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一種菜豆高效離體再生體系的建立方法.pdf

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一種 菜豆 高效 再生 體系 建立 方法
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摘要
申請專利號:

CN201611256138.3

申請日:

20161230

公開號:

CN106613989B

公開日:

20180511

當前法律狀態:

有效性:

有效

法律詳情:
IPC分類號: A01H4/00 主分類號: A01H4/00
申請人: 四川農業大學
發明人: 吳小麗,李煥秀,唐懿,譚華強,黃海濤,李曉梅,苗明軍,劉鄭琦,羅慧中,易蘭
地址: 611130 四川省成都市溫江區惠民路211號四川農業大學
優先權: CN201611256138A
專利代理機構: 成都帝鵬知識產權代理事務所(普通合伙) 代理人: 黎照西
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法律狀態
申請(專利)號:

CN201611256138.3

授權公告號:

法律狀態公告日:

法律狀態類型:

摘要

本發明提供了一種菜豆高效離體再生體系的建立方法,其包括如下步驟:(1)切取菜豆子葉節置于誘導培養基中培養,培養時間為5?9天;所述誘導培養基為添加了濃度為1.5?2.0mg/L?6BA的MS培養基;(2)切除主腋芽后,用與步驟(1)相同的培養基進行繼代培養,培養時間為18?23天;(3)將步驟(2)所得物置于伸長培養基中,培養時間為5?9天;所述伸長培養基為添加了濃度為0.3mg/L?KT的B5培養基;(4)將步驟(3)所得外植體芽置于添加了濃度為1.0mg/L?IBA的MSB5培養基,培養時間為12?16天。本發明對于“超級九粒白”菜豆具有較高的誘導率、伸長率和誘導根數,可實現高效再生體系的建立。

權利要求書

1.一種菜豆高效離體再生體系的建立方法,其特征在于,所述方法包括如下步驟:(1)切取菜豆子葉節置于誘導培養基中培養,培養時間為5-9天;所述誘導培養基為添加了濃度為1.5~2.0mg/L6BA的MS培養基;(2)切除主腋芽后,用與步驟(1)相同的培養基進行繼代培養,培養時間為18-23天;(3)將步驟(2)所得物置于伸長培養基中,培養時間為5-9天;所述伸長培養基為添加了濃度為0.3mg/LKT的B5培養基;(4)將步驟(3)所得外植體芽置于生根培養基中,培養時間為12-16天;所述生根培養基為添加了濃度為1.0mg/LIBA的MSB5培養基;所述菜豆的基因型為超級九粒白菜豆。2.根據權利要求1所述的方法,其特征在于,所述菜豆的獲取方法為:將滅菌后的種子置于MS培養基中培養,誘發形成無菌苗。3.根據權利要求1所述的方法,其特征在于,步驟(1)-步驟(4)所述培養條件為:22-28℃、65-75%濕度、1800-2200lx光照強度及14-18小時/天的光照周期。4.根據權利要求1或3所述的方法,其特征在于,步驟(1)-步驟(4)所述培養條件為:25℃、70%濕度、2000lx光照強度及16小時/天的光照周期。5.根據權利要求1所述的方法,其特征在于,步驟(1)中,6BA的濃度為2.0mg/L。6.根據權利要求1所述的方法,其特征在于,步驟(1)中的培養時間為7天。7.根據權利要求1所述的方法,其特征在于,步驟(2)中的培養時間為21天。8.根據權利要求1所述的方法,其特征在于,步驟(3)中的培養時間為7天。9.根據權利要求1所述的方法,其特征在于,步驟(4)中的培養時間為14天。

說明書

技術領域

本發明屬于作物培育領域,具體涉及一種菜豆高效離體再生體系的建立方法。

背景技術

菜豆(Phaseolus vulgaris Linn.),又稱蕓豆(俗稱二季豆或四季豆),豆科菜豆屬,一年生、纏繞或近直立草本。以食用嫩莢為主,是我國大量種植的豆科作物之一。蕓豆原產美洲的墨西哥和阿根廷,我國在16世紀末才開始引種栽培。其色澤嫩綠、肉莢肥厚、味道鮮美、營養豐富,蛋白質含量高,每100克菜豆含蛋白質3~6克,是一種重要的植物蛋白質來源。

傳統菜豆栽培種的產量很低,病蟲害嚴重,由于菜豆各種病害的生理小種變異豐富,使得育種工作十分艱難。長期以來,菜豆品種改良大多采用常規育種技術。由于菜豆常規育種存在生長周期長、選育難度大、表現性狀后代遺傳不穩定等問題。因此在菜豆遺傳育種過程中,采用各種生物技術手段進行種質創新,選育出高品質、高產量的抗逆抗病新品種已成為各方菜豆育種研究的焦點。自第一個轉基因植物問世以來,植物基因工程技術迅速發展,一些天然的抗蟲基因被成功的轉入一些作物中。因此,提高菜豆產量、增強抗病性和耐儲性最有效的途徑就是通過基因工程將抗性基因從其它材料中轉入菜豆栽培品種,對其進行遺傳改良。

建立高效的再生體系,對于菜豆的育種而言至關重要。不過,高效的再生體系的建立卻十分困難,原因之一在于不同基因型的菜豆所適用的再生體系差異較大,且沒有確切的規律可循。如研究“Regeneration in Phaseolus vulgaris L.:Promotive role of N6-benzylaminopurine in cultures from juvenile leaves”發現,對于kinghorn菜豆,利用其幼葉葉柄作為外植體,并以加入5μmol/L BAP的MSB5培養基的作為誘導培養基可以誘導愈傷組織;而對于Xan-159菜豆,利用MS+TDZ 0.1mg/L+0.05mg/L IAA和MS+TDZ 0.5mg/L+0.25mg/L IAA對子葉進行誘導才能獲得較好的誘導效果(“Plantregeneration from embryo-derived callus in Phaseolus vulgaris L.(common bean)and P.acutifolius A.Gray(tepary bean)”);而對于雙青35號菜豆,利用莖段為外植體,利用MS+6-BA 2.0mg/L+NAA 2.0mg/L進行誘導才獲得較好效果(《菜豆(雙青35號)再生體系的建立》);對于哈菜豆1號而言,0.75mg/L IBA和0.02mg/L BA的1/2MS培養基進行生根誘導,可獲得84.3%的效率;中國專利CN 104472352 A公布了一種適合于雙豐3號的再生體系,其體系也顯著的區別于其它基因型菜豆的再生體系。

從上述內容不難發現,對于不同基因型菜豆而言,適合的再生體系的獲得沒有特定的規律可循,其受基因型、外植體選擇和各個階段培養方式的選擇(包括培養基)等因素的影響。這使得菜豆的再生體系的建立面臨著不小困難。

發明內容

針對現有技術的缺點,本發明的目的在于提供一種適合于“超級九粒白”菜豆的高效離體再生體系的建立方法,該方法包括如下步驟:

(1)切取菜豆子葉節置于誘導培養基中培養,培養時間為5-9天;所述誘導培養基為添加了濃度為1.5~2.0mg/L 6BA的MS培養基;

(2)切除主腋芽后,用與步驟(1)相同的培養基進行繼代培養,培養時間為18-23天;

(3)將步驟(2)所得物置于伸長培養基中,培養時間為5-9天;所述伸長培養基為添加了濃度為0.3mg/L KT的B5培養基;

(4)將步驟(3)所得外植體芽置于生根培養基中,培養時間為12-16天;所述生根培養基為添加了濃度為1.0mg/L IBA的MSB5培養基。

如本發明的實施例和對比實施例所示,基因型、外植體、激素以及培養基的選擇對于菜豆的再生體系的建立而言,影響重大,且沒有十分明確的規律可循,這與此前的相關報道結論一致。經過大量的實驗,本發明找到了適于超級九粒白菜豆的高效離體再生體系,可為后續的科研和生產提供可靠的支撐。

所述菜豆的獲取方法為:將滅菌后的種子置于MS培養基中培養,誘發形成無菌苗。

步驟(1)-步驟(4)所述培養條件為:22-28℃、65-75%濕度、1800-2200lx光照強度及14-18小時/天的光照周期。

本領域技術人員應當理解,一般的培養溫度、濕度、光照情況和培養時間均適合本發明,本發明的主要貢獻在于找到了適合“超級九粒白”再生體系的激素種類、用量及培養基類型。

優選的,步驟(1)-步驟(4)所述培養條件為:25℃、70%濕度、2000lx光照強度及16小時/天的光照周期。

優選的,步驟(1)中,6BA的濃度為2.0mg/L。優選的,步驟(1)中的培養時間為7天。

優選的,步驟(2)中的培養時間為21天。優選的,步驟(3)中的培養時間為7天。

優選的,步驟(4)中的培養時間為14天。

本發明的有益效果:

本發明對于“超級九粒白”菜豆具有較高的誘導率、伸長率和誘導根數,可實現其高效再生體系的建立。

附圖說明

圖1為本發明所用的無菌苗;

圖2為本發明所用的子葉節;

圖3為本發明不定芽誘導結果圖;

圖4為本發明不定芽伸長結果圖;

圖5為本發明不定根誘導結果圖。

具體實施方式

下面通過實施例對本發明進行具體描述,有必要在此指出的是以下實施例只是用于對本發明進行進一步的說明,不能理解為對本發明保護范圍的限制,該領域的技術熟練人員根據上述發明內容所做出的一些非本質的改進和調整,仍屬于本發明的保護范圍。

實施例1

1.1實驗材料

選取飽滿新鮮的種子,用75%酒精中消毒1min,然后用無菌水沖洗3次后備用。用0.1%HgCl2滅菌5min,完成后用無菌水沖洗5次,取出置于無菌濾紙上吸干種子表面水分,接種于含MS培養基中,誘發形成無菌苗。切取菜豆子葉節部分,接種于誘導培養基中。

1.2實驗方法

把子葉節外植體分別接種芽誘導培養基,培養一周后切去主腋芽,再轉瓶到含有相同成分的培養基內繼代培養,共培養3周,每隔1周觀察外植體芽的誘導情況,并記錄各處理外植體的芽誘導率及芽的數量。繼而將誘導出的芽接種于芽的伸長培養基中,培養1周后,測定各外植體芽的長度;將伸長后的外植體芽接種于生根培養基中培養2周后,記錄芽根的誘導率、不定根數量與長度。

1.3培養條件

培養溫度25℃,相對濕度保持在70%左右,光照強度2000lx,光周期16h/d。

2.結果與分析

2.1不定芽誘導

將子葉節分別接種在MS、MSB5、B5+6-BA(0 0.3 0.5 0.7 1.0 1.3 1.5 1.7 2.0 2.3 2.5)和MS、MSB5、B5+6-BA/IBA(0/0.2 0.3/0.2 0.5/0.2 0.7/0.2 1.0/0.2 1.3/0.2 1.5/0.2 1.7/0.2 2.0/0.2 2.3/0.2 2.5/0.2)以及MS+TDZ(0 0.3 0.5 0.7 1.0 1.3 1.5)和MS+TDZ/IBA(0/0.2 0.3/0.2 0.5/0.2 0.7/0.2 1.0/0.2 1.3/0.2 1.5/0.2)兩類培養基上各60塊,進行誘導培養。結果發現:即使在不添加任何激素的培養基上也能誘導出不定芽,隨著激素濃度的升高不定芽誘導率隨之增加,MS和MSB5培養基6-BA濃度超過2.0mg/L、B5培養基超過0.7mg/L時誘導率降低;當TDZ濃度超過0.7mg/L時,褐化嚴重,且6-BA誘導不定芽效果好于TDZ;MS培養基最適激素濃度為MS+6BA1.5mg/L~2.0mg/L.不定芽誘導率為100%,平均芽數3.94;MSB5培養基最適激素濃度為MSB5+6-BA/IBA(1.5/0.2~2.0/0.2),誘導率為94%,平均芽數為3.66;B5培養基最適激素濃度為B5+6-BA(0.5~0.7mg/L),誘導率為59%,平均芽數為2.88.綜合三種培養基以及兩種激素配比,不定芽誘導最佳培養基為MS+6-BA1.5~2.0mg/L。

表1子葉節在不同培養基上最適濃度誘導情況

注:不定芽誘導率(%)=誘導出芽的外植體數/接種的外植體總數×100%;

不定芽平均誘導芽數(%)=誘導的不定芽總數/誘導出芽的外植體數×100%

2.2不定芽的伸長培養

將誘導出的不定芽轉入MS、MSB5、B5+KT(0 0.1 0.3 0.5 0.7 1.0 1.3 1.5)三類培養基各60塊,進行不定芽的伸長培養。結果表明:在不添加任何激素的培養基上不定芽均能伸長;隨著KT的增高誘導效果越好,但高濃度的KT(1.0mg/L)反而會抑制不定芽的伸長;三種培養基不定芽伸長最適激素濃度均為加0.3mg/LKT.其不定芽平均伸長分別為4.24、3.9、4.35cm;其中誘導效果最好的為B5+KT0.3mg/L。

表2不定芽在不同培養基上最適伸長濃度誘導情況

注:不定芽伸長率(%)=伸長的不定芽數/接種的不定芽總數×100%;

2.3生根誘導

將伸長后的不定芽轉入MS、MSB5、B5+KT(0 0.1 0.3 0.5 0.7 1.0 1.3 1.5)三類培養基各60塊,進行根的誘導。每個不定芽不定根的數量在1~8條之間不等,長度在1.76~7.43cm,且各處理不定根的誘導率均為100%,但當IBA為1.0mg/L時效果最佳;三種培養基添加IBA最佳激素濃度分別為1.0、1.0、0.7~1.0mg/L。綜合三種培養基最佳培養基和激素濃度為MSB5+IBA1.0mg/L。平均誘導根數為11.51,平均根長為7.43。

表3不定芽在不同培養基上最適伸長濃度誘導情況

注:平均根數=誘導出的總根數/總接種芽數。

對比實施例1

取超級九粒白、超寬賽冠王、美國加州王四季豆3個不同基因型菜豆5d齡幼苗子葉節為外植體,分別接種在MS+6-BA2.0mg/L培養基內,每個處理接種10瓶,每瓶6個外植體.每隔7d繼代培養一次,繼代培養2~3次后統計各基因型菜豆誘導情況,研究不同基因型菜豆不定芽誘導率的差異。從表4可明顯看出超級九粒白誘導率和平均芽數明顯高于超寬賽冠王和美國加州王四季豆,且超級九粒白長勢最為健壯。

表4不同基因型在最佳芽誘導培養基上誘導情況

對比實施例2

切取超級九粒白菜豆幼苗莖部、真葉以及子葉作為外植體置于MS+6-BA2.0mg/L培養基內,培養條件與實施例1以子葉節為外植體時一致,子葉和真葉切成0.5cm×0.5cm的方塊,莖段切成0.5cm×0.8cm的小段;真葉、子葉及莖段外植體在各種培養基上均不能誘導出不定芽,僅能誘導出愈傷組織。真葉外植體在培養1周后即可發現大多數褐化死亡,僅有少數外植體在邊緣有愈傷組織的死亡,愈傷組織為黃色,誘導的愈傷組織在繼代培養中極易褐化死亡;莖段外植體在培養2~4d后,其接觸培養基的基部開始膨大并開始愈傷組織的誘導,愈傷組織為綠色且結構疏松,但在進一步的繼代中不能形成不定芽,3周后逐漸褐化死亡;子葉外植體在培養3~5d后,子葉由黃白色轉為綠色,并在近軸端有少量的愈傷組織形成,3周后子葉褐化死亡。

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