24?±?1℃、光照強度2000?Lux,光周期為16?h。

有益效果

本發明通過濾紙上還有抗生素來篩選轉基因種子,相對與傳統的培養基篩選,更快速、更高效與簡潔,而且成本低。特別適用篩選T0代煙草和擬南芥轉基因種子。

附圖說明

圖1為實施例子2的實驗結果圖。A:陽性對照(培養皿內濾紙用不含相應濃度抗生素的蒸餾水浸潤,種子為野生型本氏煙);B:陰性對照(培養皿內濾紙用含相應濃度抗生素的蒸餾水浸潤,種子為野生型本氏煙);C:T0代轉基因種子。

圖?2實施例子2的結果實驗圖。A:幼苗移栽時合適的根長(3毫米);B:幼苗移栽時不適宜的根長(實際為23毫米)。

圖3?為實施例子2中轉基因苗生長的不同階段的結果圖。A:T0代轉基因種子播種于含相應濃度抗生素蒸餾水的培養皿中;B:T0代轉基因種子暗培養2-3?d后剛長出胚根;C:T0代轉基因種子經光照培養后已長出兩片綠色子葉,并產生3:1的分離比;D-E:移至營養土后的T0代轉基因幼苗。

圖4為轉基因與非轉基因擬南芥不同生長階段實驗結果圖;萌發?A:6?d;B:移苗1D??C:移苗5?D??D:移苗15D。

具體實施方式

現以潮霉素抗性轉基因煙草為例來說明本發明的一個具體方式,該方式并不是對本發明的限制。

實施1:濾紙中不同含量的抗生素溶液對T0代煙草種子萌發率和篩選效果的影響。

1.??實驗材料

含無菌濾紙的無菌培養皿、1.0?mL無菌槍頭(剪去槍頭頂端)、1.5?mL無菌離心管、75%乙醇、20%次氯酸鈉及無菌蒸餾水。?

2.??種子的消毒與播種的步驟如下:

①?????240顆待播的轉基因煙草T0代種子倒入1.5?mL無菌離心管中,加入1?mL的75%乙醇處理30?s;

②棄去75%乙醇,加入1?mL的20%次氯酸鈉處理20?s;

③棄去20%次氯酸鈉,用無菌蒸餾水洗滌3-4次;

④棄去無菌蒸餾水;

⑤提供含無菌濾紙的無菌培養皿,提供用無菌蒸餾水作為溶劑配置的40?mg/L含潮霉素的溶液,用以上含潮霉素的溶液將培養皿內的無菌濾紙打濕,其中,讓培養皿里的無菌紙含有不同含量的抗生素,具體如下(毫升/克濾紙):0、2.2、4.4、7.0、14.0。在露出胚根的時候統計發芽率(培根的長度為2毫米)。待種子萌發至剛露出胚根(2毫米長)后,光照培養4?d后,統計綠葉和黃化頁數目,并計算比率。培養的條件為:溫度24?±?1℃、光照強度2000?Lux,光周期為16?h)。

⑥用無菌1.0?mL槍頭將種子均勻播種于上述培養皿中的無菌紙表面上;

⑦在培養皿上封上封口膜,讓培養皿暗培養2-3?d,待種子萌發。

結果如下:

表1:濾紙上不同含量抗生素對煙草T0代轉基因種子發芽和篩選結果影響

從表1中可以看出,如果抗生素含量很低,0-4.4毫升/克濾紙,幾乎不能有效篩選目的基因種子,而當抗生素在濾紙上含量合適,7.0毫升每克濾紙,可以有效篩選含有目的基因的種子,他們的分離比大約為3:1。同樣,當抗生素在濾紙中含量太高的時候,種子萌發后,部分小苗表現出短根癥狀,達不到篩選的目的,且不利于后期的苗的生長和后期成活率。

實施2?:潮霉素抗性轉基因煙草種子T0代的篩選

3.??實驗材料

含無菌濾紙的無菌培養皿、1.0?mL無菌槍頭(剪去槍頭頂端)、1.5?mL無菌離心管、75%乙醇、20%次氯酸鈉及無菌蒸餾水。?

4.??種子的消毒與播種的步驟如下:

②?????240顆待播的轉基因T0種子倒入1.5?mL無菌離心管中,加入1?mL的75%乙醇處理30?s;

②棄去75%乙醇,加入1?mL的20%次氯酸鈉處理20?s;

③棄去20%次氯酸鈉,用無菌蒸餾水洗滌3-4次;

④棄去無菌蒸餾水;

⑤提供含無菌濾紙的無菌培養皿,及用無菌蒸餾水作為溶劑配置的40?mg/L含潮霉素的溶液,用5?mL的含潮霉素的溶液將培養皿內的無菌濾紙打濕,其中,每克無菌濾紙含7?mL潮霉素溶液;

⑥用無菌1.0?mL槍頭將種子均勻播種于上述培養皿中的無菌紙表面上;

⑦在培養皿上封上封口膜,讓培養皿暗培養2-3?d,待種子萌發。

5.??陽性植株的移栽

???待種子萌發至剛露出胚根(2毫米)后,光照培養2-4?d,培養的條件為:溫度24?±?1℃、光照強度2000?Lux,光周期為16?h,直至轉基因幼苗長出兩片綠色子葉且陰性對照出現黃化后,將葉片呈綠色的幼苗播于營養土中,蓋上保鮮膜以減少水分蒸發,繼續光照培養,培養條件為:溫度24?±?1℃、光照強度2000?Lux,光周期為16?h。

結果

由于T0代轉基因煙草種子為雜合體種子,經抗生素篩選后將發生分離,一般來講,對于單拷貝的轉基因株系,其分離比例大約為3:1,有175顆煙草T0代種子出現綠葉,54顆種子出現黃化,另有11顆種子沒有正常發芽。為了更準確知道煙草苗移栽的最佳時間,我們同時也設置野生型(不含抗潮霉素基因的對照煙草種子)本氏煙作為陰性對照以確定移苗時間,當野生型苗出現黃化時進行移苗。若移苗太早,無法判斷轉基因苗的后代的表型差異,易將假陽性植株移栽于營養土中。

表2:煙草轉基因種子培根不同長度下進行光照培養對轉基因植物后期成活率的影響

胚根長度 1毫米 2毫米 3毫米 3.5毫米 5毫米 7毫米 9毫米 后期苗的成活率 95% 94.5% 73% 78% 68% 65% 53%

為保證轉基因幼苗有較高的存活率,應注意以下幾點:

第一,對種子暗培養的時間不宜過長,防止幼苗莖桿徒長,子葉黃化,如果是煙草種子,時間應該是2-3?d;優選的為3天。另外,待種子萌發至剛露出胚根時(長度為1-3毫米),馬上進行光照培養,時間為2-4?d。經過我們的實驗,發現當胚根的長度大于3.5毫米以上才進行光照培養,則后期的苗的成活率也很低,只有78%的成活率,如果培根的長度大于10好毫米,后期的成活率只有50%左右。

第二,轉基因幼苗在培養皿中光照培養時間亦不宜過長,如果是煙草種子,時間應該是3-4天,其原因包括以下三點:首先,如果培養時間太長,容易導致幼苗根過度伸長,不利于栽培時成活;其次,如果培養時間太長,幼苗得不到足夠的養分,出現營養不良導致黃化;最后,長時間的培養易使幼苗玻璃化,不適于健壯成長。

第三,由于該技術所要解決的是在可區分表型的前提下盡可能早的移苗,這樣不僅節約時間,移栽效果也好。

第四,將幼苗移栽于營養土后,蓋上保鮮膜(保鮮膜戳一些洞)以減少水分蒸發,待幼苗生長健壯后再移去保鮮膜。

通過實驗發現,運用此方法將轉基因幼苗移栽于營養土后的存活率可達到90%以上,而且有效解決了傳統方法種子消毒必須徹底、工作量大等缺點,是一種適合于經多代篩選獲得轉基因純合體或對雜合體幼苗進行后續處理的良好方法,具體花費的時間只有10-15天。同樣,我們采用一般傳統的培養基來進行T0代種子的篩選,轉基因幼苗移栽于營養土后的存活率只有60%,花費的時間為大約50多天。

實施3:該方法在擬南芥轉基因陽性植株后代篩選的應用。

由于基因組小,易于遺傳轉化等優點,擬南芥是最廣泛被使用的研究基因功能的模式植物。除了用于研究自身基因功能外,還常用于研究其它物種中相關基因。為了驗證此法是否也適用其它具有類似特點的種子抗生素篩選,我們嘗試該篩選法是否也適用于擬南芥。

1.實驗材料:轉基因的T1代擬南芥(卡那霉素抗性)

2.種子的消毒與播種的步驟如下:

取240顆待播的轉基因擬南芥種子放入1.5?mL無菌離心管中,加入1?mL75%乙醇處理30?s;棄75%乙醇,加入1?mL10%次氯酸鈉和0.01%?Triton?X-100溶液處理10?m;棄去洗液,用無菌蒸餾水洗滌5-6次;加無菌水,放置4度冰箱3d;棄去無菌蒸餾水,提供含無菌濾紙的無菌培養皿,及用無菌蒸餾水作為溶劑配置的100?mg/L含卡納霉素的溶液,用4?mL的含卡納霉素的溶液將培養皿內的無菌濾紙打濕,其中,每克無菌濾紙含14?mL卡納霉素溶液;

⑥用無菌1.0?mL槍頭將種子均勻播種于上述培養皿中的無菌紙表面上;

⑦將培養皿封口,暗培養2-3?d,待種子萌發。

6.??陽性植株的移栽

????待種子萌發至剛露出胚根(3毫米)后,光照培養2-4?d,培養條件為:溫度22?±?1℃、光照強度2000?Lux,光周期為16?h,直至轉基因擬南芥幼苗長出兩片綠色子葉且陰性對照出現黃化后,將葉片呈綠色的幼苗播于營養土中,蓋保鮮膜保濕,繼續光照培養,培養條件為:溫度22?±?1℃、光照強度2000?Lux,光周期為16?h。經過我們的實驗,發現當胚根的長度大于3.5毫米以上才進行光照培養,則后期的苗的成活率也很低,只有76%的成活率。相對于傳統培養基進行轉基因植物的篩選,后期成活率只有50-60%左右,而且每一代消費的時間為60-80天。

????表3:擬南轉基因種子培根不同長度下進行光照培養對轉基因植物后期成活率的影響

胚根長度 1毫米 2毫米 3毫米 3.5毫米 5毫米 7毫米 9毫米 后期苗的成活率 95% 94.5% 94% 76% 74% 65% 50%

實施4:在自然操作條件下,可以完成轉基因植株的鑒定

轉基因后代(T0代后的種子)的篩選與鑒定是一個工作量很大的工作,除了對材料消毒花費大量時間外,工作人員需要在超凈工作臺上工作,不僅占用設備,還需有一定無菌操作技術的的人員。與正常的操作相比,無菌操作效率低,工作強度大。與培養基相比,水幾乎不含有微生物生長所需的有機物,不易滋生微生物。

因此我們嘗試用未滅菌的蒸餾水替代滅菌的水來配置抗生素溶液,在自然實驗桌面代替無菌超凈工作臺。種子的消毒過程與實施1—3相同(該實施中的消毒步驟主要消除種子帶毒,預防后期煙草苗發病;同時,消毒有助于打破種子休眠)。實驗結果表明,轉基因植株篩選工作可以在自然操作狀態下完成,通過對15個批次的轉基因(煙草和擬南芥T0代種子)后代的篩選來看,到出現分離表型時,均未出現污染,后期苗的成活率為90%以上,所花費的時間為10-20天。在濾紙上一部分呈綠色,一部分子葉黃色,生長矮小,這表明這個工作體系可以很好的進行轉基因植株的鑒定。同時我們用該法對擬南芥也進行了鑒定,此法同樣也適應于對擬南芥轉基因植株進行鑒定。

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