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治療和診斷黑素瘤.pdf

摘要
申請專利號:

CN201380053478.4

申請日:

2013.08.13

公開號:

CN104780976A

公開日:

2015.07.15

當前法律狀態:

實審

有效性:

審中

法律詳情: 實質審查的生效IPC(主分類):A61P 35/04申請日:20130813|||公開
IPC分類號: A61P35/04; C12N15/113 主分類號: A61P35/04
申請人: 洛克菲勒大學
發明人: S·塔瓦佐伊; N·G·潘奇瓦
地址: 美國紐約
優先權: 61/682,339 2012.08.13 US; 61/784,057 2013.03.14 US
專利代理機構: 隆天知識產權代理有限公司72003 代理人: 吳小瑛; 王芝艷
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法律狀態
申請(專利)號:

CN201380053478.4

授權公告號:

|||

法律狀態公告日:

2015.08.12|||2015.07.15

法律狀態類型:

實質審查的生效|||公開

摘要

本發明公開了用于診斷和治療黑素瘤的新的制劑以及方法。還公開了相關的陣列、試劑盒和篩選方法。

權利要求書

1.  一種治療癌癥的方法,包括施予LXR激動劑給有此需要的受試者, 其中,所述LXR激動劑以足以提高ApoE的表達水平或活性水平至足以減緩 所述癌癥轉移的擴散的量施予。

2.
  一種治療癌癥的方法,包括施予足以治療所述癌癥的量的ApoE多肽 給有此需要的受試者。

3.
  一種減緩遷移性癌癥的擴散的方法,包括施予足以減緩所述遷移性癌 癥的擴散的量的LXR激動劑或ApoE多肽給有此需要的受試者。

4.
  根據權利要求1~3任一項所述的方法,其中,所述LXR激動劑為LXRβ 激動劑。

5.
  根據權利要求1~4任一項所述的方法,其中,所述LXR激動劑在體 外提高ApoE的表達水平至少2.5倍。

6.
  根據權利要求5所述的方法,其中,所述LXRβ激動劑對LXRβ的 選擇性超過對LXRα的選擇性。

7.
  根據權利要求6所述的方法,其中,所述LXRβ激動劑對LXRβ具 有活性,所述活性比所述激動劑對LXRα的活性高至少2.5倍。

8.
  根據權利要求6或7所述的方法,其中,所述LXRβ激動劑對LXRβ 具有活性,所述活性比所述激動劑對LXRα的活性高至少10倍。

9.
  根據權利要求6~8任一項所述的方法,其中,所述LXRβ激動劑對 LXRβ具有活性,所述活性比所述激動劑對LXRα的活性高至少100倍。

10.
  根據權利要求1~5任一項所述的方法,其中,所述LXR激動劑對 LXRβ具有活性,所述活性比所述激動劑對LXRα的活性高至少2.5倍。

11.
  根據權利要求4~10任一項所述的方法,其中,所述遷移性癌癥為 轉移癌。

12.
  根據權利要求11所述的方法,其中,所述轉移癌包括呈現遷移細胞 的遷移的細胞和/或侵襲的細胞。

13.
  根據權利要求11或12所述的方法,其中,所述轉移癌包括呈現內 皮募集和/或血管生成的細胞。

14.
  根據權利要求4~11任一項所述的方法,其中,所述遷移性癌癥通 過腹膜的、胸膜的、心包的表面或蜘蛛膜下腔的種植而擴散。

15.
  根據權利要求4~11任一項所述的方法,其中,所述遷移性癌癥通 過淋巴系統擴散。

16.
  根據權利要求4~11任一項所述的方法,其中,所述遷移性癌癥通 過血液擴散。

17.
  根據權利要求4~11任一項所述的方法,其中,所述遷移性癌癥為 細胞遷移癌。

18.
  根據權利要求17所述的方法,其中,所述細胞遷移癌為非轉移性細 胞遷移癌。

19.
  根據權利要求18所述的方法,其中,所述遷移性癌癥為卵巢癌、間 皮瘤或原發性肺癌。

20.
  一種抑制癌干細胞或癌癥起始細胞的增殖或生長的方法,包括使所 述細胞接觸足以抑制所述細胞的增殖或生長的量的LXR激動劑或ApoE多 肽。

21.
  一種降低癌癥的腫瘤種植速度的方法,包括施予足以降低腫瘤種植 的量的LXR激動劑或ApoE多肽給有此需要的受試者。

22.
  一種減小或治療癌癥的轉移性結節形成的方法,包括施予足以治療 癌癥的所述轉移性結節形成的量的LXR激動劑或ApoE多肽給有此需要的受 試者。

23.
  根據權利要求1~22任一項所述的方法,其中,所述癌癥選自乳腺 癌、結腸癌、腎細胞癌、非小細胞肺癌、肝細胞癌、胃癌、卵巢癌、胰腺癌、 食管癌、前列腺癌、肉瘤和黑素瘤。

24.
  根據權利要求23所述的方法,其中,所述癌癥為黑素瘤。

25.
  根據權利要求23所述的方法,其中,所述癌癥為乳腺癌。

26.
  根據權利要求23所述的方法,其中,所述癌癥為腎細胞癌。

27.
  根據權利要求23所述的方法,其中,所述癌癥為胰腺癌。

28.
  根據權利要求23所述的方法,其中,所述癌癥為非小細胞肺癌。

29.
  根據權利要求23所述的方法,其中,所述癌癥為結腸癌。

30.
  根據權利要求23所述的方法,其中,所述癌癥為卵巢癌。

31.
  根據權利要求1~30任一項所述的方法,其中,所述癌癥為耐藥的 癌癥。

32.
  根據權利要求1~31任一項所述的方法,其中,所述癌癥耐藥于威 羅菲尼、達卡巴嗪、CTLA4抑制劑、BRAF抑制劑、MEK抑制劑、PD1抑 制劑或PDL1抑制劑。

33.
  根據權利要求1~32任一項所述的方法,其中,所述方法包括施予 選自以下的LXR激動劑:具有化學式I-IV的任一個或化合物編號1~39的 任一個的化合物或其藥學上可接受的鹽。

34.
  根據權利要求33所述的方法,其中,所述LXR激動劑為化合物1 或其藥學上可接受的鹽。

35.
  根據權利要求33所述的方法,其中,所述LXR激動劑為化合物2 或其藥學上可接受的鹽。

36.
  根據權利要求33所述的方法,其中,所述LXR激動劑為化合物3 或其藥學上可接受的鹽。

37.
  根據權利要求33所述的方法,其中,所述LXR激動劑為化合物12 或其藥學上可接受的鹽。

38.
  根據權利要求33所述的方法,其中,所述LXR激動劑為化合物25 或其藥學上可接受的鹽。

39.
  根據權利要求33所述的方法,其中,所述LXR激動劑為化合物38 或其藥學上可接受的鹽。

40.
  根據權利要求33所述的方法,其中,所述LXR激動劑為化合物39 或其藥學上可接受的鹽。

41.
  根據權利要求1~32任一項所述的方法,其中,所述方法包括施予 ApoE多肽。

42.
  根據權利要求41所述的方法,其中,所述ApoE多肽提高了LRP1 或LRP8的活性水平或表達水平。

43.
  根據權利要求41或42所述的方法,其中,所述ApoE多肽結合到 LRP1、LRP8、ApoE2受體、LDL受體或VLDL受體。

44.
  根據權利要求41~43任一項所述的方法,其中,述ApoE多肽為ApoE 的受體結合區域(RBR)。

45.
  根據權利要求33~40任一項所述的方法,進一步包括施予抗增殖劑, 其中,所述LXR激動劑和所述抗增殖劑以共同足以減緩轉移性癌癥的進展的 量施予。

46.
  根據權利要求45所述的方法,其中,所述LXR激動劑和所述抗增 殖劑以共同有效地治療所述受試者的量分別在28天內施予。

47.
  根據權利要求41~44任一項所述的方法,進一步包括施予抗增殖劑, 其中,所述ApoE多肽和所述抗增殖劑以共同足以減緩遷移性癌癥的進展的 量施予。

48.
  根據權利要求47所述的方法,其中,所述ApoE多肽和所述抗增殖 劑以共同有效治療所述受試者的量彼此在28天內施予。

49.
  一種治療有此需要的受試者中的黑素瘤的方法,包括(a)提高所述 受試者中選自DNAJA4、ApoE、LRP1、LRP8、肝X受體(LXR)和miR-7 的轉移抑制因子的表達水平或活性水平,或(b)降低所述受試者中選自 miR-199a-3p、miR-199a-5p、miR-1908和CTGF中的轉移促進因子的表達水 平或活性水平。

50.
  根據權利要求49所述的方法,其中,所述黑素瘤為轉移性的。

51.
  根據權利要求49或50所述的方法,其中,通過向所述受試者施予 下述一種或多種而進行所述提高的步驟:
(i)具有DNAJA4、ApoE、LRP1、LRP8或LXR的序列的多肽;
(ii)具有編碼DNAJA4、ApoE、LRP1、LRP8或LXR的序列的核酸;
(iii)LRP1、LRP8或LXR的配體;和
(iv)編碼miR-7的RNAi制劑。

52.
  根據權利要求49或50所述的方法,其中,通過降低選自miR-199a-3p、 miR-199a-5p和miR-1908中的microRNA的表達水平或活性水平而進行所述 提高的步驟。

53.
  根據權利要求52所述的方法,其中,通過miR-Zip技術進行降低的 步驟。

54.
  根據權利要求52所述的方法,其中,通過鎖核酸(LNA)技術進 行降低的步驟。

55.
  根據權利要求52所述的方法,其中,通過拮抗mir進行降低的步驟。

56.
  根據權利要求52所述的方法,其中,LRP1的配體或LRP8的配體 是小分子或抗體。

57.
  根據權利要求50所述的方法,其中,通過提高LXR的活性水平或 表達水平而進行提高ApoE或DNAJA表達水平的步驟。

58.
  根據權利要求57所述的方法,其中,通過施予LXR激動劑給所述 受試者而進行提高LXR活性水平的步驟。

59.
  根據權利要求58所述的方法,其中,所述LXR激動劑為具有化學 式I-IV的任一個的化合物。

60.
  一種測定受試者是否具有轉移性黑素瘤或者處于具有轉移性黑素瘤 的風險的方法,包括
從所述受試者獲得樣本;
測量樣本中(i)選自miR-199a-3p、miR-199a-5p、miR-1908和CTGF 中的轉移促進因子的第一表達水平,或(ii)選自DNAJA4、ApoE、LRP1、 LRP8、肝X受體(LXR)和miR-7中的轉移抑制因子的第二表達水平;以 及
比較所述第一表達水平與第一預定的參考值,或者比較所述第二表達水 平與第二預定的參考值;借此,如果(a)所述第一表達水平大于第一預定的 參考值至或者(b)所述第二表達水平小于第二預定的參考值,則確定所述受 試者具有轉移性黑素瘤或者處于具有轉移性黑素瘤的風險。

61.
  根據權利要求60所述的方法,其中,從不具有轉移性黑素瘤的對照 受試者獲得所述第一預定的參考值和第二預定的參考值。

62.
  根據權利要求60所述的方法,其中,所述樣本為體液樣本。

63.
  根據權利要求60所述的方法,其中,所述樣本為腫瘤樣本。

64.
  根據權利要求60所述的方法,其中,所述樣本為痣樣本。

65.
  根據權利要求60所述的方法,其中,所述樣本為人皮膚樣本。

66.
  根據權利要求60所述的方法,其中,所述測量步驟包括測量所述第 一表達水平和所述第二表達水平二者。

67.
  根據權利要求66所述的方法,其中,所述樣本為體液樣本。

68.
  根據權利要求66所述的方法,其中,所述樣本為腫瘤樣本、痣樣本 或人皮膚樣本。

69.
  一種陣列,包括
具有多個獨特位置的支持物,和
下述的任何組合
(i)至少一條核酸,其具有與編碼選自miR-199a-3p、miR-199a-5p、 miR-1908和CTGF或其互補物中的轉移促進因子的核酸互補的序列,或
(ii)至少一條核酸,其具有與編碼選自DNAJA4、ApoE、LRP1、LRP8、 肝X受體(LXR)和miR-7或其互補組成物中的轉移抑制因子的核酸互補的 序列,
其中,固定每條核酸到支持物的獨特位置。

70.
  一種診斷受試者中黑素瘤的轉移可能性的試劑盒,包括
第一試劑,其特異地結合到選自DNAJA4、ApoE、LRP1、LRP8、肝X 受體(LXR)和miR-7中的轉移抑制基因的表達產物;或
第二試劑,其特異地結合到選自miR-199a-3p、miR-199a-5p、miR-1908 和CTGF中的轉移促進基因的表達產物。

71.
  根據權利要求70所述的試劑盒,其中,所述第二試劑是具有與所述 抑制基因或促進基因或其互補物互補的序列的探針。

72.
  根據權利要求70所述的試劑盒,進一步包括用于進行免疫測定、雜 交測定或PCR測定的試劑。

73.
  根據權利要求70所述的試劑盒,其中,所述試劑盒包括權利要求 69所述的陣列。

74.
  一種鑒別用于治療黑素瘤或抑制內皮募集、細胞侵襲或轉移性血管 生成的化合物的方法,包括
(i)獲得表達報告基因的測試細胞,所述報告基因由有效地連接到選自 miR-199a-3p、miR-199a-5p、miR-1908和CTGF中的標記基因的啟動子的核 酸編碼;
(ii)將所述測試細胞暴露于測試化合物;
(iii)測量所述測試細胞中所述報告基因的表達水平;
(iv)將所述表達水平與對照水平比較;和
(v)如果所述比較表明所述表達水平低于所述對照水平,則選擇所述測 試化合物為用于治療黑素瘤或用于抑制內皮募集、癌細胞侵襲或轉移性血管 生成的候選物。

75.
  一種鑒別用于治療黑素瘤或抑制內皮募集、細胞侵襲或轉移性血管 生成的化合物的方法,包括
(i)獲得表達報告基因的測試細胞,所述報告基因由有效地連接到選自 DNAJA4、ApoE、LRP1、LRP8、肝X受體(LXR)和miR-7中的標記基因 的啟動子的核酸編碼;
(ii)將所述測試細胞暴露于測試化合物;
(iii)測量所述測試細胞中所述報告基因的表達水平;
(iv)將所述表達水平與對照水平比較;和
(v)如果所述比較表明所述表達水平高于所述對照水平,則選擇所述測 試化合物為用于治療黑素瘤或用于抑制內皮募集、癌細胞侵襲或轉移性血管 生成的候選物。

76.
  根據權利要求74或75所述的方法,其中,從與所述測試細胞相同 的對照細胞獲得所述對照水平,但所述對照細胞不暴露于所述測試化合物。

77.
  根據權利要求74或75所述的方法,其中,所述報告基因與所述標 記基因相同。

78.
  一種抑制有此需要的受試者中內皮募集的方法,包括施予抑制CTGF 的表達或活性的藥劑給所述受試者。

79.
  根據權利要求78所述的方法,其中,所述受試者具有特征為病理性 血管生成的病癥。

80.
  根據權利要求79所述的方法,其中,所述病癥為癌癥、眼病或炎癥 疾病。

81.
  根據權利要求80所述的方法,其中,所述癌癥為轉移性黑素瘤。

82.
  一種抑制有此需要的受試者中腫瘤細胞侵襲的方法,包括施予抑制 CTGF表達或活性的藥劑給所述受試者。

83.
  根據權利要求82所述的方法,其中,所述腫瘤細胞為轉移性黑素瘤 細胞。

84.
  一種治療有此需要的受試者中轉移癌的方法,包括施予抑制CTGF 的表達或活性的藥劑給所述受試者,其中,所述癌癥為黑素瘤。

85.
  根據權利要求78~84任一項所述的方法,其中,所述藥劑為抗體、 核酸、多肽或小分子化合物。

86.
  根據權利要求85所述的方法,其中,所述抗體為單克隆抗體。

87.
  一種治療有此需要的受試者中轉移癌的方法,包括施予提高miR-7 的表達或活性的藥劑給所述受試者。

88.
  根據權利要求87所述的方法,其中,所述癌為轉移性黑素瘤。

89.
  根據權利要求87或88所述的方法,其中,所述藥劑為抗體、核酸、 多肽或小分子化合物。

90.
  根據權利要求87~89任一項所述的方法,其中,所述藥劑具有miR-7 活性。

91.
  根據權利要求89所述的方法,其中,所述核酸為寡核苷酸。

92.
  根據權利要求91所述的方法,其中,所述寡核苷酸包括選自Seq.ID No.36~38中的序列。

說明書

治療和診斷黑素瘤
相關申請的交叉引用
本申請要求2012年8月13日提交的美國臨時申請第61/682,339號和 2013年3月14日提交的美國臨時申請第61/784,057號的優先權。所述申請 的內容通過引用以其整體合并于本文。
技術領域
本發明涉及診斷和治療遷移的癌癥(migrating cancers)和黑素瘤。
背景技術
黑素瘤是惡性腫瘤,由下表皮細胞中異常的黑色素細胞發展而來,并可 通過血液和淋巴系統轉移到體內遠的位點。雖然僅占小于5%的皮膚癌病例, 但是黑素瘤更加危險,并導致與皮膚癌相關的大多數死亡。全世界的黑素瘤 的發病率以驚人的速度提高,美國男性終生黑素瘤發展的風險高達1/58 (Jemal et al.,2008,CA:Cancer J.Clin.58:71-96)。全世界的惡性黑素瘤的死 亡率也持續顯著地提高。根據2006WHO報道,每年全世界出現大約48,000 例與黑素瘤相關的死亡(Lucas et al.(2006)Environmental Burden of Disease  Series.13.World Health Organization.ISBN 92-4-159440-3)。在美國,估計在 2010年幾乎70,000個人被診斷為黑素瘤,并且預期大約9,000人死于該疾病 (美國癌癥協會;www.cancer.org)。
雖然一些常規癌癥治療方法已經用于治療轉移性的(metastatic)黑素瘤, 但是它們無效。因此,轉移性黑素瘤仍然是最難于治療的癌癥之一,并且是 最令人畏懼的腫瘤之一。因此,需要用于黑素瘤的診斷和治療的新制劑和方 法。
發明內容
本發明通過提供診斷和治療黑素瘤的制劑和方法而滿足了上述需要。本 發明至少部分地基于轉移性黑素瘤中去調控的協同的miRNA-蛋白質網絡的 意外發現。該網絡包括若干轉移抑制因子和轉移促進因子。
在一個方面,本發明的特征為治療癌癥的方法,包括施予有此需要的受 試者LXR激動劑,其中,所述LXR激動劑以足以提高ApoE的表達水平或 活性水平至足以減緩所述癌癥轉移的擴散的量施予。
另一方面,本發明的特征為治療癌癥的方法,包括施予足以治療所述癌 癥的量的ApoE多肽給有此需要的受試者。
另一方面,本發明的特征為減緩遷移的癌癥的擴散的方法,包括施予 LXR激動劑或ApoE多肽給有此需要的受試者。
在任何上述方法的一些實施方式中,LXR激動劑為LXRβ激動劑。在 某些實施方式中,LXR激動劑提高了ApoE的體外表達水平至少2.5倍。在 某些實施方式中,LXRβ激動劑對于LXRβ的選擇性超過LXRα。在其 它實施方式中,LXRβ激動劑對LXRβ具有活性,所述活性比所述激動劑 對LXRα的活性大至少2.5倍。在一些實施方式中,LXRβ激動劑對LXRβ 具有活性,所述活性比所述激動劑對LXRα的活性大至少10倍。在進一步 的實施方式中,LXRβ激動劑對LXRβ具有活性,所述活性比所述激動劑 對LXRα的活性大至少100倍。在某些實施方式中,LXR激動劑對LXRβ 具有活性,所述活性比激動劑對LXRα的活性大至少2.5倍。
在一些實施方式中,遷移的癌癥為轉移的癌。所述轉移的癌可包括呈現 遷移細胞的遷移和/或侵入的細胞和/或包括呈現內皮募集和/或血管生成的細 胞。在其它實施方式中,所述遷移的癌癥為細胞遷移癌。在另一些其它實施 方式中,所述細胞遷移癌為非轉移的細胞遷移癌。
所述遷移的癌癥可為通過腹膜的、胸膜的、心包的表面或蜘蛛膜下腔的 種植(seeding)而擴散的癌癥。備選地,所述遷移的癌癥可為通過淋巴系統 擴散的癌癥或通過血液擴散的癌癥。
在具體的實施方式中,所述遷移的癌癥為非轉移性細胞遷移癌的細胞遷 移癌,例如卵巢癌、間皮瘤或原發性肺癌。
在相關方面,本發明提供了抑制或減少癌的轉移的方法,包括施予LXR 激動劑或ApoE多肽。
在另一方面,本發明提供了抑制癌干細胞或癌癥起始細胞(cancer  initiating cell)增殖或生長的方法,包括使所述細胞接觸足以抑制所述細胞的 增殖或生長的量的LXR激動劑或ApoE多肽。
在另一方面,本發明提供了降低癌癥的腫瘤種植(tumor seeding)的速 度的方法,包括施予足以降低腫瘤種植的量的LXR激動劑或ApoE多肽給有 此需要的受試者。
在再一方面,本發明提供了減少或治療癌的轉移性結節形成的方法,包 括施予足以治療所述癌的轉移性結節形成的量的LXR激動劑或ApoE多肽給 有此需要的受試者。
在其它實施方式中,所述癌癥為乳腺癌、結腸癌、腎細胞癌、非小細胞 肺癌、肝細胞癌、胃癌、卵巢癌、胰腺癌、食管癌、前列腺癌、肉瘤或黑素 瘤。在一些實施方式中,所述癌癥為黑素瘤。在其它實施方式中,所述癌癥 為乳腺癌。在某些實施方式中,所述癌癥為腎細胞癌。在另外的實施方式中, 所述癌癥為胰腺癌。在其它實施方式中,所述癌癥為非小細胞肺癌。在一些 實施方式中,所述癌癥為結腸癌。在另外的實施方式中,所述癌癥為卵巢癌。
在其它實施方式中,所述癌癥為耐藥的癌癥。在另外的實施方式中,所 述癌癥抗威羅菲尼、達卡巴嗪、CTLA4抑制劑、PD1抑制劑或PDL1抑制 劑。
在一些實施方式中,所述方法包括施予選自由具有化學式I-IV的任一 個或化合物編號1~39的任一個的化合物或其藥學上可接受的鹽組成的列表 的LXR激動劑。在一些實施方式中,所述LXR激動劑為化合物1或其藥學 上可接受的鹽。在其它實施方式中,所述LXR激動劑為化合物2或其藥學 上可接受的鹽。在某些實施方式中,所述LXR激動劑為化合物3或其藥學 上可接受的鹽。在另外的實施方式中,所述LXR激動劑為化合物12或其藥 學上可接受的鹽。在一些實施方式中,所述LXR激動劑為化合物25或其藥 學上可接受的鹽。在其它實施方式中,所述LXR激動劑為化合物38或其藥 學上可接受的鹽。在另外的實施方式中,所述LXR激動劑為化合物39或其 藥學上可接受的鹽。
所述方法可進一步包括施予抗增殖劑,其中,所述LXR激動劑和所述 抗增殖劑以共同足以減緩遷移的癌癥的進展的量施予。例如,所述LXR激 動劑和所述抗增殖劑以共同有效地治療所述受試者的量在28天內的每一天 (例如21、14、10、7、5、4、3、2或1天內)或在24個小時(例如12、6、 3、2或1小時;或伴隨地)內施予。
在一些實施方式中,所述方法包括施予ApoE多肽。所述ApoE多肽片 段提高了LRP1或LRP8的活性水平或表達水平,并且/或者所述ApoE多肽 可結合LRP1或LRP8,并且所述ApoE多肽可為ApoE的受體結合區域 (RBR)。所述方法可進一步包括施予抗增殖劑,其中,所述ApoE多肽和所 述抗增殖劑以共同足以減緩遷移的癌癥的進展的量施予。例如,所述抗增殖 劑和ApoE多肽以共同有效地治療所述受試者的量在28天內的每一天(例如 21、14、10、7、5、4、3、2或1天)或24個小時(例如12、6、3、2或1 小時;或伴隨地)內施予。
在一些實施方式中,所述藥物組合物可進一步地包括其它的具有抗增殖 活性的化合物。所述另外的具有抗增殖活性的化合物可選自化合物的組中, 例如化學治療劑和細胞毒性劑,誘導分化的制劑(例如視黃酸(retinoic acid)、 維生素D、細胞因子)、激素制劑、免疫制劑和抗血管生成劑。化學治療 劑和細胞毒性劑包括但不限于烷化劑、細胞毒性抗生素、抗代謝物、長春花 生物堿、依托泊苷,和其它(例如,紫杉醇、泰素、多西他賽、多西紫杉醇、 順鉑)。可在L.Brunton,B.Chabner and B.Knollman(eds).Goodman and  Gilman’s The Pharmacological Basis of Therapeutics,Twelfth Edition,2011, McGraw Hill Companies,New York,NY中發現一系列的具有抗增殖活性的 其它的化合物。
所述方法可進一步包括施予抗增殖劑化合物,所述抗增殖劑化合物選自 由烷化劑、鉑劑(platinum agent)、抗代謝物、拓撲異構酶抑制劑、抗腫瘤 抗生素、抗有絲分裂劑、芳香酶抑制劑、胸苷酸合成酶抑制劑、DNA拮抗 劑、法呢酰基轉移酶抑制劑、泵(pump)抑制劑、組蛋白乙酰轉移酶抑制 劑、金屬蛋白酶抑制劑、核糖核苷酸還原酶抑制劑、TNFα激動劑/拮抗劑、 內皮素A受體拮抗劑、視黃酸受體激動劑、免疫調制子、激素與抗激素劑、 光動力劑(photodynamic agent)、酪氨酸激酶抑制劑、反義化合物、皮質 類固醇酶、HSP90抑制劑、蛋白酶體抑制劑(例如NPI-0052)、CD40抑制 劑、抗CSI抗體、FGFR3抑制劑、VEGF抑制劑、MEK抑制劑、細胞周期 蛋白D1抑制劑、NF-kB抑制劑、蒽環類、組蛋白脫乙酰酶、驅動蛋白抑制 劑、磷酸酶抑制劑、COX2抑制劑、mTOR抑制劑、鈣神經素拮抗劑、IMiD 或用于治療增生性疾病的其它制劑組成的組。表1中提供了這樣的化合物的 實例。
另一方面,本發明的特征為治療有此需要的受試者中的黑素瘤(例如轉 移性黑素瘤)的方法。所述方法包括(a)提高所述受試者中選自由DNAJA4、 載脂蛋白E(ApoE)、LRP1、LRP8、肝X受體(LXR,例如LXR-α和LXR-β 兩者)和miR-7組成的組中的轉移抑制因子的表達水平或活性水平,或(b) 降低所述受試者中選自由miR-199a-3p、miR-199a-5p、miR-1908和CTGF組 成的組中的轉移促進因子的表達水平或活性水平。
在所述方法中,可通過施予所述受試者下述一種或多種而進行所述提高 的步驟:(i)具有DNAJA4、ApoE或ApoE片段、LRP1、LRP8或LXR的 序列的多肽;(ii)具有編碼DNAJA4、ApoE、LRP1、LRP8或LXR的序列 的核酸;(iii)LRP1、LRP8或LXR的配體;和(iv)編碼miR-7的RNAi 制劑。LRP1或LRP8配體的實例包括ApoE、抗LRP1或抗LRP8抗體的受 體結合部分或小分子配體。在一個實例中,可通過提高LXR的活性水平或 表達水平而進行所述ApoE表達水平的提高。還可通過提高LXR的活性水 平或表達水平而提高所述DNAJA4的表達水平。可通過施予LXR配體(例 如,如下面所述的化學式I-IV的化合物)給受試者而提高LXR活性水平。 還可通過降低選自由miR-199a-3p、miR-199a-5p和miR-1908組成的組中的 microRNA的表達水平或活性水平而進行所述提高步驟。為此,可使用本領 域中已知的數種技術,包括但不限于miR-Zip技術、鎖核酸(LNA)以及如 下面的實施例中描述的拮抗mir(antagomir)技術。
在另一方面,本發明提供了測定受試者是否患有轉移性黑素瘤或者處于 患有轉移性黑素瘤的危險的方法。所述方法包括從所述受試者獲得樣本;測 量所述樣本中(i)選自由miR-199a-3p、miR-199a-5p、miR-1908和CTGF 組成的轉移促進因子的第一表達水平,或(ii)選自由DNAJA4、ApoE、LRP1、 LRP8、LXR和miR-7組成的組中的轉移抑制因子的第二表達水平;以及比 較所述第一表達水平與第一預定的參考值,或者比較所述第二表達水平與第 二預定的參考值。如果(a)所述第一表達水平大于第一預定參考至或者(b) 所述第二表達水平小于第二預定參考值,則確定所述受試者患有轉移性黑素 瘤或者處于患有轉移性黑素瘤的風險。可從不患有轉移性黑素瘤的對照受試 者獲得所述第一預定參考值和第二預定參考值。在一個實施方式中,所述測 量步驟包括測量所述第一表達水平和所述第二表達水平兩者。所述樣本可為 體液樣本、腫瘤樣本、痣樣本或人皮膚樣本。
在另一方面,本發明提供了具有支持物的陣列,所述支撐物具有多個獨 特的位置,和下述的任何組合(i)至少一條核酸,其具有與編碼選自由 miR-199a-3p、miR-199a-5p、miR-1908和CTGF或其互補序列組成的組中的 轉移促進因子的核酸互補的序列,或(ii)至少一條核酸,其具有與編碼選 自由DNAJA4、ApoE、LRP1、LRP8、LXR和miR-7或其互補序列組成的組 中的轉移抑制因子的核酸互補的序列。優選地,固定每條核酸到支持物的獨 特的位置。該陣列可用于轉移性黑素瘤診斷以及預后。
因此,本發明還提供了用于診斷受試者中黑素瘤的轉移潛能的試劑盒。 所述試劑盒包括第一試劑,其特異地結合選自由DNAJA4、ApoE、LRP1、 LRP8、LXR和miR-7組成的組中的轉移抑制基因的表達產物;或第二試劑, 其特異地結合選自由miR-199a-3p、miR-199a-5p、miR-1908和CTGF組成的 組中的轉移促進基因的表達產物。所述第二制劑可為具有與所述抑制基因或 促進基因或其互補序列互補的序列的探針。所述試劑盒可進一步包括用于進 行免疫測定、雜交測定或PCR測定的試劑。在一個實施方式中,所述試劑盒 包括上述的陣列。
在另一方面,本發明提供了鑒別用于治療黑素瘤或抑制內皮募集、細胞 侵襲(cell invasion)或轉移性血管生成的化合物的方法。所述方法包括(i) 獲得表達報告基因的檢測細胞,所述報告基因由有效地連接到選自由 miR-199a-3p、miR-199a-5p、miR-1908和CTGF組成的組中的標記基因的啟 動子的核酸編碼;(ii)暴露所述檢測細胞于檢測的化合物;(iii)測量所述檢 測細胞中所述報告基因的表達水平;(iv)比較所述表達水平與對照水平;和 (v)如果所述比較表明所述表達水平低于所述對照水平,則選擇所述檢測的 化合物作為用于治療黑素瘤或用于抑制內皮募集、癌細胞的侵襲或轉移性血 管生成的候選物。
本發明提供了鑒別用于治療黑素瘤或抑制內皮募集、細胞侵襲或轉移性 血管生成的化合物的另一種方法。所述方法包括(i)獲得表達報告基因的檢 測細胞,所述報告基因由有效地連接到選自由DNAJA4、ApoE、LRP1、LRP8、 LXR和miR-7組成的組中的標記基因的啟動子的核酸編碼;(ii)暴露所述檢 測細胞于檢測的化合物;(iii)測量所述檢測細胞中所述報告基因的表達水平; (iv)比較所述表達水平與對照水平;和(v)如果所述比較表明所述表達水 平高于所述對照水平,則選擇所述檢測的化合物作為用于治療黑素瘤或用于 抑制內皮募集、癌細胞的侵襲或轉移性血管生成的候選物。
在上述鑒別方法中,所述報告基因可為本領域中已知的標準的報告基因 (例如LaxZ、GFP或熒光素酶基因等)或上述轉移抑制基因或轉移促進基 因的一種。在所述方法中,除了所述對照細胞不暴露于所述檢測的化合物外, 從與所述檢測細胞相同的對照細胞獲得所述對照水平。
在另一方面,本發明提供了通過施予抑制CTGF的表達或活性的制劑給 所述受試者而在有此需要的受試者中抑制內皮募集、抑制腫瘤細胞侵襲、或 治療轉移癌的方法。所述受試者可為具有以病理性血管生成為特征的病癥的 受試者,包括但不限于癌癥(例如轉移性黑素瘤)、眼病和炎癥疾病。所述 腫瘤細胞的實例為轉移性黑素瘤細胞。制劑的實例包括抗體、核酸、多肽或 小分子化合物。在優選的實施方式中,所述抗體為單克隆抗體。
在另一方面,本發明提供了通過施予提高miR-7的表達或活性的制劑給 所述受試者,而在有此需要的受試者中抑制內皮募集、抑制腫瘤細胞侵襲或 治療轉移癌的方法。所述腫瘤細胞的實例為轉移性黑素瘤細胞。制劑的實例 包括抗體、核酸、多肽或小分子化合物。在一個實例中,所述制劑具有miR-7 活性。所述核酸可為寡核苷酸。并且,所述寡核苷酸可包括選自由Seq.ID No. 36~38組成的組中的序列。
如文中使用,“遷移的癌癥”是指其中形成腫瘤的癌細胞遷移然后在原 發腫瘤位點外的其它位點生長為惡性植入物的癌癥。癌細胞的遷移如下:通 過腹膜的、胸膜的、心包的表面或蜘蛛膜下腔的種植而
擴散到體腔;通過淋巴細胞的侵入而侵入淋巴系統,并運輸到局部和遠 的淋巴結,然后運輸到身體的其它部分;通過血液細胞的侵入的血源性擴散; 或通過侵入周圍組織。遷移的癌癥包括轉移腫瘤和細胞遷移癌,例如卵巢癌、 間皮瘤和原發性肺癌,其每一種均以細胞遷移為特征。
如文中使用,“減緩遷移的癌癥的擴散”是指降低或阻止新的位點的形 成;或降低、阻止或反轉腫瘤負荷。
如文中使用,“轉移腫瘤”是指腫瘤或癌,其中形成腫瘤的癌細胞具有 通過淋巴系統或血源性擴散而從受試者內的一個位置轉移或擴散到另一個 位置或多個位置的高的潛能或已經通過淋巴系統或血源性擴散而從受試者 內的一個位置轉移或擴散到另一個位置或多個位置,例如在受試者內產生繼 發性腫瘤。這樣的轉移行為可以是惡性腫瘤的指示。在一些情況下,轉移行 為可與腫瘤細胞的細胞遷移和/或侵入行為的增加相關。
如文中使用,“減緩轉移的擴散”是指降低或阻止新的位點的形成;或 降低、阻止或反轉腫瘤負荷。
術語“癌癥”是指由惡性贅生性細胞的增殖引起的任何癌癥,例如腫瘤、 贅生物、癌、肉瘤、白血病(leukimias)、淋巴瘤等。
如文中使用,“耐藥癌癥”是指耐表2中的抗增殖劑的任何癌癥。
可以定義為轉移性癌癥的實例包含但不限于非小細胞肺癌、乳腺癌、卵 巢癌、結腸直腸癌、膽管癌、膀胱癌、腦癌(包括膠質母細胞瘤和髓母細胞 瘤)、宮頸癌、絨毛膜癌、子宮內膜癌、食道癌、胃癌、血液腫瘤、多發性 骨髓瘤、白血病、上皮內瘤樣病變、肝癌、淋巴瘤、成神經細胞瘤、口腔癌、 胰腺癌、前列腺癌、肉瘤、包括黑素瘤的皮膚癌、基底細胞癌(basocellular  cancer)、鱗狀細胞癌、睪丸癌、間質瘤、生殖細胞腫瘤、甲狀腺癌和腎癌。
本申請中使用的“增殖”涉及相似形式(細胞)由于構成的(細胞的) 成分的復制或增加。
本申請中使用的“細胞遷移”涉及癌細胞侵襲周圍組織,并且穿過血管 壁以將癌細胞從末端器官的脈管系統脫離出去。
“細胞遷移癌”意思是通過癌細胞侵襲周圍組織,并且穿過血管壁以將 癌細胞從末端器官中的脈管系統脫離出去而遷移的癌。
如文中使用,“非轉移性細胞遷移癌”是指不通過淋巴系統或血源性擴 散而遷移的癌。
如文中使用,“細胞與細胞粘附”是指至少兩個細胞間通過選擇素分子 與選擇素特異性配體之間的相互作用而粘附。細胞與細胞間粘附包括細胞遷 移。
文中限定“細胞粘附相關疾病”為由細胞與細胞的粘附或遷移所導致或 與其相關的任何疾病或失調。細胞粘附失調還包括由免疫系統或炎癥系統的 不適當的、異常的或反常的活化產生的任何疾病或不調。這樣的疾病包括但 不限于心肌梗塞、細菌或病毒感染、轉移性疾病(例如癌癥)。本發明進一 步的特征為以通過施予LXR激動劑或ApoE多肽而治療細胞粘附失調的方 法。
如文中使用,“癌干細胞”或“癌癥起始細胞”是指具有與正常干細胞 相關的特性(具體地產生在具體的癌樣本中發現的全部細胞類型的能力)的 癌細胞。因此,癌干細胞為致瘤的或腫瘤形成,或許與其它的非致瘤的癌細 胞相反。癌干細胞可作為獨特的群體留存在腫瘤中,并通過產生新的腫瘤而 引起癌癥的復發和轉移。
如文中使用,“腫瘤種植”是指腫瘤細胞簇的溢出,以及它們隨后在原 發癌位點外的其它位點生長為惡性植入物。
如文中使用,“轉移性結節”是指腫瘤細胞在體內原發癌位點外的其它 位點的聚集。
在下面的描述中說明本發明的一個或多個實施方式的細節。本發明的其 它特征、目的和優點將從所述說明書和權利要求書中變得顯而易見。
附圖說明
圖1.系統鑒定miR-1908、miR-199a-3p和miR-199a-5p為人黑素瘤轉 移的內源啟動子。(A)描述在獨立的MeWo和A375轉移衍生物中相對于 其各自的親本細胞而上調的miRNA的方差標準化的微陣列表達值的熱圖。 顏色圖表示每個熱圖行的平均值的標準誤差改變。(B)通過qRT-PCR驗 證了MeWo-LM2轉移性衍生物中通過微陣列雜交發現上調的miRNA,n=3。 (C)在靜脈注射4×104個過表達miR-199a、miR-1908、miR-214的前體或 對照發夾的親本MeWo細胞后,肺轉移性定植的生物發光成像圖。在注射 后63天取出肺,并H&E染色。n=5。(D)在靜脈注射4×104個表達抑制 miR-1908(m1908KD)、miR-199a-3p(m199a3p KD)、miR-199a-5p(m199a5p  KD)的短發夾(miR-Zip)或對照序列(shCTRL)的LM2細胞后,相應于 肺轉移的生物發光成像圖和H&E染色的肺。在注射后49天取出肺并H&E 染色,n=5~8。(E)在第42天通過生物發光成像量化2×105個具有miR-Zip 誘導的miR-1908、miR-199a-3p、miR-199a-5p的沉默或對照序列的A375-LM3 轉移性衍生物對肺的定植。n=5~8。(F)通過qRT-PCR以不知情的方式在一 群來自MSKCC患者的非轉移性(n=38)和轉移性(n=33)原發黑素瘤皮膚 病變中測定miR-199a-3p、miR-199a-5p和miR-1908的表達水平。n=71。全 部的數據表示為平均值±SEM。*p<0.05,**p<0.01,***p<0.001。還參見圖12。
圖2.MiR-1908、miR-199a-3p和miR-199a-5p在調節黑素瘤轉移性進展 中顯示細胞自主的/非細胞自主的的雙功能(A)皮下注射1×106個過表達 miR-199a、miR-1908或對照發夾的親本MeWo細胞到免疫缺陷小鼠中,并隨 時間監測原發腫瘤的體積。n=4~6。(B)讓1×105個過表達miR-199a、miR-1908 或對照發夾的親本MeWo細胞通過穿孔(trans-well)的涂布基質膠的嵌入物 侵襲24個小時,并量化侵襲到每個插入物的基側的細胞的數目。n=7。(C-D) 1×105個具有miR-Zip誘導的對miR-199a-3p、miR-199a-5p、miR-1908抑制 或對照序列的高轉移性MeWo-LM2(C)和A375-LM3(D)細胞用于細胞侵 襲實驗。n=6~8。(E)5×104個過表達miR-199a、miR-1908或者對照發夾的 MeWo細胞接種在孔的底部,并讓1×105個人臍靜脈內皮細胞(HUVEC)通 過穿孔插入物向癌細胞遷移16個小時。通過量化遷移到每個插入物的基側的 HUVEC的數目而測量內皮募集的能力。n=7。(F-G)miR-199a-3p、 miR-199a-5p、miR-1908或對照序列對5×104個MeWo-LM2(F)和A375-LM3 (G)細胞內皮募集的抑制。n=6~10。(H)在靜脈注射2×105個排除 miR-199-3p、miR-199a-5p、miR-1908或對照序列的高轉移性MeWo-LM2細 胞后,形成的轉移性結節的血管密度分布百分比的累積部分的圖。用人波形 蛋白(藍色)和MECA-32(紅色)免疫組織化學雙染色肺切片,并量化基于 波形蛋白染色區分的每個轉移性結節內MECA-32陽性區域的百分比。n=211 個結節(對照KD);n=60個結節(m199a3p KD);n=138個結節(m199a5p KD); n=39個結節(m1908KD)。全部的數據表示為平均值±SEM。比例尺,100μm。 還參見圖13。
圖3.鑒別ApoE和DNAJA4為miR-199a和miR-1908共同的靶基因(A) 描述了在差轉移性的過表達miR-199a、miR-1908或對照發夾的MeWo細胞 和高轉移性的MeWo-LM2細胞中,通過qRT-PCR測量的ApoE和DNAJA4 的mRNA水平的熱圖。顏色圖描述了每個熱圖欄的平均值的標準偏差的變 化。(B)異源的熒光素酶報告基因分析測量了野生型ApoE和DNAJA4 3’UTR/CDS熒光素酶融合蛋白或miRNA靶位點突變ApoE和DNAJA4 3’UTR/CDS融合在過表達miR-199a、miR-1908或對照發夾的親本MeWo細 胞中的穩定性。n=3~4。(C)野生型ApoE和DNAJA43’UTR/CDS熒光素酶 融合蛋白在具有沉默表達miR-199a-3p、miR-199a-5p、miR-1908或對照序列 的MeWo-LM2細胞中的穩定性。n=4。(D)miR-199a-3p、miR-199a-5p和 miR-1908靶向的ApoE和DNAJA43’UTR/CDS的實驗衍生模型的原理圖。 (E)野生型和miRNA靶向位點突變ApoE和DNAJA43’UTR/CDS熒光素 酶融合蛋白在高轉移性MeWo-LM2衍生物和它們差轉移性的親本細胞中的 熒光素酶活性。n=4。(F)1×105個過表達對照載體或過表達ApoE或DNAJA4 的MeWo-LM2細胞的基質膠侵襲能力。n=4。(G)5×104個轉化對照載體或 過表達ApoE或DNAJA4的載體的MeWo-LM2細胞的內皮募集能力。n=6。 (H-I)評估差轉移性的轉化靶向ApoE、DNAJA4或對照序列的慢病毒短發 夾的親本MeWo細胞的基質膠侵襲性能(H)和募集內皮細胞的能力(I)。 n=6-8。全部的數據表示為平均值±SEM。比例尺,100μm。還參見圖14。
圖4.miR-199a和miR-1908直接靶向ApoE和DNAJA4促進了轉移性 侵襲、內皮募集和定植(A~D)在miR-1908抑制(m1908KD;A、B)或 miR-199a-5p抑制(m199a5p KD;C,D)的情況下,表達對照shRNA或靶 向ApoE或DNAJA4的shRNA的高轉移性LM2細胞進行細胞侵襲(A、C) 和內皮募集測定(B、D)。n=6~8。(E~F)在miR-1908沉默(E)或miR-199a-5p 沉默(F)的條件下,靜脈注射1×105個表達對照發夾或靶向ApoE、DNAJA4 或對照序列的發卡的LM2細胞后,典型的肺轉移的生物發光成像圖和H&E 染色的肺。n=5。(G-H)分析在過表達miR-1908的條件下過表達ApoE或 DNAJA4或表達對照載體的親本MeWo細胞的基質膠侵襲(G)和內皮募集 (H)表型。(I~J)用靶向miR-199a-3p、miR-199a-5p和miR-1908的LNA 或對照LNA的混合物轉化表達對照shRNA或靶向ApoE和DNAJA4的 shRNA的A375-LM3衍生物,并分析在基質膠中的侵襲(I)和內皮募集(J) 檢測。n=4。(K)以累積分數圖表示的miR-1908抑制的并轉化靶向ApoE、 DNAJA4或對照序列的shRNA的MeWo-LM2細胞形成的轉移性結節的血管 密度分布。用人波形蛋白(藍色)和內皮標記MECA-32(紅色)免疫組織化 學地雙染色圖4E的肺切片。定量每個波形蛋白陽性結節中MECA-32陽性 面積的百分比。n=39個結節(shCTRL);n=97(shAPOE1);n=38(shAPOE2); n=200(shDNAJA41);n=19(shDNAJA42)。全部的數據表示為平均值±SEM。 比例尺,100μm。還參見圖15。
圖5.黑素瘤細胞分泌的ApoE抑制了黑素瘤侵襲和內皮募集,而ApoE 的基因缺失促進了轉移。(A-B)MeWo-LM2轉移衍生物及其親本細胞(A) 和miR-199a-5p、miR-1908或對照序列沉默的LM2細胞(B)在條件培養基 中通過ELISA定量的細胞外ApoE水平。n=3。(C)加ApoE中和的抗體1D7 (10~40μg/mL)或IgG(40μg/mL)到細胞培養基中,并評估親本MeWo 細胞的基質膠侵襲。n=4~6。(D)在1D7(40μg/mL)或對照IgG抗體(40 μg/mL)的存在下親本MeWo細胞的內皮募集。n=4。(E)在加到細胞培養 基的牛血清白蛋白(BSA)(100μM)或重組ApoE3(100μM)的存在下評 估LM2細胞中的基質膠侵襲和內皮募集表型。n=7~10。(F-G)在IgG或中 和ApoE的1D7抗體(40μg/mL)的存在下檢查沉默miR-199a-3p、 miR-199a-5p、miR-1908或對照序列的表達的LM2細胞的基質膠侵襲能力(F) 和內皮募集能力(G)。n=5~6。(H)在條件培養基中通過ELISA定量靶向 DNAJA4或對照序列的shRNA轉化的親本MeWo細胞的ApoE水平。n=3。 (I-J)在BSA(100μM)或重組ApoE3(100μM)的存在下,分析shRNA 誘導的DNAJA4沉默的親本MeWo細胞的基質膠侵襲(I)和內皮募集(J) 表型。n=4。(K)在痣(n=9)、原發性黑素瘤(n=6)以及遠端黑素瘤轉移樣 本(n=19)中的基于陣列的ApoE表達水平。(L)在存在100μg/mL的重組 ApoE3或BSA的條件下培養高轉移性MeWo-LM2細胞。在24個小時后, 靜脈注射4×104個細胞到NOD-SCID小鼠,并通過生物發光成像監測肺的定 植。n=6。(M)通過靜脈注射5×104個B16F10小鼠黑素瘤細胞到ApoE遺傳 缺失的C57BL/6小鼠或它們的野生型對照同窩出生仔畜而發生的肺轉移。肺 生物發光定量以及典型的H&E染色的肺對應于注射后19天。n=8~18。全部 的數據表示為平均值±SEM。比例尺,100μm。
圖6.鑒別調節ApoE對黑素瘤侵襲和內皮募集的作用的不同的黑素瘤 和內皮細胞受體。(A)在BSA(100μM)或重組ApoE3(100μM)的存在 下,檢查1×105個轉化靶向LDLR、VLDLR、LRP8、LRP1或對照序列的siRNA 的LM2細胞的基質膠侵襲性能。n=4~7。(B)1×105個用靶向LRP1或對照 siRNA的siRNA轉染轉化靶向miR-1908或對照序列的短發夾的MeWo-LM2 細胞,并進行基質膠侵襲實驗。n=4。(C)在miR-1908抑制的條件下,用靶 向LRP1或對照序列的siRNA轉化的1×105個LM2細胞的肺定植的生物發 光成像。n=5。(D)分析用BSA(100μm)或重組ApoE3(100μm)預孵育 24個小時的1×105個內皮細胞被5×105個LM2細胞內皮募集的表型。n=3~4。 (E)用靶向LDLR、VLDLR、LRP1、LRP8或對照序列的siRNA轉化1×105個內皮細胞,并讓其在穿孔系統中向miR-1908或對照序列抑制的LM2細胞 遷移。n=4-12。(F)在加到培養基中的IgG(40μg/mL)或1D7抗體(40μg /mL)的存在下,1×105個內皮細胞的穿孔遷移。n=6~8。(G)在BSA(100μM) 或重組ApoE3(100μM)的存在下用靶向LRP8的siRNA或對照序列轉化的 1×105個內皮細胞的穿孔遷移。n=6~7。(H)用靶向LRP8或對照序列的siRNA 轉化1×105個內皮細胞,并評價沿ApoE梯度的穿孔趨化性遷移。n=6-8。(I) 向皮下植入到小鼠的腹側上的包含BSA(10μg/mL)、VEGF(400ng/mL)+ BSA(10μg/mL)或VEGF(400ng/mL)+重組ApoE3(10μg/mL)的基質 膠栓塞中的內皮募集,n=3~6。(J)在靜脈注射5×104個B16F10小鼠黑素瘤 細胞到野生型或ApoE遺傳缺失小鼠后,形成的肺轉移性結節內的血管密度。 免疫組織化學染色圖5M的肺切片的MECA-32,并量化基于細胞染色概述的 每個轉移性結節內MECA-32陽性面積的百分比。n=17~20。全部的數據表 示為平均值±SEM。比例尺,100μm。
圖7.miR-199a-3p、miR-199a-5p和miR-1908在黑素瘤轉移中的臨床和 治療協同(A-D)。MSKCC群體(n=71)的Kaplan-Meier曲線,其代表作為 它們原發性黑素瘤病變的miR-199a-3p(A)、miR-199a-5p(B)、miR-1908 (C)或合計的三種miRNA表達水平(D)的函數的患者的無轉移的存活。 分類其原發性腫瘤miRNA的表達或合計的miRNA表達水平(miR-199a-3p、 miR-199a-5p和miR-1908的表達值的和)大于群體的中值的患者為miRNA 表達陽性(紅色),而分類其以低于中值的水平表達指定的miRNA的原發性 腫瘤為miRNA表達陰性(藍色)。(E)用單個靶向每一個miR-1908、 miR-199a-3p或miR-199a-5p的LNA,靶向所有三種miRNA的LNA的組合, 或對照LNA轉染的高轉移性LM2細胞的肺轉移。轉染后第48小時,1×105個細胞靜脈注射到免疫缺陷小鼠。n=5~6。(F)在心內注射到無胸腺的裸鼠 前48小時,1×105個轉染對照LNA(LNA-CTRL)或靶向miR-1908、 miR-199a-3p、miR-199a-5p的LNA的混合物(LNA-3miRNA)的MeWo-LM2 細胞的全身轉移。n=5。(G)在心內注射后第28天由LNA-CTRL和LNA-3 miRNA LM2細胞產生的全身性轉移病灶的數目。n=5。(H-I)在心內注射 LNA-CTRL和LNA-3miRNA LM2細胞后第28天,骨轉移(H)和腦轉移(I) 的生物發光信號的定量。n=5。(J)尾靜脈注射4×104個高轉移性MeWo-LM2 細胞到免疫妥協的小鼠,并且用12.5mg/kg總劑量的體內優化的靶向 miR-1908、miR-199a-3p和miR-199a-5p的LNA的混合物或模擬的PBS對照 以兩周的基礎靜脈注射處理小鼠四周。通過生物發光成像評價肺的定植,并 顯示了在第56天提取的典型的H&E染色的肺。n=5-6。(K)通過靶向ApoE 介導的黑素瘤細胞LRP1和內皮細胞LRP8受體信號,黑素瘤中轉移性侵襲、 內皮募集和定植的依賴于miRNA調節的模型。
圖8.ApoE/LRP1信號的MiRNA依賴的靶向通過CTGF的誘導促進癌 細胞侵襲和內皮募集。(A)在(1)MeWo親本和MeWo-LM2細胞、(2)過 表達miR-199a、miR-1908或對照發夾的MeWo親本細胞和(3)轉化靶向 ApoE的短發夾或對照序列的MeWo親本細胞中,通過qRT-PCR分析確定的 方差歸一化的CTGF表達水平的熱圖。彩圖表示平均值的標準差變化。(B) 在條件培養基中,通過ELISA確定的ApoE敲降的MeWo親本細胞的CTGF 水平。n=6;p值基于單側學生t檢驗。(C)在條件培養基中,通過ELISA 定量的,在LRP1敲降或對照敲降的情況下,用重組ApoE處理的高轉移性 MeWo-LM2細胞的CTGF水平。n=3~4;p值基于單側學生t檢驗。(D-E)(1) 用靶向CTGF或對照序列的獨立的siRNA轉染shRNA誘導的ApoE敲降的 親本MeWo細胞,或者(2)在CTGF中和抗體(20μg/mL)或IgG對照抗 體(20μg/mL)的存在下,孵育shRNA誘導的ApoE敲降的親本MeWo細胞, 并使細胞經歷細胞侵襲(D)和內皮募集(E)檢測。n=6~8;p值基于單側 學生t檢驗;比例尺表示100μM。全部的數據表示為平均值±SEM。
圖9.CTGF調節依賴于miRNA的轉移性侵襲、內皮募集和定植。(A) 如圖中所示,1×105個表達對照發夾或過表達miR-199a或miR-1908的親本 MeWo細胞在靶向CTGF的封閉性抗體(20μg/mL)或對照IgG抗體(20 μg/mL)的存在下,進行穿孔細胞侵襲實驗。n=4~10;p值基于單側學生t 檢驗。全部的數據表示為平均值±SEM。(B)表達對照發夾或過表達miR-199a 或miR-1908的親本MeWo細胞的內皮募集。如所示,在檢測開始時,加入 靶向CTGF的中和抗體(20μg/mL)或對照IgG抗體(20μg/mL)到內皮細 胞,并讓1×105個內皮細胞在穿孔遷移檢測中向5×104個癌細胞遷移。n=3~8; p值基于單側學生t檢驗。(C)在miR-199a或miR-1908過表達的情況下, 5×104個敲降CTGF的親本MeWo細胞的肺轉移的生物發光成像。n=5~6;使 用單向Mann-Whitney t檢驗獲得p值。全部的數據表示為平均值±SEM。
圖10.用LXR激動劑GW3965處理提高了黑素瘤細胞的ApoE水平, 并抑制了癌細胞的侵襲、內皮募集和轉移性定植。(A-B)在指示的濃度的 DMSO或GW3965的存在下,孵育親本MeWo細胞。在48個小時后,提取 總RNA,并通過qRT-PCR測定ApoE(A)和DNAJA4(B)的水平。n=3。 (C)用GW3965或DMSO預處理48個小時的1×105個親本MeWo細胞的 細胞侵襲。n=6~7。p值基于單側學生t檢驗。全部的數據表示為平均值±SEM。 (D)用GW3965或DMSO預處理48個小時的5×104個親本MeWo細胞的 內皮募集。n=6~7。p值基于單側學生t檢驗。(E)用包含GW3965(20mg/kg) 的基于谷物的飼料或對照飼料喂養小鼠。10天后,4×104個親本MeWo細胞 尾靜脈注射到小鼠中,并在整個實驗期間用含GW3965的飼料或對照飼料連 續地喂養小鼠。通過生物發光成像評價肺的定植。n=5-6;使用單向 Mann-Whitney t檢驗獲得p值。全部的數據表示為平均值±SEM。
圖11.鑒別miR-7為黑素瘤轉移的內源抑制子。(A)在靜脈注射4×104個表達抑制miR-7(miR-7KD)的短的發夾(miR-Zip)的親本MeWo細胞 后,肺的轉移性定植的生物發光成像圖。注射后63天取出肺,并H&E染色。 n=5。(B)4×104個過表達用于miR-7的前體或對照發夾的LM2細胞的肺轉 移。通過生物發光成像每周監測肺定植,并在注射后77天取出肺。n=5。全 部的數據表示為平均值±SEM;使用單向Mann-Whitney t檢驗確定p值。 *p<0.05,**p<0.01。
圖12.高轉移性人黑素瘤細胞系衍生物的體內選擇及鑒別miR-199a-3p、 miR-199a-5p和miR-1908為促進轉移miRNA(A-B)肺轉移的生物發光成像, 以及相應于MeWo-LM2(A)和A375-LM3轉移性衍生物(B)及它們各自 的親本細胞系的H&E染色的肺的代表性圖像。靜脈注射4×104個 MeWo-Par/MeWo-LM2細胞和1×105個A375-Par/A375-LM3細胞到 NOD-SCID小鼠,并分別在第72天和第49天取出肺,并H&E染色。n=4~5。 (C)通過qRT-PCR確定A375-LM3轉移性衍生物及它們的親本細胞中 miR-199a-5p、miR-199a-3p、miR-1908和miR-214的表達水平。n=3。(D) 用表達對照發夾或產生miR-199a(miR-199a-3p與miR-199a-5p二者)、 miR-1908或miR-214的前MiRNAturalist發夾構建物的逆轉錄病毒轉化親本 MeWo細胞。通過qRT-PCR測定靶向miRNA的表達水平。n=3。(E)分析 圖1C的H&E染色的肺切片的由過表達miR-199a、miR-1908或對照發夾的 親本MeWo細胞產生的轉移性結節的數目。n=3。(F)分析圖1D的H&E染 色的肺切片的miR-199a-3p、miR-199a-5p、miR-1908或對照序列的表達被沉 默的LM2細胞形成的轉移性結節的數目。n=3。全部的數據表示為平均值 ±SEM。
圖13.MiR-199a和miR-1908抑制體外增殖,并選擇地促進細胞侵襲和 內皮募集(A)以一式三份接種2.5×104個過表達miR-199a、miR-1908或對 照發夾的MeWo細胞,并在5天后計數活細胞。n=3。(B)比較1×105個差 轉移性親本MeWo和高轉移性LM2細胞在穿孔檢測中通過基質膠侵襲的性 能。n=3~4。(C)在6孔板中接種1×105個內皮細胞,并讓其形成單層。在 內皮單層的頂部接種2×105個過表達miR-199a、miR-1908或對照發夾的親本 MeWo細胞,并孵育30分鐘。然后成像每個單層,量化附著內皮細胞的癌細 胞的數目。n=3。(D)在包含補充0.2%的甲基纖維素的細胞培養基的低附著 板中接種1×106個過表達miR-199a、miR-1908或對照發夾的親本MeWo細 胞。在懸浮液中48個小時后,量化死細胞和活細胞的數目。n=3。(E)在6 孔板中接種5×105個過表達miR-199a、miR-1908或對照發夾的親本MeWo 細胞中,并在低血清培養基中孵育48個小時,然后量化活細胞的數目。n=4。 (F)過表達miR-199a、miR-1908或對照發夾的親本MeWo細胞的集落形成。 在6cm板中接種50個細胞,并在2周后量化形成的集落的數目。n=4。(G) 在孔的底部接種5×104個親本MeWo和LM2細胞,并評價它們募集內皮細胞 的能力。n=6~8。(H過表達miR-199a、miR-1908或對照發夾的親本MeWo 細胞形成的轉移性結節的血管密度百分比,顯示為累積分數圖。用人波形蛋 白和MECA-32免疫組織化學雙染色來自圖1C的肺切片,并使用ImageJ量 化人波形蛋白染色產生的相對于總的結節面積的MECA-32陽性面積。n=43 個結節(對照);n=117個結節(miR-199a OE);n=55結節(miR-1908OE)。 全部的數據表示為平均值±SEM。比例尺100μm。
圖14.MiR-199a和miR-1908匯聚地且協同地靶定ApoE和DNAJA4(A) 顯示導致識別miR-199a-3p、miR-199a-5p和miR-1908共同的潛在靶基因的 綜合實驗方法的維恩圖。在轉移性LM2細胞中,相對于它們的親本細胞系, 當每個miRNA過表達時,下調超過1.5倍的基因的轉錄組譜與當沉默每個 miRNA時上調超過1.5倍的基因重疊,并與下調超過1.5倍的基因重疊。 (B~D)在過表達miR-199a、miR-1908或對照發夾的親本MeWo細胞(B) 中、在親本MeWo細胞和它們的高轉移性LM2衍生細胞系(C)和在具有基 于miR-Zip的miR-199a-3p、miR-199a-5p、miR-1908或對照序列沉默的 MeWo-LM2細胞(D)中,通過qRT-PCR測量的ApoE和DNAJA4的表達水 平。n=3。(E)在抑制miR-199a-3p、miR-199a-5p、miR-1908或對照序列的 高轉移性LM2細胞中,測量miR-199a-3p、miR-199a-5p或miR-1908靶位點 突變的ApoE和DNAJA43’UTR/CDS熒光素酶融合的穩定性的異源螢光素酶 報告基因檢測。n=3~4。(F)用表達對照載體或產生ApoE或DNAJA4的過 表達載體的逆轉錄酶病毒轉化MeWo-LM2細胞。通過qRT-PCR確定靶基因 的表達水平。(G)在轉化靶向ApoE、DNAJA4或對照序列的慢病毒shRNA 的親本MeWo細胞中通過qRT-PCR確定的ApoE和DNAJA4的表達水平。 全部的數據表示為平均值±SEM。
圖15.miR-199a/miR-1908和ApoE/DNAJA4之間的強相互作用(A~D)。 在miR-Zip誘導的miR-1908(A、B)、miR-199a-5p(C、D)或對照序列沉 默的條件下,用靶向ApoE(A、C)、DNAJA4(B、D)的慢病毒shRNA或 對照shRNA轉化MeWo-LM2細胞。通過qRT-PCR分析靶基因的水平。(E) 在抑制miR-1908的條件下,1×105個表達對照發夾或靶向ApoE、DNAJA4 的shRNA(獨立于圖4E中使用的shRNA)或對照序列的LM2細胞的肺轉 移生物發光成像。典型的生物發光圖像和H&E染色的肺相應于注射后42天。 n=5。(F-G)在過表達miR-1908(F)或miR-199a(G)的條件下,在轉化 表達對照載體或ApoE或DNAJA4過表達載體的逆轉錄病毒的親本MeWo細 胞中,通過qRT-PCR分析ApoE和DNAJA4的表達水平。(H-I).在過表達 miR-199a的條件下,檢查過表達ApoE或DNAJA4或表達對照載體的親本 MeWo細胞的侵襲(H)和內皮募集(I)表型。n=7~8。(J)在過表達miR-1908 的條件下,4×104個過表達ApoE或DNAJA4或表達對照載體的親本MeWo 細胞的肺轉移的生物發光成像。典型的生物發光圖像和H&E染色的肺相應 于注射后56天。n=4~8。(K)在用表達靶向ApoE和DNAJA4或對照序列的 shRNA構建物的慢病毒轉化的高轉移性A375-LM3衍生物中,通過qRT-PCR 確定ApoE和DNAJA4的表達水平。全部的數據表示為平均值±SEM。比例 尺100μm。
圖16.細胞外ApoE抑制黑素瘤侵襲和內皮募集表型,不依賴于癌細胞 或內皮細胞增殖和存活的任何效果。(A)在條件培養基中,通過ELISA測 量過表達miR-199a、miR-1908或對照發夾的MeWo細胞的細胞外ApoE水 平。n=3。(B-C)在BSA(100μM)或APOE(100μM)的存在下培養3×104個MeWo-LM2細胞(B)或內皮細胞(C),并通過在每個所示時間點計數活 細胞的數目而隨時間監測細胞的增殖。n=3。(D-E)在BSA(100μM)或 APOE(100μM)的存在下,MeWo-LM2細胞(D)或內皮細胞(E)在血清 饑餓的條件下的存活。n=3。(F-G)評估轉化表達對照載體或靶向DNAJA4 的短發夾構造的慢病毒的親本MeWo細胞(F)和轉化表達對照載體或過表 達DNAJA4的載體的慢病毒的LM2細胞(G)中的ApoE的mRNA表達水 平。n=3。(H-I)在IgG(40μg/mL)或1D7(40μg/mL)ApoE中和抗體的 存在下,評估轉化表達對照載體或過表達DNAJA4的載體的LM2細胞通過 基質膠侵襲(H;n=6~8),以及在穿孔檢測中募集內皮細胞的能力(I;n=4)。 全部的數據表示為平均值±SEM。
圖17.ApoE通過靶向黑素瘤細胞LRP1和內皮細胞LRP8受體而抑制細 胞侵襲和內皮募集。(A)分析1×105個轉化針對LRP1或對照序列的siRNA 的LM2細胞通過基質膠侵襲的能力。n=9~12。(B)用靶向LRP1的siRNA 或對照siRNA轉染1×105個抑制miR-199a-5p或對照序列的MeWo-LM2細胞, 并檢查它們的基質膠侵襲能力。n=4。(C)在第56天,從注射了轉化有對照 siRNA或靶向LRP1的siRNA的MeWo-LM2miR-1908KD細胞的 NOD-SCID小鼠取出典型的H&E染色的肺(參見圖6C)。(D-E)用靶向LRP8 或對照序列的siRNA轉化1×105個內皮細胞,并讓其穿孔遷移到5×104個表 達短的對照發夾的MeWo-LM2細胞(D;n=8)或5×104個抑制miR-199a-5p 或對照序列的MeWo-LM2細胞(E;n=4)。全部的數據表示為平均值±SEM。 比例尺100μm。
圖18.miR-199a和miR-1908的基于LNA的抑制阻止了黑素瘤轉移。 (A)用對照LNA或靶向miR-199a-3p、miR199a-5p和miR-1908的LNA的 混合物轉化2.5×104個MeWo-LM2細胞的體外細胞增殖。在5天后量化活細 胞的數目。n=3。(B)用對照LNA或靶向miR-199a-3p、miR199a-5p和 miR-1908的LNA的混合物轉化的高轉移性A375-LM3衍生物的肺的定植。 在轉染后48個小時,靜脈注射5×105個細胞到NOD-SCID小鼠,并在35天 后通過測量生物發光而確定肺的定植。n=5~6。(C)兩周一次地監測用靶向 三種miRNA的LNA的混合物處理的小鼠或模擬PBS對照處理的小鼠的重量 (圖7J)。n=5-6。全部的數據表示為平均值±SEM。
圖19.LXRβ信號的活化抑制黑素瘤細胞的侵襲和內皮募集。(A)描述 NCI-60黑素瘤細胞系集合中LXR和RXR亞型基于陣列的表達水平的熱圖。 這些基因的熱圖取自更大的細胞核激素受體家族的熱圖(圖20)。熱圖的圖 解表示每個細胞系中每個受體的表達值相對于陣列描述的全部基因(>39,000 個轉錄變體)的平均表達值的標準偏差的變化。(B)1×105個MeWo、5×104個HT-144、5×105個SK-Mel-2和5×104個SK-Mel-334.2人黑素瘤細胞的細 胞侵襲。以1μM的DMSO、GW3965、T0901317或蓓薩羅丁處理細胞72個 小時,并用于穿孔基質膠侵襲實驗。n=4-8。(C)在穿孔遷移檢測中,檢測5×104個MeWo、HT-144、SK-Mel-2和SK-Mel-334.2人黑素瘤細胞募集1×105個內 皮細胞的能力,然后用1μM的DMSO、GW3965、T0901317或蓓薩羅丁處 理黑素瘤細胞72個小時。n=4~8。(D-E)在以1μM的DMSO、GW3965或 T0901317處理細胞72個小時后,使表達對照shRNA或靶向LXRα或LXRβ 的shRNA的1×105個MeWo(D)和1×105個HT-144(E)黑素瘤細胞經歷 細胞侵襲實驗。n=4~12。(F-G)用1μM的DMSO、GW3965或T0901317 處理轉化靶向LXRα或LXRβ的慢病毒shRNA或對照shRNA的5×104個MeWo (F)和5×104個HT-144(G)細胞72個小時,并在穿孔遷移檢測中檢測它 們募集1×105個內皮細胞的能力。n=7~8。全部的數據表示為平均值±SEM。 比例尺50μm。*p<0.05,**p<0.01,***p<0.001,****p<0.0001。
圖20.分析黑素瘤中細胞核激素受體的表達,以及LXR和RXR激動劑 對體外細胞生長的影響,涉及圖19(A~G)。(A)熱圖顯示全部細胞核激素 受體家族成員在黑素瘤系的NCI-60集合中基于微陣列的表達水平。每個受 體的表達水平表示為小于或大于在各個細胞系中通過陣列檢測到的全部基因 (>39,000個轉錄變體)的平均表達水平的標準偏差的數目。(B)在6孔板 中接種2.5×104個MeWo、HT-144或SK-Mel-334.2人黑素瘤細胞,并在1μM 的DMSO、GW3965、T0901317或蓓薩羅丁的存在下培養。在接種后第5天 計數活細胞。n=3~6。(C)一式三份鋪板2.5×104個MeWo、HT-144或 SK-Mel-334.2細胞,并在含有1μM的DMSO、GW3965、T0901317或蓓薩 羅丁的培養基中培養5天,然后使用臺盼藍死細胞染色量化死細胞的數目。 n=3。(D-G)通過qRT-PCR確定的LXRα和LXRβ在表達對照shRNA或靶向 LXRα或LXRβ的shRNA的MeWo(D,E)和HT-144(F,G)人黑素瘤細胞 中的相對表達。全部的數據表示為平均值±SEM。
圖21.治療性LXR活化抑制黑素瘤的腫瘤生長。(A-B)通過皮下注射 5×104個B16F10小鼠黑素瘤細胞到C57BL/6-WT小鼠的原發性腫瘤生長。在 腫瘤生長至5~10mm3的體積后,連續地飼養對照飼料或補充GW3965(20 mg/kg/天或100mg/kg/天)(A)或T0901317(20mg/kg/天)(B)的飼料給小 鼠。顯示的代表性腫瘤圖像對應于在最后的一天(d12)取出的腫瘤。n=10~18 (A)、8~10(B)。(C~E)皮下注射1×106MeWo(C)、7.5×105SK-Mel-334.2 (D)和2×106SK-Mel-2(E)人黑素瘤細胞到免疫妥協小鼠的原發性腫瘤生 長。在腫瘤生長至5~10mm3的體積后,隨機分配小鼠對照飼料或補充 GW3965(20mg/kg或100mg/kg,如所示)的飼料。顯示的腫瘤圖像對應于 測量的最后一天。n=6-34(C)、8(D)、5(E)。(F)皮下注射5×104個B16F10 細胞到C57BL/6-WT小鼠。當腫瘤生長至150mm3時,連續地飼養小鼠對照 飼料或包含GW3965(150mg/kg)的飼料,并且每天測量腫瘤的生長。n=6~13。 (G-I)皮下移植5×104個B16F10(G)、1×106個MeWo(H)和7.5×105個 SK-Mel-334.2細胞(I)到給于正常飼料或補充GW3965(100mg/kg)的飼 料的小鼠后,通過測量5~10mm3體積的腫瘤的形成的而測得的小鼠總的存 活。n=6~9(F)、4~7(H)、3~6(I)。(J-L)響應于用對照飼料或添加GW3965 的飼料(20mg/kg)處理35天的小鼠,1×106個MeWo人黑素瘤細胞形成的 皮下黑素瘤腫瘤中,通過針對小鼠內皮細胞抗原MECA-32的免疫組織化學 染色確定的腫瘤內皮細胞的密度(J),通過對增殖標記Ki-67的染色確定的 腫瘤細胞增殖(K),以及通過裂解的半胱天冬酶-3染色確定的腫瘤細胞的細 胞凋亡(L)。n=5。以(小的直徑)2×(大的直徑)/2計算腫瘤體積。全部 的數據表示為平均值±SEM。比例尺5mm(A-D)、50μm(J,K)、25μm(L)。
圖22.LXRβ激動抑制黑素瘤腫瘤生長,涉及圖21(A-E)(A)飼養對 照飼料或補充GW3965(20mg/kg/天或100mg/kg/天)或T0901317(20mg/kg/ 天)的飼料給小鼠65天的小鼠的重量測量。n=5~6。
圖23.LXR激動抑制黑素瘤轉移到肺或腦。(A)用DMSO或GW3965 (1μM)預處理MeWo細胞48個小時,并通過尾靜脈靜脈注射4×104個細 胞到NOD Scid小鼠。通過每周的生物發光成像監測肺的定植。顯示了相應 于最后一天(d70)的典型的H&E染色的肺。n=4-5。(B-C)靜脈注射4×104個MeWo細胞到在癌細胞注射前10天開始飼喂對照飼料或包含GW3965(20 mg/kg)或T0901317(20mg/kg)的飼料的NOD Scid小鼠的肺轉移的生物發 光成像。典型的H&E染色的肺對應于最終染色的那一天。n=5~6。(B-C)靜 脈注射4×104個MeWo細胞到在癌細胞注射前10天開始飼喂對照飼料或包 含GW3965(20mg/kg)或T0901317(20mg/kg)的飼料的NOD Scid小鼠 的肺轉移的生物發光成像。典型的H&E染色的肺對應于最終染色的那一天。 n=5-6。(F)心內注射1×105個MeWo腦轉移性衍生物細胞到從注射后第0 天開始飼喂對照飼料或補充GW3965的飼料(100mg/kg)的無胸腺的裸鼠的 全身和腦的光子通量。n=7。(G)用于評價GW3965治療抑制腫瘤切除后肺 轉移能力的實驗性原位轉移模型的示意圖。(H)在切除大小相當的(~300mm3的體積)由1×106個MeWo黑素瘤細胞形成的皮下黑素瘤腫瘤后,在施予對 照飼料或含GW3965的飼料(100mg/kg)1個月的NOD Scid小鼠中,通過 生物發光成像確定的離體肺光子通量。還顯示了人波形蛋白染色的典型的肺。 n=7~9。(I)靜脈注射4×104個MeWo細胞到NOD Scid小鼠。在d42通過生 物發光成像檢測到轉移的開始后,如所示給于小鼠對照飼料或GW3965飼料 (100mg/kg),并每周測量肺定植的進展。n=6。(J)如(I)中所示,在最 后一天(d77)從施予對照飼料或補充GW3965(100mg/kg)的飼料的NOD Scid小鼠提取的H&E染色的肺中肉眼可見的轉移性結節的數目。n=4~5。(K) 靜脈注射4×104個MeWo細胞到在注射癌細胞前10天開始連續地飼喂對照飼 料或補充GW3965(20mg/kg)的飼料的NOD-Scid小鼠的總的小鼠存活率。 n=5~6。全部的數據表示為平均值±SEM。
圖24.LXR活化治療對遺傳驅動的黑素瘤進展的抑制。(A)在連續三 天通過腹腔施予4-HT(25mg/kg)的總的黑素瘤誘導后, Tyr::CreER;BrafV600E/+;Ptenlox/+C57BL/6小鼠總的存活率。在第一次注射4-HT 后,隨機地指定小鼠對照飼料或補充GW3965的飼料(100mg/kg)。n=10~11。 (B)如(A)中所述誘導黑素瘤,在第35天測量給于對照飼料或補充GW3965 的飼料(100mg/kg)的Tyr::CreER;BrafV600E/+;Ptenlox/lox小鼠的黑素瘤腫瘤負 荷,表示為背部皮膚面積的百分比。n=4-5。(C)如(A)中所述,總地誘導 黑素瘤進展后,在飼喂對照飼料或補充GW3965的飼料(100mg/kg)的 Tyr::CreER;BrafV600E/+;Ptenlox/lox小鼠死后檢測到的轉移到唾液腺淋巴結結節 的肉眼可見的轉移性結節的數目。n=7-8。(D)在皮下注射1×105BrafV600E/+; Pten-/-;CDKN2A-/-原發性黑素瘤細胞到同系的(syngeneic)C57BL/6-WT小 鼠后的腫瘤生長。當腫瘤生長為5~10mm3的體積后,飼喂小鼠對照飼料或 補充GW3965的飼料(100mg/kg)。n=16-18。(E)在腫瘤生長至5~10mm3的體積后,皮下注射1×105BrafV600E/+;Pten-/-;CDKN2A-/-黑素瘤細胞并用 GW3965飼料(100mg/kg)或對照飼料處理的C57BL/6-WT小鼠總的存活率。 n=7~8。(F)靜脈注射1×105個BrafV600E/+;Pten-/-;CDKN2A-/-原發性黑素瘤 細胞到C57BL/6-WT小鼠的肺的定植。在注射癌細胞后立即隨機地分配給小 鼠對照飼料或添加GW3965的飼料(100mg/kg),用于余下的實驗。n=14~15。 全部的數據表示為平均值±SEM。比例尺,2mm(B)、5mm(D)。
圖25.遺傳驅動的黑素瘤小鼠模型中LXR介導的的黑素瘤進展的抑制, 涉及圖24(A-C)。(A)通過連續3天腹膜內施予4-HT(25mg/kg)誘導總 的黑素瘤后,Tyr::CreER;BrafV600E/+;Ptenlox/lox C57BL/6小鼠總的存活率。 在第一次注射4-HT后,隨機地分配小鼠對照飼料或補充GW3965的飼料(100 mg/kg)。n=7。(B)在通過腹膜內施予4-HT誘導黑素瘤后第43天拍攝的飼 喂對照飼料或補充GW3965的飼料(100mg/kg)的Tyr::CreER;BrafV600E/+; Ptenlox/lox C57BL/6小鼠的代表性圖像。
圖26.MeWo人黑素瘤細胞中響應于GW3965處理的50個最大上調的 基因的列表。
圖27.LXRβ活化誘導黑素瘤細胞中的ApoE表達;ApoE介導依賴于 LXRβ的體外黑素瘤進展表型的抑制。(A-C)以所示濃度的GW3965或 T0901317處理MeWo(A)、HT-144(B)和WM-266-4(C)人黑素瘤細胞 48個小時,并通過qRT-PCR分析ApoE的表達水平。n=3。(D)在從用1μM 的DMSO、GW3965或T0901317處理72個小時的HT-144人黑素瘤細胞收 集的無血清條件培養基中通過ELISA定量的細胞外ApoE蛋白質的水平, n=3~4。(E-F)在檢測開始時,在以40μg/mL加到每個穿孔的ApoE中和抗 體(1D7)或IgG對照抗體存在下,檢測用1μM的DMSO、GW3965或T0901317 處理72個小時的5×104個HT-144細胞的細胞侵襲(E)和內皮募集表型(F)。 n=4。(G-H)分別地,1×105個和5×104個表達對照shRNA或靶向ApoE的 shRNA并在每個檢測前用1μM的DMSO或GW3965處理72個小時的MeWo 細胞的細胞侵襲(G)和內皮募集(F)。n=7-8。(I-J)在用對照shRNA或靶 向LXRα或LXRβ的shRNA轉化并隨后用1μM的DMSO、GW3965或 T0901317處理48個小時的MeWo(I)和HT-144(J)細胞中,通過qRT-PCR 量化的ApoE的相對表達。n=3~9。(K)從用對照shRNA或靶向LXRα或LXRβ 的shRNA轉化并用1μM的DMSO或GW3965處理72個小時的MeWo細胞 收獲的無血清的條件培養基中通過ELISA測量的細胞外ApoE蛋白質水平, n=3。全部的數據表示為平均值±SEM。比例尺50μm。
圖28.LXRβ活化通過轉錄增強黑素瘤細胞ApoE的表達而抑制黑素瘤 侵襲和內皮募集。(A)融合到多個增強子元件1(ME.1)或多個增強子元件 2(ME.2)序列的下游的ApoE啟動子擊退(driven off)的并轉染到用1μM 的DMSO、GW3965或T0901317處理24個小時的MeWo細胞中的熒光素酶 活性。n=4~8。(B)在從用1μM的DMSO、GW3965或T0901317處理72 個小時的MeWo細胞中收獲的無血清的條件培養基中通過ELISA定量細胞 外ApoE蛋白的水平。n=3~4。(C)1×105個用1μM的DMSO、GW3965或 T0901317預處理72個小時的MeWo細胞的細胞侵襲。如所示,在檢測的開 始,以40μg/mL加ApoE中和抗體(1D7)或IgG對照抗體到每個穿孔。n=7~8。 (D)在40μg/mL的1D7或IgG抗體的存在下,檢測用1μM的DMSO、 GW3965或T0901317預處理72個小時的5×104個MeWo細胞募集1×105個 內皮細胞的能力。n=6~8。(E)在來自用1μM的DMSO或GW3965處理72 個小時的SK-Mel-334.2原發性人黑素瘤細胞的無血清條件培養基中通過 ELISA定量的細胞外ApoE蛋白水平。n=4。(F-G)在40μg/mL的1D7或 IgG抗體的存在下,使用1μM的GW3965預處理72個小時的5×104個 SK-Mel-334.2細胞經歷細胞侵襲(F)和內皮募集(G)檢測。n=7~8。(H) 通過測量在DMSO或GW3965存在(1μM)24個小時下表達對照shRNA或 靶向LXRα或LXRβ的shRNA的MeWo細胞的螢光素酶報告基因活性而確定 融合到ME.1或ME.2增強子元件的ApoE啟動子的活性。n=3~8。(I)在從 響應于用GW3965或T0901317(1μM)處理72個小時的表達對照shRNA或 靶向LXRα或LXRβ的shRNA的人MeWo黑素瘤細胞收集的無血清的條件培 養基中,通過ELISA定量而評估細胞外的ApoE蛋白水平。n=3~8。全部的 數據表示為平均值±SEM。比例尺50μm。
圖29.LXR激動劑的治療性遞送上調了黑素瘤衍生的以及全身的ApoE 表達。(A-B)通過qRT-PCR定量的ApoE在通過注射到C57BL/6小鼠的 B16F10小鼠黑素瘤細胞形成的皮下腫瘤中的表達水平。在形成5mm3的腫 瘤后,飼喂小鼠對照飼料或含有GW3965(20mg/kg)(A)或T0901317(20 mg/kg)(B)的飼料7天,n=3~4。(C-E)通過移植到給于對照飼料或補充 GW3965(20mg/kg)的飼料的NOD Scid小鼠的MeWo人黑素瘤細胞形成的 原發性腫瘤(C)、肺轉移(D)和腦轉移(E)中的ApoE的轉錄表達。在注 射癌細胞后第35天(C)、153天(D)和34天(E)評價ApoE的水平。n=3~5。 (F)在表達對照發夾或靶向小鼠LXRα(sh_mLXRα)、小鼠LXRβ(sh_mLXRβ) 或小鼠ApoE(sh_mApoE)的shRNA的B16F10小鼠黑素瘤細胞中通過 qRT-PCR確定LXRα、LXRβ和ApoE的相對表達水平。(G-H)在表達對照 shRNA或靶向小鼠LXRβ或小鼠ApoE的shRNA的B16F10細胞中,通過 qRT-PCR測量的ApoE(G)和ABCA1(H)的mRNA水平。用5μM的DMSO 或GW3965處理細胞48個小時。n=3。(I)在從飼喂對照飼料或補充GW3965 的飼料(20mg/kg)10天的LXRα-/-或LXRβ-/-小鼠中提取的全身性白細胞中 通過qRT-PCR測量的ABCA1mRNA水平。n=3-4。(J)使用可從NCI資助的 癌癥基因組剖析計劃(Cancer Genome Anatomy Project,CGAP)獲得的公共 mSAGE表達矩陣數據庫(Expression Matrix database)測定表示為SAGE標簽 頻率的ApoE mRNA在小鼠皮膚和肺組織中的相對表達。(K)相對于對照的 未選擇的MeWo親本細胞的,通過qRT-PCR確定的ApoE mRNA在從肺轉移 性結節(LM2)或原發性腫瘤分離的MeWo黑素瘤細胞的相對表達。n=3。
圖30.LXRβ激動通過誘導黑素瘤衍生的以及全身的ApoE表達而抑制 黑素瘤腫瘤生長和轉移。(A)免疫印跡測量從喂養對照飼料或添加GW3965 (20mg/kg)或T0901317(20mg/kg)的飼料10天的野生型小鼠獲取的脂肪、 肺和腦組織裂解物中的ApoE蛋白水平。(B)基于(A)中所示的免疫印跡 量化ApoE蛋白的表達。總的微管蛋白用作用于標準化的內標。n=3~5。(C) 在來自喂養對照飼料或添加20mg/kg的GW3965或T0901317的飼料10天 的小鼠的全身白細胞中通過qRT-PCR確定的ApoE的表達水平。n=3~6。(D) 皮下注射B16F10對照細胞或表達靶向小鼠LXRα(sh_mLXRα)或小鼠LXRβ (sh_mLXRβ)的shRNA的B16F10細胞到C57BL/6-WT、LXRα-/-或LXRβ-/- 小鼠中。一旦腫瘤達到5~10mm3的體積,飼喂小鼠對照飼料或補充GW3965 (20mg/kg)的飼料7天,然后,測量最終的腫瘤體積。在右欄顯示在終點 提取的代表性的腫瘤圖像。n=6~18。(E)通過qRT-PCR量化的在從飼喂對 照飼料或補充GW3965(20mg/kg)的飼料10天的LXRα-/-或LXRβ-/-小鼠提 取的全身白細胞中的ApoE轉錄水平。n=3~5。(F)在C57BL/6-WT或ApoE-/-小鼠中5×104個B16F10對照細胞或表達靶向小鼠ApoE的shRNA (sh_mApoE)的B16F10細胞的皮下腫瘤生長。在形成測量到5~10mm3體 積的腫瘤后,飼喂小鼠對照飼料或補充GW3965(20mg/kg)的飼料7天, 并且量化最終的腫瘤體積。在右側顯示了在測量的最后一天(d12)提取的典 型的腫瘤圖像。n=8~18。(G)用對照shRNA或sh_mApoE轉化并靜脈注射 到C57BL/6-WT或ApoE-/-小鼠中的5×104個B16F10細胞的肺定植。在注射 癌細胞前10天開始,分配小鼠為對照飼料或補充GW3965(20mg/kg)的飼 料處理。在d22通過生物發光成像量化肺的轉移。在右側的欄顯示了在終點 (d22)提取的典型的肺。n=5~10。(H)從MSKCC患者獲得的非轉移性(n=39) 和轉移性(n=34)原發性黑素瘤皮膚病變樣本中,通過不知情的免疫組織化 學分析確定的ApoE蛋白表達。ApoE陽性著色的細胞面積的比例量化為總腫 瘤面積的百分比。(I)MSKCC群體(n=71)的Kaplan-Meier曲線,描述作 為患者的原發性黑素瘤病變中的ApoE蛋白表達的函數的患者的無轉移存 活。具有大于群體的中值的ApoE水平的黑素瘤分類為ApoE陽性(pos), 而具有小于中值的ApoE表達的腫瘤分類為ApoE陰性(neg)。全部的數據 表示為平均值±SEM。比例尺5mm(D和F),100μm(H)。
圖31.LXRβ活化抑制了耐達卡巴嗪和威羅菲尼的黑素瘤系的體內生長。 (A)響應于加到細胞培養基中的各種劑量的達卡巴嗪(DTIC)4天的2.5×104個B16F10親本細胞和體外衍生的B16F10耐DTIC細胞的體外細胞生長。 n=3。(B-D)5×104個DTIC敏感型B16F10親本細胞(B)或5×104個耐DTIC 的B16F10細胞(C)皮下注射到C57BL/6-WT小鼠中的腫瘤生長。在腫瘤生 長至5-10mm3的體積后,用達卡巴嗪(50mg/kg,每日腹腔內注射)或對照 載體處理小鼠,并隨機地指定常規的飼料或添加GW3965(100mg/kg)的飼 料。(D)中顯示了最后一天測量的腫瘤體積。n=8~16(B),7~8(C)。(E-F) 響應于DTIC或GW3965處理的DTIC敏感型MeWo親本細胞和體內衍生的 DTIC敏感型MeWo人黑素瘤細胞的腫瘤生長。皮下注射5×105個細胞到NOD  Scidγ小鼠。在測量體積為5~10mm3的腫瘤形成后,不知情地指定小鼠為 對照處理、DTIC處理(50mg/kg,以5天的循環,2天的治療間隔腹腔注射 每日施予)或補充GW3965的飲食處理(100mg/kg)。(F)中顯示了最后一 天測量的腫瘤。n=6~8。(G)在腫瘤生長到5~10mm3的體積后,皮下注射2×106個SK-Mel-239耐威羅菲尼克隆細胞到指定對照飲食或補充GW3965(100 mg/kg)的飲食的NOD Scidγ小鼠的腫瘤生長。n=7~8。(H)在移植2×106個SK-Mel-239耐威羅菲尼的細胞后小鼠總的存活率。在腫瘤生長至5~10 mm3的體積后,連續地飼喂小鼠對照飲食或補充GW3965(100mg/kg)的飲 食。n=7。(I)實驗衍生的模型描繪了系統性和黑素瘤自主ApoE通過LXRβ 活化治療而參與介導黑素瘤進展表型的抑制。細胞外的ApoE通過分別靶向 黑素瘤細胞LRP1和內皮細胞LRP8受體而協同抑制黑素瘤細胞侵襲和非細 胞自主性內皮募集,從而抑制黑素瘤轉移。全部的數據表示為平均值±SEM。 比例尺5mm。
圖32.達卡巴嗪誘導的對人黑素瘤細胞的腫瘤生長的抑制。(A)皮下注 射5×105個DTIC敏感型MeWo親代細胞到Nod SCIDγ小鼠的腫瘤生長。當 腫瘤達到5~10mm3的體積時,用對照載體或DTIC(50mg/kg,以5天的循 環,2天的治療間隔腹腔注射每日施予)處理小鼠,并且每周測量兩次腫瘤 的體積。n=6。
圖33.ApoE介導的對多種癌癥類型的細胞侵襲的抑制。檢測(A-B)5×104個MUM2B和OCM1人眼色素層黑素瘤細胞、(C-E)5×104個MDA-231、 MDA-468和BT 549人三陰性乳腺癌細胞、(F-G)5×104個PANC1和BXPC-3 人胰腺癌細胞和(H-I)5×104個786-00和RCC4人腎癌細胞在體外穿過涂布 基質膠的穿孔插入物侵襲的能力。在檢測的開始以100μg/mL將BSA或重組 ApoE加到細胞培養基中。n=4。全部的數據表示為平均值±SEM;*p<0.05, **p<0.01,***p<0.001。
圖34.LXR激動劑LXR-623、WO-2007-002563的實施例19、 WO-2010-0138598的實施例9和SB742881對人黑素瘤細胞中ApoE表達的 影響。(A-D)以500nM、1μM或2μM的DMSO或LXR激動劑LXR-623 (A)、WO-2007-002563(B)、WO-2010-0138598(C)或SB742881(D)處 理MeWo人黑素瘤細胞48個小時。然后,通過qRT-PCR定量ApoE的表達 水平。n=3。全部的數據表示為平均值±SEM。*p<0.05,**p<0.01。
圖35.用LXR激動劑GW3965進行的處理體外抑制腎癌、胰腺癌和肺 癌的腫瘤細胞侵襲。(A-C)在檢測前用1μM的DMSO或GW3965處理72 個小時的5×104個RCC人腎癌細胞(A)、5×104個PANC1人胰腺癌細胞(B) 和5×104個H460人肺癌細胞(C)的穿孔基質膠侵襲。n=4。全部的數據表 示為平均值±SEM。*p<0.05,**p<0.01。
圖36.用LXR激動劑GW3965進行的處理抑制了體內的乳腺癌腫瘤生 長。注射入NOD Scidγ小鼠的乳腺脂肪墊的2×106個MDA-468人乳腺癌 細胞的原發性腫瘤生長。在注射癌細胞兩天前,指定小鼠為對照飲食處理或 補充GW3965(75mg/kg)的飲食,并在整個實驗期間保持相應的飲食。n=8。 全部的數據表示為平均值±SEM。***p<0.001。
圖37.LXR激動劑LXR-623、WO-2007-002563的實施例19、 WO-2010-0138598的實施例9和SB742881對體外黑素瘤進展表型的影響。 (A)用以每種均為1μM的DMSO、LXR-623、WO-2007-002563的實施例 19、WO-2010-0138598的實施例9或SB742881預處理72個小時的1×105個MeWo人黑素瘤細胞的細胞侵襲。定量侵襲到涂布基質膠的穿孔插入物 (trans-well insert)基側的細胞的數目,n=5。(B)以每種均為1μM的DMSO、 LXR-623、WO-2007-002563實施例19、WO-2010-0138598實施例9或 SB742881預處理72個小時的5×104個MeWo細胞的內皮募集。癌細胞接種 在24孔板的底部。內皮細胞接種在置于每個孔中的穿孔插入物,并讓其遷移 到癌細胞。量化遷移到每個穿孔插入物基側的內皮細胞的數目。全部的數據 表示為平均值±SEM。*p<0.05,**p<0.01。
圖38.LXR激動劑LXR-623、WO-2007-002563的實施例19、 WO-2010-0138598的實施例9和SB742881對體內腫瘤生長的影響。(A-D) 皮下注射到7周年齡的C57BL/6小鼠中的5×104個B16F10小鼠黑素瘤細胞 的腫瘤生長。在腫瘤達到5~10mm3的體積后,隨機地指定小鼠為對照飲食 處理、以20mg/kg/天的補充LXR-623的飲食處理(A)、以100mg/kg/天的 補充WO-2007-002563實施例19的飲食處理(B)、以10mg/kg/天或100mg/kg/ 天的補充WO-2010-0138598實施例19的飲食處理(C)或者以100mg/kg/ 天的補充SB742881的飲食處理(D)。n=8~10。全部的數據表示為平均值± SEM。
具體實施方式
本發明的特征為防止或減緩細胞的異常增殖、分化或存活的方法。例如, 本發明的化合物可用于降低腫瘤增加大小或達到轉移狀態的風險,或防止腫 瘤增加大小或達到轉移的態。可施予主題的化合物,以終止癌癥的進展或推 進。此外,本發明包括主題化合物降低癌癥復發的風險或防止癌癥復發的用 途。
轉移進展需要參與共同的細胞表型的多組效應蛋白的一致表達(Gupta  and Massagué,2006 Cell 127,679-695;Hanahan and Weinberg,2011 Cell 144, 646-674;Talmadge and Fidler,2010 Cancer Res.70,5649-5669;Hynes,2003 Cell 113,821-823)。這樣的協同表達狀態在轉移的原發性乳腺癌的基因表達 譜(Wang et al.,2005Lancet 365,671-679)、以及顯示增強的轉移活性的人癌 細胞克隆譜中是明顯的(Kang et al.,2003 Cancer Cell 3,537-549;Minn et al., 2005Nature 436,518-524)。近年來,轉錄后調控已經成為協調的表達狀態和 表型水平控制的普遍的和穩健的(robust)模型。具有轉移調節活性的轉錄后 調節因子的大部分的研究類別為小的非編碼RNA(miRNA)(Bartel,2009 Cell 136,215-233;Fabian et al.,2010Annu.Rev.Biochem,79,351-379;Filipowicz et  al.,2008 Nat.Rev.Genet.9,102-114)。最初在乳腺癌中發現了轉移促進 miRNA(Ma et al.,2007Nature 449,682-688;Huang et al.,2008Nat.Cell Biol. 10,202-210)和轉移抑制miRNA(Tavazoie et al.,2008Nature 451,147-152)。 隨后的研究揭示更多的miRNA在其它癌癥類型的腫瘤發生和轉移具有調節 功能(Hatziapostolou et al.,2011 Cell 147,1233-1247;Hurst et al.,2009Cancer  Res.69,7495-7498;Olson et al.,2009 Genes Dev.23,2152-2165;Zhang et al., 2010 Oncogene 29,937-948)。在許多情況下,這些miRNA在人癌癥樣本中 的表達水平支持它們在轉移中的實驗功能。因此,解除對miRNA表達(Garzon  et al.,2010Nat.Rev.Drug Discov.9,775-789;Lujambio and Lowe,2012Nature  482,347-355)的調控、以及最近解除對長的非編碼RNA表達的調控(Calin  et al.,2007 Nat.Rev.Cancer 6,857-866;Gupta et al.,2010 Nature 464, 1071-1076;Guttman et al.,2009Nature 458,223-227;Huarte et al.,2010.Cell 142,409-419;Loewer et al.,2010Nat.Genet.42,1113-1117)以及非編碼假基因 競爭內源miRNA的結合(Poliseno et al.,2010Nature 465,1033-1038)看來是 人癌癥的普遍特征。關于特定miRNA對轉移進展展現的穩健控制的線索來 自早期工作,其顯示了單個轉移抑制miRNA對多個轉移基因的協同靶向是 顯著的轉移抑制效果的原因(Tavazoie et al.,2008Nature 451,147-152)。 miRNA這樣的發散的基因靶(divergeng)向顯示為這些調節子的典型特征。
在概念水平,易于理解對癌癥中基因表達的發散調控的需要。miRNA可 憑借其靶向轉移需要的多個基因的能力而發揮穩健的轉移性抑制。通過遺傳 或表觀遺傳機制的miRNA沉默可通過抑制多個轉移的啟動子而容易地促進 癌癥的進展(Png et al.,2011Nature 481,190~194)。多個轉移調控miRNA對 單個基因的會聚調控功能更微妙。如果存在作用為轉移進展的穩健抑制子的 關鍵基因,那么將產生該現象。多個miRNA對該基因的會聚的及協同的靶 定將獲得這樣的關鍵的轉移抑制基因的最大沉默。例如,與基因缺失相反, 可在其中細胞不能耐受靶基因的完全缺失的情況下看到該情節,并且例如, 可能需要基因在低的水平來調節代謝活性。考慮到這個可能性,尋找新的協 同的轉移促進miRNA可發現對于轉移抑制關鍵的新基因,并可提供用于預 防轉移的更有效治療的治療領悟(Insight)。
如文中所公開的,通過系統的基于體內選擇的方法,鑒定了一組在多個 衍生自多個黑素瘤(具有增加的發病率的高度流行的癌癥)患者的獨立的轉 移系中去調控的miRNA(Garbe and Leiter,2009 Clin.Dermatol.27,3-9)。如 文中公開的,miR-1908、miR-199a-3p和miR-199a-5p通過對轉移基因ApoE 和熱激蛋白DNAJA4的會聚性靶定而作用為黑素瘤轉移的穩健的(robust) 內源啟動子。通過功能損失、功能獲得以及上位分析,描述了使ApoE信號 最大沉默的協同的miRNA網絡。癌細胞分泌的ApoE抑制了轉化入侵和內皮 募集,其通過對黑素瘤和內皮細胞的不同的受體的作用而被介導。這些 miRNA顯示了識別發展黑素瘤轉移復發的患者的顯著預后的能力,而靶定這 些miRNA的LNA的治療性輸送顯著地抑制黑素瘤轉移。目前缺乏在手術切 除后預防黑素瘤轉移的有效治療(Garbe et al.,2011Oncologist 16,5-24),因 此需要對黑素瘤轉移進程的改善的分子和機制的理解。為此,文中公開的發 現揭示了數個參與黑素瘤進展的新的關鍵的非編碼的和編碼的基因,并為識 別對黑素瘤轉移高風險的患者并治療它們提供了新的途徑。
下面列出了上述網絡的成員和大量其它序列的核酸和氨基酸序列。
APOE–RNA序列(SEQ ID NO:1)
gggatccttgagtcctactcagccccagcggaggtgaaggacgtccttccccaggagccgactggccaatc acaggcaggaagatgaaggttctgtgggctgcgttgctggtcacattcctggcaggatgccaggccaaggtggagc aagcggtggagacagagccggagcccgagctgcgccagcagaccgagtggcagagcggccagcgctgggaac tggcactgggtcgcttttgggattacctgcgctgggtgcagacactgtctgagcaggtgcaggaggagctgctcagc tcccaggtcacccaggaactgagggcgctgatggacgagaccatgaaggagttgaaggcctacaaatcggaactg gaggaacaactgaccccggtggcggaggagacgcgggcacggctgtccaaggagctgcaggcggcgcaggcc cggctgggcgcggacatggaggacgtgtgcggccgcctggtgcagtaccgcggcgaggtgcaggccatgctcg gccagagcaccgaggagctgcgggtgcgcctcgcctcccacctgcgcaagctgcgtaagcggctcctccgcgat gccgatgacctgcagaagcgcctggcagtgtaccaggccggggcccgcgagggcgccgagcgcggcctcagc gccatccgcgagcgcctggggcccctggtggaacagggccgcgtgcgggccgccactgtgggctccctggccg gccagccgctacaggagcgggcccaggcctggggcgagcggctgcgcgcgcggatggaggagatgggcagc cggacccgcgaccgcctggacgaggtgaaggagcaggtggcggaggtgcgcgccaagctggaggagcaggcc cagcagatacgcctgcaggccgaggccttccaggcccgcctcaagagctggttcgagcccctggtggaagacatg cagcgccagtgggccgggctggtggagaaggtgcaggctgccgtgggcaccagcgccgcccctgtgcccagcg acaatcactgaacgccgaagcctgcagccatgcgaccccacgccaccccgtgcctcctgcctccgcgcagcctgc agcgggagaccctgtccccgccccagccgtcctcctggggtggaccctagtttaataaagattcaccaagtttcacg caaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaa
APOE–氨基酸序列(SEQ ID NO:2)
mkvlwaallv tflagcqakv eqavetepep elrqqtewqs gqrwelalgr fwdylrwvqt  lseqvqeell ssqvtqelra lmdetmkelk aykseleeql tpvaeetrar lskelqaaqa rlgadmedvc  grlvqyrgev qamlgqstee lrvrlashlr klrkrllrda ddlqkrlavy qagaregaer glsairerlg  plveqgrvra atvgslagqp lqeraqawge rlrarmeemg srtrdrldev keqvaevrak leeqaqqirl  qaeafqarlk swfeplvedm qrqwaglvek vqaavgtsaa pvpsdnh
(下劃線的殘基136~150表示Apo E的LRP結合結構域)
DNAJA4同種型1–RNA序列(SEQ ID NO:3)
agucccacccuucggcgcagggcuccggccaacacagcccuccaggccgccuacucuccagccagc cggcuccacggacccacggaagggcaagggggcggccucggggcggcgggacaguugucggagggcgcc cuccaggcccaagccgccuucuccggcccccgccauggcccggggcggcagucagagcuggagcuccggg gaaucagacgggcagccaaaggagcagacgcccgagaagcccagacacaagauggugaaggagacccagu acuaugacauccugggcgugaagcccagcgcguccccggaggagaucaagaaggccuaucggaagcuggc gcucaaguaccacccggacaagaacccggaugagggcgagaaguuuaaacucauaucccaggcauaugaa gugcuuucagauccaaagaaaagggauguuuaugaccaaggcggagagcaggcaauuaaagaaggaggc ucaggcagccccagcuucucuucacccauggacaucuuugacauguucuuugguggugguggacggaug gcuagagagagaagaggcaagaauguuguacaccaguuaucuguaacucuugaagaucuauauaaugga gucacgaagaaauuggcccuccagaaaaauguaauuugugagaaaugugaagguguuggugggaagaag ggaucgguggagaagugcccgcugugcaaggggcgggggaugcagauccacauccagcagaucgggccg ggcaugguacagcagauccagaccgugugcaucgagugcaagggccagggugagcgcaucaaccccaagg accgcugcgagagcugcagcggggccaaggugauccgugagaagaagauuaucgagguacauguugaaa aagguaugaaagaugggcaaaagauacuauuucauggagaaggagaucaggagccugagcuggagccug gugaugucauaauugugcuugaucagaaggaucauagugucuuucagagacgaggccaugacuugauca ugaaaaugaaaauucagcuuucugaagcucuuuguggcuucaagaagacgauaaaaacauuggacaaucg aauucuuguuauuacauccaaagcaggugaggugauaaagcacggggaccugagaugcgugcgcgauga aggaaugcccaucuacaaagcaccccuggaaaaagggauucugaucauacaguuuuuaguaaucuuuccu gaaaaacacuggcuuucucuggaaaagcuuccucagcuggaagcuuuacucccuccucgacagaaaguga ggauuacagaugacauggaucagguggagcugaaggaguuuugucccaaugagcagaacuggcgucagc acagggaggccuacgaggaggacgaagacgggccccaggcuggagugcagugccagacggcaugacgug gugcggggcagcguggccccaccggacuagcacaugaugaauguaaaguuggcacaaugaaaaugacauc gcuuuaauggccuuguguuugggauguccuguguauguguucagcauucuuaauugcugagugucuuu uuggcuuuucuuuugguuguaacuuaaguuauagcuuaauuuauauuuaaauguuuuaaguauaaauc accucuagucugcauauggaaucuguucauuucuauuuucaggauauacuuuugagaugucagugauug caccaauacuuugugcuucuaguggcuuugccauaauucagugucaccaauaaggcacagcccaguuagc agcuuagccccccuagcaaaccccaaggcacaaagugggcauccugacucaucucuaggucugugguuuc uccccucuucccuuggcagaguuauugagggcaugaucucagggcugcuaagauaacauuucugaggau ucuagaugauccucuuaaagaauaaaagcacauccguggaucggacauggcugcaugugccugcuuaaca gggccaacuuaguuccuacuguucugugcccuucaguggauggaacgugagugucugaucaucucucuu ggaaguuuucugaaccuuccaagcucuguggugaggacaaaccaguguuugaaucauaugcugauaacu guuugccugugacccucacaccuuguucuucaggguuuuaaugauuuucuguugacaacuuuugcaaug cuuucccaccaaagugcuuacuuguaaagaaaacuaaauccuucuguguccccggcagccucagugcagc aacagaagccaagggagaaugcugcugguuuggcccauggcacagccagcuucucugaccaguaauccgg ggugacuugagggucugcaaaggcauagaacuccccaguguuuuccaccucauucucccagauugagcu cccuuccaaaggaucguuccucucauugcacagccauauuacaaaggguuuccugcucaagugauguuu ugguaagaacuucgcugaguuccacuguggauuacaguuuguauggacuacuacuguaaauuauagcuu guuuggagggauauuagucauuauuuuauucaugacagguagacuacaauucgaacuuaggguuaccuc agucuuuagccauuacugcuuauuucuuuuccccaagucacaaaaaacuuguaagcugcuggguuaaag cagaggccaccugucagaucuacccuacccuuauuugguuacauggcaccugagaguuucacucagacca gggaucuuccuuaggagggucaaagugcagaucagaccaugcagguaaggugaaccagcugcacggacca gguucccgcaaaacauugccagcuagugaggcauaauuugcucaaaguauagaaacagcccaccugugcc cacuuugaccauuggugaggauagauauaaaaucacuucuuccaacgaagccuaggugaaaaucuauuua uaaauggaccacaacucuggggugucguuuuugugcugugacuuccuaauuauugcuaaagaacuacug uuuaguugguaaugguguaaaauuacauucagcuccuucuugucauauaaaaggaauuuggaggguguc gcuuaaaauuuuauuccaccuguacauuugucacuuuaaaauuaaaauugagcugguaugagagauaaa aaaaaaaaaaaaaaaa
DNAJA4同種型1–氨基酸序列(SEQ ID NO:4)
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DNAJA4同種型2–RNA序列(SEQ ID NO:5)
gugaccgugacgcgcgagcgggcggcgggggcgcgggccaggggcgcgggccagggugccggca ggggcguccggggcgcucugaccggccucgcccgccccccccgcagacacaagauggugaaggagaccca guacuaugacauccugggcgugaagcccagcgcguccccggaggagaucaagaaggccuaucggaagcug gcgcucaaguaccacccggacaagaacccggaugagggcgagaaguuuaaacucauaucccaggcauaug aagugcuuucagauccaaagaaaagggauguuuaugaccaaggcggagagcaggcaauuaaagaaggagg cucaggcagccccagcuucucuucacccauggacaucuuugacauguucuuugguggugguggacggau ggcuagagagagaagaggcaagaauguuguacaccaguuaucuguaacucuugaagaucuauauaaugg agucacgaagaaauuggcccuccagaaaaauguaauuugugagaaaugugaagguguuggugggaagaa gggaucgguggagaagugcccgcugugcaaggggcgggggaugcagauccacauccagcagaucgggcc gggcaugguacagcagauccagaccgugugcaucgagugcaagggccagggugagcgcaucaaccccaag gaccgcugcgagagcugcagcggggccaaggugauccgugagaagaagauuaucgagguacauguugaa aaagguaugaaagaugggcaaaagauacuauuucauggagaaggagaucaggagccugagcuggagccu ggugaugucauaauugugcuugaucagaaggaucauagugucuuucagagacgaggccaugacuugauc augaaaaugaaaauucagcuuucugaagcucuuuguggcuucaagaagacgauaaaaacauuggacaauc gaauucuuguuauuacauccaaagcaggugaggugauaaagcacggggaccugagaugcgugcgcgaug aaggaaugcccaucuacaaagcaccccuggaaaaagggauucugaucauacaguuuuuaguaaucuuucc ugaaaaacacuggcuuucucuggaaaagcuuccucagcuggaagcuuuacucccuccucgacagaaagug aggauuacagaugacauggaucagguggagcugaaggaguuuugucccaaugagcagaacuggcgucag cacagggaggccuacgaggaggacgaagacgggccccaggcuggagugcagugccagacggcaugacgu ggugcggggcagcguggccccaccggacuagcacaugaugaauguaaaguuggcacaaugaaaaugacau cgcuuuaauggccuuguguuugggauguccuguguauguguucagcauucuuaauugcugagugucuu uuuggcuuuucuuuugguuguaacuuaaguuauagcuuaauuuauauuuaaauguuuuaaguauaaau caccucuagucugcauauggaaucuguucauuucuauuuucaggauauacuuuugagaugucagugauu gcaccaauacuuugugcuucuaguggcuuugccauaauucagugucaccaauaaggcacagcccaguuag cagcuuagccccccuagcaaaccccaaggcacaaagugggcauccugacucaucucuaggucugugguuu cuccccucuucccuuggcagaguuauugagggcaugaucucagggcugcuaagauaacauuucugagga uucuagaugauccucuuaaagaauaaaagcacauccguggaucggacauggcugcaugugccugcuuaac agggccaacuuaguuccuacuguucugugcccuucaguggauggaacgugagugucugaucaucucucu uggaaguuuucugaaccuuccaagcucuguggugaggacaaaccaguguuugaaucauaugcugauaac uguuugccugugacccucacaccuuguucuucaggguuuuaaugauuuucuguugacaacuuuugcaau gcuuucccaccaaagugcuuacuuguaaagaaaacuaaauccuucuguguccccggcagccucagugcag caacagaagccaagggagaaugcugcugguuuggcccauggcacagccagcuucucugaccaguaauccg gggugacuugagggucugcaaaggcauagaacuccccaguguuuuccaccucauucucccagauugagc ucccuuccaaaggaucguuccucucauugcacagccauauuacaaaggguuuccugcucaagugauguu uugguaagaacuucgcugaguuccacuguggauuacaguuuguauggacuacuacuguaaauuauagcu uguuuggagggauauuagucauuauuuuauucaugacagguagacuacaauucgaacuuaggguuaccu cagucuuuagccauuacugcuuauuucuuuuccccaagucacaaaaaacuuguaagcugcuggguuaaa gcagaggccaccugucagaucuacccuacccuuauuugguuacauggcaccugagaguuucacucagacc agggaucuuccuuaggagggucaaagugcagaucagaccaugcagguaaggugaaccagcugcacggacc agguucccgcaaaacauugccagcuagugaggcauaauuugcucaaaguauagaaacagcccaccugugc ccacuuugaccauuggugaggauagauauaaaaucacuucuuccaacgaagccuaggugaaaaucuauuu auaaauggaccacaacucuggggugucguuuuugugcugugacuuccuaauuauugcuaaagaacuacu guuuaguugguaaugguguaaaauuacauucagcuccuucuugucauauaaaaggaauuuggagggug ucgcuuaaaauuuuauuccaccuguacauuugucacuuuaaaauuaaaauugagcugguaugagagaua aaaaaaaaaaaaaaaaaa
DNAJA4同種型2–氨基酸序列(SEQ ID NO:6)
mvketqyydi lgvkpsaspe eikkayrkla lkyhpdknpd egekfklisq ayevlsdpkk  rdvydqggeq aikeggsgsp sfsspmdifd mffggggrma rerrgknvvh qlsvtledly ngvtkklalq  knvicekceg vggkkgsvek cplckgrgmq ihiqqigpgm vqqiqtvcie ckgqgerinp  kdrcescsga kvirekkiie vhvekgmkdg qkilfhgegd qepelepgdv iivldqkdhs vfqrrghdli  mkmkiqlsea lcgfkktikt ldnrilvits kagevikhgd lrcvrdegmp iykaplekgi liiqflvifp  ekhwlslekl pqleallppr qkvritddmd qvelkefcpn eqnwrqhrea yeededgpqa gvqcqta
DNAJA4同種型3–RNA序列(SEQ ID NO:7)
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ugaacagcaaaaugaugccugagugccagugcccaccccacaugacagggccccggugugaggagcacgu cuucagccagcagcagccaggacauauagccuccauccuaaucccucugcuguugcugcugcugcugguu cugguggccggagugguauucugguauaagcggcgaguccaaggggcuaagggcuuccagcaccaacgg augaccaacggggccaugaacguggagauuggaaaccccaccuacaagauguacgaaggcggagagccug augaugugggaggccuacuggacgcugacuuugcccuggacccugacaagcccaccaacuucaccaaccc cguguaugccacacucuacauggggggccauggcagucgccacucccuggccagcacggacgagaagcga gaacuccugggccggggcccugaggacgagauaggggaccccuuggcauagggcccugccccgucggac ugcccccagaaagccuccugcccccugccggugaaguccuucagugagccccuccccagccagcccuuccc uggccccgccggauguauaaauguaaaaaugaaggaauuacauuuuauaugugagcgagcaagccggcaa gcgagcacaguauuauuucuccauccccucccugccugcuccuuggcacccccaugcugccuucagggag acaggcagggagggcuuggggcugcaccuccuacccucccaccagaacgcaccccacugggagagcuggu ggugcagccuuccccucccuguauaagacacuuugccaaggcucuccccucucgccccaucccugcuugc ccgcucccacagcuuccugagggcuaauucugggaagggagaguucuuugcugccccugucuggaagac guggcucugggugagguaggcgggaaaggauggaguguuuuaguucuugggggaggccaccccaaacc ccagccccaacuccaggggcaccuaugagauggccaugcucaaccccccucccagacaggcccucccuguc uccagggcccccaccgagguucccagggcuggagacuuccucugguaaacauuccuccagccuccccucc ccuggggacgccaaggaggugggccacacccaggaagggaaagcgggcagccccguuuuggggacguga acguuuuaauaauuuuugcugaauuccuuuacaacuaaauaacacagauauuguuauaaauaaaauugua aaaaaaaaaaaaaaaaaa
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LRP8同種型1–RNA序列(SEQ ID NO:11)
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gggcucaacgguguggaccggcaaacacuggugucagacaauauugaauggcccaacggaaucacccugg aucugcugagccagcgcuuguacuggguagacuccaagcuacaccaacuguccagcauugacuucagugg aggcaacagaaagacgcugaucuccuccacugacuuccugagccacccuuuugggauagcuguguuuga ggacaagguguucuggacagaccuggagaacgaggccauuuucagugcaaaucggcucaauggccugga aaucuccauccuggcugagaaccucaacaacccacaugacauugucaucuuccaugagcugaagcagccaa gagcuccagaugccugugagcugaguguccagccuaauggaggcugugaauaccugugccuuccugcuc cucagaucuccagccacucucccaaguacacaugugccuguccugacacaauguggcuggguccagacau gaagaggugcuaccgagcaccucaaucuaccucaacuacgacguuagcuucuaccaugacgaggacagua ccugccaccacaagagcccccgggaccaccguccacagauccaccuaccagaaccacagcacagagacacca agccugacagcugcagucccaagcucaguuaguguccccagggcucccagcaucagcccgucuacccuaa gcccugcaaccagcaaccacucccagcacuaugcaaaugaagacaguaagaugggcucaacagucacugcc gcuguuaucgggaucaucgugcccauaguggugauagcccuccugugcaugaguggauaccugaucugg agaaacuggaagcggaagaacaccaaaagcaugaauuuugacaacccagucuacaggaaaacaacagaaga agaagacgaagaugagcuccauauagggagaacugcucagauuggccaugucuauccugcagcaaucagc 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LRP8同種型2–RNA序列(SEQ ID NO:13)
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LRP8同種型4–RNA序列(SEQ ID NO:17)
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cucugcggccguccgggccccggggccacguccgcgcccgccgccugcgccaccgccucccaguucgccu gccgcagcggcgagugcgugcaccugggcuggcgcugcgacggcgaccgcgacugcaaagacaaaucgga cgaggccgacugcccacugggcaccugccguggggacgaguuccaguguggggaugggacauguguccu ugcaaucaagcacugcaaccaggagcaggacuguccagaugggagugaugaagcuggcugccuacaggg gcugaacgagugucugcacaacaauggcggcugcucacacaucugcacugaccucaagauuggcuuugaa ugcacgugcccagcaggcuuccagcuccuggaccagaagaccuguggcgacauugaugagugcaaggacc cagaugccugcagccagaucugugucaauuacaagggcuauuuuaagugugagugcuacccuggcuacg agauggaccuacugaccaagaacugcaaggcugcugcuggcaagagcccaucccuaaucuucaccaaccg gcacgaggugcggaggaucgaccuggugaagcggaacuauucacgccucauccccaugcucaagaauguc guggcacuagauguggaaguugccaccaaucgcaucuacuggugugaccucuccuaccguaagaucuau agcgccuacauggacaaggccagugacccgaaagagcaggagguccucauugacgagcaguugcacucuc cagagggccuggcaguggacuggguccacaagcacaucuacuggacugacucgggcaauaagaccaucuc aguggccacaguugaugguggccgccgacgcacucucuucagccguaaccucagugaaccccgggccauc gcuguugacccccugcgaggguucauguauuggucugacuggggggaccaggccaagauugagaaaucu gggcucaacgguguggaccggcaaacacuggugucagacaauauugaauggcccaacggaaucacccugg aucugcugagccagcgcuuguacuggguagacuccaagcuacaccaacuguccagcauugacuucagugg aggcaacagaaagacgcugaucuccuccacugacuuccugagccacccuuuugggauagcuguguuuga ggacaagguguucuggacagaccuggagaacgaggccauuuucagugcaaaucggcucaauggccugga aaucuccauccuggcugagaaccucaacaacccacaugacauugucaucuuccaugagcugaagcagccaa gagcuccagaugccugugagcugaguguccagccuaauggaggcugugaauaccugugccuuccugcuc cucagaucuccagccacucucccaaguacacaugugccuguccugacacaauguggcuggguccagacau gaagaggugcuaccgagcaccucaaucuaccucaacuacgacguuagcuucuaccaugacgaggacagua ccugccaccacaagagcccccgggaccaccguccacagauccaccuaccagaaccacagcacagagacacca agccugacagcugcagucccaagcucaguuaguguccccagggcucccagcaucagcccgucuacccuaa gcccugcaaccagcaaccacucccagcacuaugcaaaugaagacaguaagaugggcucaacagucacugcc gcuguuaucgggaucaucgugcccauaguggugauagcccuccugugcaugaguggauaccugaucugg agaaacuggaagcggaagaacaccaaaagcaugaauuuugacaacccagucuacaggaaaacaacagaaga agaagacgaagaugagcuccauauagggagaacugcucagauuggccaugucuauccugcacgaguggca uuaagccuugaagaugauggacuacccugaggaugggaucacccccuucgugccucauggaauucaguc ccaugcacuacacucuggaugguguaugacuggaugaauggguuucuauauaugggucugugugagug uaugugugugugugauuuuuuuuuuaaauuuauguugcggaaagguaaccacaaaguuaugaugaacu gcaaacauccaaaggaugugagaguuuuucuauguauaauguuuuauacacuuuuuaacugguugcacu acccaugaggaauucguggaauggcuacugcugacuaacaugaugcacauaaccaaaugggggccaaugg cacaguaccuuacucaucauuuaaaaacuauauuuacagaagauguuugguugcugggggggcuuuuuu agguuuuggggcauuuguuuuuuguaaauaagaugauuaugcuuuguggcuauccaucaacauaagua aaaaaaaaaaaaaaacacuucaacucccucccccauuuagauuauuuauuaacauauuuuaaaaaucagau gaguucuauaaauaauuuagagaagugagaguauuuauuuuuggcauguuuggcccaccacacagacuc uguguguguauguguguguuuauauguguaugugugugacagaaaaaucuguagagaagaggcacauc uauggcuacuguucaaauacauaaagauaaauuuauuuucacacaguccacaagggguauaucuuguag uuuucagaaaagccuuuggaaaucuggaucagaaaauagauaccaugguuugugcaauuauguaguaaa aaaggcaaaucuuuucaccucuggcuauuccugagaccccaggaagucaggaaaagccuuucagcucacc cauggcugcugugacuccuaccagggcuuucuuggcuuuggcgaaggucaguguacagacauuccaugg uaccagagugcucagaaacucaagauaggauaugccucacccucagcuacuccuuguuuuaaaguucagc ucuuugaguaacuucuucaauuucuuucaggacacuuggguugaauucaguaaguuuccucugaagcac ccugaagggugccauccuuacagagcuaaguggagacguuuccagaucagcccaaguuuacuauagagac uggcccaggcacugaaugucuaggacaugcuguggaugaagauaaagaugguggaauagguuuuaucac aucucuuauuucucuuuuccccuuacucucuaccauuuccuuuauguggggaaacauuuuaagguaaua aauagguuacuuaccaucauauguucauauagaugaaacuaauuuuuggcuuaagucagaacaacuggcc aaaauugaagucauauuugaggggggaaauggcauacgcaauauuauauuauauuggauauuuauguuc acacaggaauuugguuuacugcuuuguaaauaaaaggaaaaacuccggguauauguauagauguucuuc auuauagacaucuucuuugcuuuucuuggccuugggggaggaagggagaagugcucuuuucuacuugu ggggucucccauuggaaacauaauccuauagucccagaaggauucaguccccaguggcuuucccauccaa agagaaagaguuugaguuucuuaacucugcuguucugccacuuacucccacuagacaaccagggacaagg ugcaacauggaaguguuugacuuaaguaggagcagaggagcugcaucuaaucucaucauaccuggaacu ugacacacuuaagcaaaugccuucccaucccuaccugccagaugcccccaacucaaugaaguuggauguc ucaccagcuugauacccuuugaauuuucagucagacauucuggaguucuagcauccuguaccuaggacc uuccucugugucacucuuggccuccuaaacucuaagaaaauaacuauauucuggagcuugggcagugug uuuugcauaauccagcaaucuccucaugacaugcauguguugauaguccugaaacauucauugagaggg uaaaugcaguugaccuagaaugaccaauaccaaacagaauuuuaagaacagguggccaacuccuauggag cuuacucacauauuacuauucuuuuaagaacggaaaguaaaauuauuuuugacugaagaaaaaugaugac agugaaaaacauggaaauguacucaaaacaagugacuuuuucuguaaccuuccaaagaaacugaauuuuc caaggaauuaaaugauaacaguggcuaaggcauaguuucuaaacuuucaguaagauccuggcauucacag aaaaaaaugaugaauggggucuggacauacagccugagaucucaaaaugacaaugaaauucacaacuuuu ucucagagacauucauguuuccugcauaugcuacaacugcaguuugaaagaggcagcaaugggagcaacc cuuuacaagaaacaaauugugauauauucauguguuggacggcaguaaauaagaugaaaccugaggagu cagauccaccuucccccauucauagaggcuuuucagccucauuuugagguacaguuacauaucuuuugcc uuuugcccccgugcauagcuaucuacagccaaucacagaucacagagucacuggacuauagagcuggaag gaagcucagagacaaugccaagggggcagaaaauuuaucagaagccagucccagugcguuuccuccauuu ccuucugcaggaagacuauuuugggcugccugaacauuguaucaaaccugcuaccuauacuauggucua ccuuuccuccaguggaauuacaaaggcacuaacugaaaugccuucuagaaacagagaaaacgaaacugua cuuauuuacucuugauacacagauuauuuauaaaacagauugaaguaaccuguuaacuggcaaaaagaga augagaucggauuuaaauguauggcaguaaguccuauugaucccuccaguuaucucaguaugacugcag uauauucauucacuaaaaccacucacuagauaccaacuacacaccuggcacugcagauguaaaggucaguc acacauguucugacuuuacagaguucacaguagcaguggaggaugauauauguggaaacaaaaaaggcau ugauucuauucagagcacuguuagggcucaaaggagagaggggucuuuccaccuaagaaaugaggaaua gggucaucauagaagugaccuuaagucuuaaaaauuaagaaggggauuccaagcugcuucagacagagac acaucgagcuaaaacacagagguaugaaagagcacagggacuuuaggaauugcacaguucauucuaacag gaacaaaaggcucaaggggggcaagaaaugaggcuguauggaaagagauucaauguaagcacuuuauaaa auagauuaauuucugauucaaugaagcauuucuugaucauuguguacaaggcacuacaugcaucaugga aaauucauuaggaugcauugccagcacuuugcagaacugauauuauucagccucaagcuuuccaguggcc aaagggaaaugcugacugcuuuucauauauuugagucaaagauuuuuuauauggucaaugaagacuaau auaagggcagugggauuuucacagaugcaugccauguugucgagagccucuuagauuuucucaacugug agaaagaaaaacgaaaauguugaagacguugagucuggagaggggauacuaaucacuguccaguugggc acuggugggaauggggaaauggcacaggaaugcaagccucuccacccuaccccccgaacuccagccauac acucaucguuucacaaaauauaaaugaguuagcauuaaauguuucagaguaaauaauuccuuuucccgaa augcaugaagauagaguaacagacuucucacacuguauuuuuaggguauggagaauuuagaagguuaaa gaauuacugcuucaauuuuucaguuaaaaaaaaaucaggaagcucuguucauucaggcuaugcaccaugu gcacagucaagaauuagcagaaacccucugcauuuacaaacacuuugugcuauaaaaaaguaauuuuuaa aaagccacguguguguguguguauauauauauauauauauauauuuaaagccaagguuuugauacuuuu uuacaaaaacuacaagagaaaacaaauauaccuguccaaaccauauacuuuuaaaagagcauuuuuuuuu ccauacaagcuguuguuaauuuggggguaaagugcugauuugcaaacuucaucaaauuguucccaagug gauucuccuuguuugucucccccuaccaaccccaaaguuaccauauuugauguaagaaucaggcauguua gaauguugugucacacuaacugauucugcucuuuuugucuugucauucaaguuccguuagcuucuguac gcggugcccuuugcagucuggugucucuuccagaggcgagggggcugaggauggggugcugcaucuca cuagcuauacuggcaucaucuugguaaacugaaaaccaaauguggacauuuguaaaaucagugcacuguu ucuagagagagauuaaauucauuuaaaaaaaa
LRP8同種型4–氨基酸序列(SEQ ID NO:18)
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CTGF–RNA序列(SEQ ID NO:19)
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CTGF–氨基酸序列(SEQ ID NO:20)
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LXR-a同種型1:RNA序列(SEQ ID NO:21)
aggaaggagggguggccugaccccucggcagucccuccccucagccuuuccccaaauugcuacuuc ucuggggcuccagguccugcuugugcucagcuccagcucacuggcuggccaccgagacuucuggacagg aaacugcaccauccucuucucccagcaagggggcuccagagacugcccacccaggaagucugguggccug gggauuuggacagugccuugguaaugaccagggcuccaggaagagauguccuuguggcugggggccccu gugccugacauuccuccugacucugcgguggagcuguggaagccaggcgcacaggaugcaagcagccag gcccagggaggcagcagcugcauccucagagaggaagccaggaugccccacucugcuggggguacugcag ggguggggcuggaggcugcagagcccacagcccugcucaccagggcagagcccccuucagaacccacaga gauccguccacaaaagcggaaaaaggggccagcccccaaaaugcuggggaacgagcuaugcagcgugugu ggggacaaggccucgggcuuccacuacaauguucugagcugcgagggcugcaagggauucuuccgccgc agcgucaucaagggagcgcacuacaucugccacaguggcggccacugccccauggacaccuacaugcguc gcaagugccaggagugucggcuucgcaaaugccgucaggcuggcaugcgggaggaguguguccugucag aagaacagauccgccugaagaaacugaagcggcaagaggaggaacaggcucaugccacauccuugcccccc agggcuuccucacccccccaaauccugccccagcucagcccggaacaacugggcaugaucgagaagcucg ucgcugcccagcaacaguguaaccggcgcuccuuuucugaccggcuucgagucacgccuuggcccauggc accagauccccauagccgggaggcccgucagcagcgcuuugcccacuucacugagcuggccaucgucucu gugcaggagauaguugacuuugcuaaacagcuacccggcuuccugcagcucagccgggaggaccagauu gcccugcugaagaccucugcgaucgaggugaugcuucuggagacaucucggagguacaacccugggagu gagaguaucaccuuccucaaggauuucaguuauaaccgggaagacuuugccaaagcagggcugcaagug gaauucaucaaccccaucuucgaguucuccagggccaugaaugagcugcaacucaaugaugccgaguuug ccuugcucauugcuaucagcaucuucucugcagaccggcccaacgugcaggaccagcuccagguagagag gcugcagcacacauauguggaagcccugcaugccuacgucuccauccaccauccccaugaccgacugaug uucccacggaugcuaaugaaacuggugagccuccggacccugagcagcguccacucagagcaaguguuug cacugcgucugcaggacaaaaagcucccaccgcugcucucugagaucugggaugugcacgaaugacuguu cuguccccauauuuucuguuuucuuggccggauggcugaggccugguggcugccuccuagaaguggaac agacugagaagggcaaacauuccugggagcugggcaaggagauccucccguggcauuaaaagagagucaa aggguugcgaguuuuguggcuacugagcaguggagcccucgcuaacacugugcugugucugaagaucau gcugaccccacaaacggaugggccugggggccacuuugcacaggguucuccagagcccugcccauccugc cuccaccacuuccuguuuuucccacagggccccaagaaaaauucuccacugucaaaaaaaaa
LXR-a(NR1H3)同種型1:氨基酸序列(SEQ ID NO:22)
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LXR-a(NR1H3)同種型2:RNA序列(SEQ ID NO:23)
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LXR-a(NR1H3)同種型2:氨基酸序列(SEQ ID NO:24)
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LXR-a(NR1H3)同種型3:RNA序列(SEQ ID NO:25)
aucuuacuuagggaccugcuggggugcggggaaaaggcgcagucucggugggauugcgugcagg agggucguggucuggcuguggcggaggagcauaagaagacucugcgguggagcuguggaagccaggcg cacaggaugcaagcagccaggcccagggaggcagcagcugcauccucagagaggaagccaggaugcccca cucugcuggggguacugcagggguggggcuggaggcugcagagcccacagcccugcucaccagggcaga gcccccuucagaacccacagagauccguccacaaaagcggaaaaaggggccagcccccaaaaugcugggga acgagcuaugcagcguguguggggacaaggccucgggcuuccacuacaauguucugagcugcgagggcu gcaagggauucuuccgccgcagcgucaucaagggagcgcacuacaucugccacaguggcggccacugccc cauggacaccuacaugcgucgcaagugccaggagugucggcuucgcaaaugccgucaggcuggcaugcg ggaggaguguguccugucagaagaacagauccgccugaagaaacugaagcggcaagaggaggaacaggcu caugccacauccuugccccccagggcuuccucacccccccaaauccugccccagcucagcccggaacaacu gggcaugaucgagaagcucgucgcugcccagcaacaguguaaccggcgcuccuuuucugaccggcuucg agucacgccuuggcccauggcaccagauccccauagccgggaggcccgucagcagcgcuuugcccacuuc acugagcuggccaucgucucugugcaggagauaguugacuuugcuaaacagcuacccggcuuccugcag cucagccgggaggaccagauugcccugcugaagaccucugcgaucgaggugaugcuucuggagacaucu cggagguacaacccugggagugagaguaucaccuuccucaaggauuucaguuauaaccgggaagacuuu gccaaagcagggcugcaaguggaauucaucaaccccaucuucgaguucuccagggccaugaaugagcugc aacucaaugaugccgaguuugccuugcucauugcuaucagcaucuucucugcagaccggcccaacgugca ggaccagcuccagguagagaggcugcagcacacauauguggaagcccugcaugccuacgucuccauccac cauccccaugaccgacugauguucccacggaugcuaaugaaacuggugagccuccggacccugagcagcg uccacucagagcaaguguuugcacugcgucugcaggacaaaaagcucccaccgcugcucucugagaucug ggaugugcacgaaugacuguucuguccccauauuuucuguuuucuuggccggauggcugaggccuggu ggcugccuccuagaaguggaacagacugagaagggcaaacauuccugggagcugggcaaggagauccucc cguggcauuaaaagagagucaaaggguugcgaguuuuguggcuacugagcaguggagcccucgcuaaca cugugcugugucugaagaucaugcugaccccacaaacggaugggccugggggccacuuugcacaggguu cuccagagcccugcccauccugccuccaccacuuccuguuuuucccacagggccccaagaaaaauucucca cugucaaaaaaaaa
LXR-a(NR1H3)同種型3:氨基酸序列(SEQ ID NO:26)
mphsaggtag vgleaaepta lltraeppse pteirpqkrk kgpapkmlgn elcsvcgdka  sgfhynvlsc egckgffrrs vikgahyich sgghcpmdty mrrkcqecrl rkcrqagmre ecvlseeqir  lkklkrqeee qahatslppr assppqilpq lspeqlgmie klvaaqqqcn rrsfsdrlrv tpwpmapdph  srearqqrfa hftelaivsv qeivdfakql pgflqlsred qiallktsai evmlletsrr ynpgsesitf  lkdfsynred fakaglqvef inpifefsra mnelqlndae falliaisif sadrpnvqdq lqverlqhty  vealhayvsi hhphdrlmfp rmlmklvslr tlssvhseqv falrlqdkkl ppllseiwdv he
LXR-a(NR1H3)同種型4:RNA序列(SEQ ID NO:27)
gauucuaacuuagcuaagcaaugcuacuggagaccauaggcaaagccaagguacagcuucagggaa gucuuuggugagcccaucucucauuaccaagguaacgaagcgcagacuccgggcccgggugggcggcau caccaccagguucacgccgagaaggagcuggaggagagccgcccggcuccagccggaccgcuugcccgcc aucaccguuguaaucuaugcagcaaacaagcuggaacccgcuggguggcaccugcaagcagccgcccgga cgcacccacucugcgguggagcuguggaagccaggcgcacaggaugcaagcagccaggcccagggaggca gcagcugcauccucagagaggaagccaggaugccccacucugcuggggguacugcagggguggggcugg aggcugcagagcccacagcccugcucaccagggcagagcccccuucagaacccacagagauccguccacaa aagcggaaaaaggggccagcccccaaaaugcuggggaacgagcuaugcagcguguguggggacaaggccu cgggcuuccacuacaauguucugagcugcgagggcugcaagggauucuuccgccgcagcgucaucaagg gagcgcacuacaucugccacaguggcggccacugccccauggacaccuacaugcgucgcaagugccagga gugucggcuucgcaaaugccgucaggcuggcaugcgggaggaguguguccugucagaagaacagauccg ccugaagaaacugaagcggcaagaggaggaacaggcucaugccacauccuugccccccagggcuuccuca cccccccaaauccugccccagcucagcccggaacaacugggcaugaucgagaagcucgucgcugcccagca acaguguaaccggcgcuccuuuucugaccggcuucgagucacgccuuggcccauggcaccagauccccau agccgggaggcccgucagcagcgcuuugcccacuucacugagcuggccaucgucucugugcaggagaua guugacuuugcuaaacagcuacccggcuuccugcagcucagccgggaggaccagauugcccugcugaaga ccucugcgaucgaggugaugcuucuggagacaucucggagguacaacccugggagugagaguaucaccu uccucaaggauuucaguuauaaccgggaagacuuugccaaagcagggcugcaaguggaauucaucaaccc caucuucgaguucuccagggccaugaaugagcugcaacucaaugaugccgaguuugccuugcucauugc uaucagcaucuucucugcagaccggcccaacgugcaggaccagcuccagguagagaggcugcagcacaca uauguggaagcccugcaugccuacgucuccauccaccauccccaugaccgacugauguucccacggaugc uaaugaaacuggugagccuccggacccugagcagcguccacucagagcaaguguuugcacugcgucugca ggacaaaaagcucccaccgcugcucucugagaucugggaugugcacgaaugacuguucuguccccauauu uucuguuuucuuggccggauggcugaggccugguggcugccuccuagaaguggaacagacugagaagg gcaaacauuccugggagcugggcaaggagauccucccguggcauuaaaagagagucaaaggguugcgag uuuuguggcuacugagcaguggagcccucgcuaacacugugcugugucugaagaucaugcugaccccac aaacggaugggccugggggccacuuugcacaggguucuccagagcccugcccauccugccuccaccacuu ccuguuuuucccacagggccccaagaaaaauucuccacugucaaaaaaaaa
LXR-a(NR1H3)同種型4:氨基酸序列(SEQ ID NO:28)
mqqtswnplg gtckqppgrt hsavelwkpg aqdassqaqg gsscilreea rmphsaggta  gvgleaaept alltraepps epteirpqkr kkgpapkmlg nelcsvcgdk asgfhynvls cegckgffrr  svikgahyic hsgghcpmdt ymrrkcqecr lrkcrqagmr eecvlseeqi rlkklkrqee eqahatslpp  rassppqilp qlspeqlgmi eklvaaqqqc nrrsfsdrlr vtpwpmapdp hsrearqqrf ahftelaivs  vqeivdfakq lpgflqlsre dqiallktsa ievmlletsr rynpgsesit flkdfsynre dfakaglqve  finpifefsr amnelqlnda efalliaisi fsadrpnvqd qlqverlqht yvealhayvs ihhphdrlmf  prmlmklvsl rtlssvhseq vfalrlqdkk lppllseiwd vhe
LXR-b(NR1H2)同種型1:RNA序列(SEQ ID NO:29)
ucgucaaguuucacgcuccgccccucuuccggacgugacgcaagggcgggguugccggaagaagu ggcgaaguuacuuuugaggguauuugaguagcggcggugugucaggggcuaaagaggaggacgaagaa aagcagagcaagggaacccagggcaacaggaguaguucacuccgcgagaggccguccacgagacccccgc gcgcagccaugagccccgccccccgcuguugcuuggagaggggcgggaccuggagagaggcugcuccgu gaccccaccauguccucuccuaccacgaguucccuggauaccccccugccuggaaauggccccccucagcc uggcgccccuucuucuucacccacuguaaaggaggaggguccggagccguggcccggggguccggaccc ugaugucccaggcacugaugaggccagcucagccugcagcacagacugggucaucccagaucccgaagag gaaccagagcgcaagcgaaagaagggcccagccccgaagaugcugggccacgagcuuugccgugucugug gggacaaggccuccggcuuccacuacaacgugcucagcugcgaaggcugcaagggcuucuuccggcgcag ugugguccgugguggggccaggcgcuaugccugccgggguggcggaaccugccagauggacgcuuuca ugcggcgcaagugccagcagugccggcugcgcaagugcaaggaggcagggaugagggagcagugcgucc uuucugaagaacagauccggaagaagaagauucggaaacaacagcagcaggagucacagucacagucgca gucaccuguggggccgcagggcagcagcagcucagccucugggccuggggcuuccccugguggaucuga ggcaggcagccagggcuccggggaaggcgaggguguccagcuaacagcggcucaagaacuaaugauccag caguugguggcggcccaacugcagugcaacaaacgcuccuucuccgaccagcccaaagucacgcccuggc cccugggcgcagacccccagucccgagaugcccgccagcaacgcuuugcccacuucacggagcuggccau caucucaguccaggagaucguggacuucgcuaagcaagugccugguuuccugcagcugggccgggagga ccagaucgcccuccugaaggcauccacuaucgagaucaugcugcuagagacagccaggcgcuacaaccac gagacagaguguaucaccuucuugaaggacuucaccuacagcaaggacgacuuccaccgugcaggccugc agguggaguucaucaaccccaucuucgaguucucgcgggccaugcggcggcugggccuggacgacgcug aguacgcccugcucaucgccaucaacaucuucucggccgaccggcccaacgugcaggagccgggccgcgu ggaggcguugcagcagcccuacguggaggcgcugcuguccuacacgcgcaucaagaggccgcaggaccag cugcgcuucccgcgcaugcucaugaagcuggugagccugcgcacgcugagcucugugcacucggagcag gucuucgccuugcggcuccaggacaagaagcugccgccucugcugucggagaucugggacguccacgag ugaggggcuggccacccagccccacagccuugccugaccacccuccagcagauagacgccggcaccccuuc cucuuccuaggguggaaggggcccugggccgagccuguagaccuaucggcucucaucccuugggauaag ccccaguccagguccaggaggcucccucccugcccagcgagucuuccagaaggggugaaaggguugcagg ucccgaccacugacccuucccggcugcccucccuccccagcuuacaccucaagcccagcacgcagugcacc uugaacagagggaggggaggacccauggcucuccccccuagcccgggagaccagggccuuccucuuccuc ugcuuuuauuuaauaaaaacuaaaaacagaaacaggaaaauaaaauaugaauacaauccagcccggagcug gagugca
LXR-b(NR1H2)同種型1:氨基酸序列(SEQ ID NO:30)
msspttssld tplpgngppq pgapsssptv keegpepwpg gpdpdvpgtd eassacstdw  vipdpeeepe rkrkkgpapk mlghelcrvc gdkasgfhyn vlscegckgf frrsvvrgga rryacrgggt  cqmdafmrrk cqqcrlrkck eagmreqcvl seeqirkkki rkqqqqesqs qsqspvgpqg  ssssasgpga spggseagsq gsgegegvql taaqelmiqq lvaaqlqcnk rsfsdqpkvt pwplgadpqs  rdarqqrfah ftelaiisvq eivdfakqvp gflqlgredq iallkastie imlletarry nhetecitfl  kdftyskddf hraglqvefi npifefsram rrlglddaey alliainifs adrpnvqepg rvealqqpyv  eallsytrik rpqdqlrfpr mlmklvslrt lssvhseqvf alrlqdkklp pllseiwdvh e
LXR-b(NR1H2)同種型2:RNA序列(SEQ ID NO:31)
ucgucaaguuucacgcuccgccccucuuccggacgugacgcaagggcgggguugccggaagaagu ggcgaaguuacuuuugaggguauuugaguagcggcggugugucaggggcuaaagaggaggacgaagaa aagcagagcaagggaacccagggcaacaggaguaguucacuccgcgagaggccguccacgagacccccgc gcgcagccaugagccccgccccccgcuguugcuuggagaggggcgggaccuggagagaggcugcuccgu gaccccaccauguccucuccuaccacgaguucccuggauaccccccugccuggaaauggccccccucagcc uggcgccccuucuucuucacccacuguaaaggaggaggguccggagccguggcccggggguccggaccc ugaugucccaggcacugaugaggccagcucagccugcagcacagacuggggcguccuuucugaagaacag auccggaagaagaagauucggaaacaacagcagcaggagucacagucacagucgcagucaccuguggggc cgcagggcagcagcagcucagccucugggccuggggcuuccccugguggaucugaggcaggcagccagg gcuccggggaaggcgaggguguccagcuaacagcggcucaagaacuaaugauccagcaguugguggcgg cccaacugcagugcaacaaacgcuccuucuccgaccagcccaaagucacgcccuggccccugggcgcagac ccccagucccgagaugcccgccagcaacgcuuugcccacuucacggagcuggccaucaucucaguccagg agaucguggacuucgcuaagcaagugccugguuuccugcagcugggccgggaggaccagaucgcccucc ugaaggcauccacuaucgagaucaugcugcuagagacagccaggcgcuacaaccacgagacagaguguau caccuucuugaaggacuucaccuacagcaaggacgacuuccaccgugcaggccugcagguggaguucauc aaccccaucuucgaguucucgcgggccaugcggcggcugggccuggacgacgcugaguacgcccugcuc aucgccaucaacaucuucucggccgaccggcccaacgugcaggagccgggccgcguggaggcguugcagc agcccuacguggaggcgcugcuguccuacacgcgcaucaagaggccgcaggaccagcugcgcuucccgcg caugcucaugaagcuggugagccugcgcacgcugagcucugugcacucggagcaggucuucgccuugcg gcuccaggacaagaagcugccgccucugcugucggagaucugggacguccacgagugaggggcuggcca cccagccccacagccuugccugaccacccuccagcagauagacgccggcaccccuuccucuuccuagggug gaaggggcccugggccgagccuguagaccuaucggcucucaucccuugggauaagccccaguccaggucc aggaggcucccucccugcccagcgagucuuccagaaggggugaaaggguugcaggucccgaccacugacc cuucccggcugcccucccuccccagcuuacaccucaagcccagcacgcagugcaccuugaacagagggag gggaggacccauggcucuccccccuagcccgggagaccagggccuuccucuuccucugcuuuuauuuaa uaaaaacuaaaaacagaaacaggaaaauaaaauaugaauacaauccagcccggagcuggagugca
LXR-b(NR1H2)同種型2:氨基酸序列(SEQ ID NO:32)
msspttssld tplpgngppq pgapsssptv keegpepwpg gpdpdvpgtd eassacstdw  gvlseeqirk kkirkqqqqe sqsqsqspvg pqgssssasg pgaspggsea gsqgsgegeg vqltaaqelm  iqqlvaaqlq cnkrsfsdqp kvtpwplgad pqsrdarqqr fahftelaii svqeivdfak qvpgflqlgr  edqiallkas tieimlleta rrynheteci tflkdftysk ddfhraglqv efinpifefs ramrrlgldd  aeyalliain ifsadrpnvq epgrvealqq pyveallsyt rikrpqdqlr fprmlmklvs lrtlssvhse  qvfalrlqdk klppllseiw dvhe
has-miR-199a-1序列(SEQ ID NO:33)
GCCAACCCAGUGUUCAGACUACCUGUUCAGGAGGCUCUCAAUG UGUACAGUAGUCUGCACAUUGGUUAGGC
has-miR-199a-2序列(SEQ ID NO:34)
AGGAAGCUUCUGGAGAUCCUGCUCCGUCGCCCCAGUGUUCAGAC UACCUGUUCAGGACAAUGCCGUUGUACAGUAGUCUGCACAUUGGUU AGACUGGGCAAGGGAGAGCA
has-miR-1908序列(SEQ ID NO:35)
CGGGAAUGCCGCGGCGGGGACGGCGAUUGGUCCGUAUGUGUGG UGCCACCGGCCGCCGGCUCCGCCCCGGCCCCCGCCCC
has-miR-7-1序列(SEQ ID NO:36)
UUGGAUGUUGGCCUAGUUCUGUGUGGAAGACUAGUGAUUUUGU UGUUUUUAGAUAACUAAAUCGACAACAAAUCACAGUCUGCCAUAUG GCACAGGCCAUGCCUCUACAG
has-miR-7-2序列(SEQ ID NO:37)
CUGGAUACAGAGUGGACCGGCUGGCCCCAUCUGGAAGACUAGU GAUUUUGUUGUUGUCUUACUGCGCUCAACAACAAAUCCCAGUCUAC CUAAUGGUGCCAGCCAUCGCA
has-miR-7-3序列(SEQ ID NO:38)
AGAUUAGAGUGGCUGUGGUCUAGUGCUGUGUGGAAGACUAGUG AUUUUGUUGUUCUGAUGUACUACGACAACAAGUCACAGCCGGCCUC AUAGCGCAGACUCCCUUCGAC
miR-Zip 199a-3p序列(SEQ ID NO:39)
GATCCGACAGTAGCCTGCACATTAGTCACTTCCTGTCAGTAACCAA TGTGCAGACTACTGTTTTTTGAATT
miR-Zip 199a-5p序列(SEQ ID NO:40)
GATCCGCCCAGTGCTCAGACTACCCGTGCCTTCCTGTCAGGAACA GGTAGTCTGAACACTGGGTTTTTGAATT
miR-Zip 1908序列(SEQ ID NO:41)
GATCCGCGGCGGGAACGGCGATCGGCCCTTCCTGTCAGGACCAAT CGCCGTCCCCGCCGTTTTTGAATT
miR-Zip 7序列(SEQ ID NO:42)
GATCCGTGGAAGATTAGTGAGTTTATTATCTTCCTGTCAGACAACA AAATCACTAGTCTTCCATTTTTGAATT
該網絡的成員可用作用于治療轉移性黑素瘤的靶標。此外,所述成員可 用作生物標記,用于確定受試者是否具有轉移性黑素瘤,或受試者是否處于 具有轉移性黑素瘤的風險,或者用于確定具有該病癥的患者的預后和或監測。 因此,本發明包括通過靶向所述一個或多個成員而治療轉移性黑素瘤的方法、 確定治療方案對于抑制癌癥的效果的方法以及鑒定抗癌制劑的方法。還提供 了診斷受試者是否具有轉移性黑素瘤,或者是否處于具有轉移性黑素瘤的風 險的方法,以及篩選認為處于具有發展為該疾病的風險的受試者的方法。本 發明還包括適于進行上述方法的各種試劑盒。
ApoE多肽
如文中使用的術語“多肽或肽”包括具有所述網絡涉及的特定結構域或 部分的上述轉移抑制劑的任一種的重組或合成產生的融合或嵌合的版本。該 術語還包括所述肽的類似物、片段、延長或衍生物(例如,具有用于在原核 細胞中表達的增加的氨基末端蛋氨酸)。
如文中使用的“載脂蛋白多肽或ApoE多肽”意思是模擬天然載脂蛋白 的體內或體外功能的肽、藥物或化合物,包括為10~200個氨基酸殘基長度 的肽的載脂蛋白類似物、片段、延長物或衍生物,這樣的肽可包括含有酰胺 鍵的天然或非天然的氨基酸。可修飾載脂蛋白肽片段,以改善它們在本領域 中已知的體內穩定性或生物利用度,并可包括通過各種鍵結合到氨基酸側鏈 的有機化合物。
在一個方面,我們的發明為使用具有氨基酸序列TQQIRLQAEIFQAR (鼠科)(SEQ.ID.No.43)或AQQIRLQAEAFQAR(人類)(SEQ.ID.No.44) 的分離的apoEp1.B肽,或所述肽的類似物、片段、延長物或衍生物的方法。 本發明還包括編碼apoEpI.B肽或其類似物、片段、延長物或衍生物的核酸分 子。
術語“類似物”包括具有與天然肽實質上相同的氨基酸殘基序列的任何 肽,其中,一個或多個殘基已經用功能相似的殘基保守地取代,并且其顯示 模擬天然肽的能力。保守取代的實例包括一個非極性(疏水的)殘基取代另 一個,例如丙氨酸、異亮氨酸、纈氨酸、亮氨酸或蛋氨酸,一個極性(親水 的)殘基取代另一個,例如精氨酸和賴氨酸之間,谷氨酰胺和天冬酰胺之間, 甘氨酸和絲氨酸之間,一個堿性殘基(例如賴氨酸、精氨酸或組氨酸)取代 另一個,或取代一個酸性殘基,例如天冬氨酸或谷氨酸取代另一種。
術語“保守的取代”還包括使用化學衍生的殘基代替非衍生的殘基,只 要這樣的多肽顯示必需的活性。肽的類似物包括具有下述序列的肽: TAQIRLQAEIFQAR(SEQ.ID.NO.:45);TQAIRLQAEIFQAR (SEQ.ID.NO.:46);TQQARLQAEIFQAR(SEQ.ID.NO.:47)和 TQQIALQAEIFQAR(SEQ.ID.NO.:48)。
“衍生物”是指具有一個或多個通過官能側基的反應而化學衍生的 殘基的肽。這樣的衍生的分子包括例如其中游離氨基已經衍生形成胺鹽酸鹽、 對甲苯磺酰基、芐氧羰基、叔丁氧羧基、氯乙酰基或甲酰基的那些分子。游 離的羧基可衍生,以形成鹽、甲酯和乙酯或其它類型的酯或酰肼類。游離的 羥基可衍生形成O-酰基衍生物或O-烷基衍生物。組氨酸的咪唑氮可衍生形 成N-im-芐基組氨酸。還包括的作為衍生物的為包含一種或多種的20個標準 氨基酸的天然產生的氨基酸衍生物的那些肽。例如:4-羥基丙氨酸可取代脯 氨酸;5-羥基賴氨酸可取代賴氨酸;3-甲基組氨酸可取代組氨酸;高絲氨酸 可取代絲氨酸;并且鳥氨酸可取代賴氨酸。本發明的多肽還包括具有一個或 多個相對于文中顯示其序列的多肽的序列的殘基的增加和/或刪除,只要保持 必需的活性。
術語“片段”是指具有比文中顯示其氨基酸殘基序列的肽短的氨基 酸殘基序列的任何主題的肽。
術語“延長”是指具有比本發明的肽長一個或兩個氨基酸的氨基酸序列 (在羧基末端或氨基末端)的任何主題的肽。優選地,在氨基末端發生延長。 肽的片段和延長包括具有下述序列的肽:QTQQIRLQAEIFQAR (SEQ.ID.NO.:49)和QQIRLQAEIFQAR(SEQ.ID.NO.:50)。
在通過引用合并于本文的美國專利No.6,652,860中描述了ApoE多肽及 其制備方法。
LXR激動劑
本發明的方法可包括施予用于預防并治療轉移的LXR激動劑。所述LXR 激動劑可為根據下面顯示的化學式I、II、III或IV的化合物。
下面提供了化學式I:

或其藥學上可接受的鹽,其中
Ar為芳基;
R1為選自由-OH、-CO2H、-O-(Cl-C7)烷基、-OC(O)-、-(C1-C7)烷基、 -O-(C1-C7)雜烷基、-OC(O)-(C1-C7)雜烷基、-NH2、-NH(C1-C7)烷基、-N((C1-C7) 烷基)2和-NH-S(O)2(C1-C5)烷基組成的組中的成員;
R2為選自由(C1-C7)烷基、(C1-C7)雜烷基、芳基和芳基(C1-C7)烷基組成的 組中的成員;
X1、X2、X3、X4、X5和X6各自獨立地為選自由H、(C1-C5)烷基、(C1-C5) 雜烷基、F和CI組成的組中的成員,條件是X1至X6的不超過三個為H、(C1-C5) 烷基、(C1-C5)雜烷基;并且
Y為選自由-N(R12)S(O)m-、-N(R12)S(O)mN(R13)-、-N(R12)C(O)-、 -N(R12)C(O)N(R13)-、-N(R12)C(S)-和-N(R12)C(O)O-組成的組中的二價連接基 團;
其中,R12和R13各自獨立地選自由H、(C1-C7)烷基、(C1-C7)雜烷基、芳基 和芳基(C1-C7)烷基組成的組中,并且任選地,當Y為-N(R12)S(O)m-或 -N(R12)S(O)mN(R13)-時,R12通過共價連接到Ar或R2而分別形成稠合到Ar或R2的五元或六元環;并且下標m為1至2的整數;
條件是當R1為OH,并且–Y-R2為-N(R12)S(O)m-R2或-N(R12)C(O)N(R13)-R2 并且連接到附著到Ar的季碳的對位,并且當R2為苯基、芐基或苯甲酰基時, 則i)R12或R13的至少一個不是氫并包含吸電子取代基,或者ii)R2被除了氨 基、乙酰氨基、二(C1-C7)烷基氨基、(C1-C7)烷基氨基、鹵素、羥基、硝基或 (C1-C7)烷基以外的其它部分(moiety)取代,或者iii)R2的苯環部分被除了Y 基或者連接到Y的點以外的至少三個獨立選擇的基團取代。
在一些實施方式中,Y為–N(R12)S(O)2-并且R1為OH。
因此,化學式I的化合物包括但不限于具有下面顯示的結構的化合 物:

可如通過引用合并于本文的美國專利No.6,316,503中所描述地合成化學 式I的化合物。
下面提供了化學式II:

其中:
R1為-H;
X1為鍵、C1至C5烷基、-C(O)-、-C(=CR8R9)-、-O-、-S(O)t-、-NR8-、-CR8R9-、 -CHR23、-CR8(CR9)-、-C(CR8)2-、-CR8(OC(O)R9)-、-C=NOR9-、-C(O)NR8-、 -CH2O-、-CH2S-、-CH2NR8-、-OCH2-、-SCH2-、-NR8CH2-或
R2為H、C1至C6烷基、C2至C6烯基、C2至C6炔基、C3至C6環烷基、-CH2OH、 C7至C11芳烷基、苯基、萘基、C1至C3全氟代烷基、CN、C(O)NH2、CO2R12, 或被獨立地選自C1~C3烷基、C2~C4烯基、C2~C4炔基、C1~C3烷氧基、C1~C3全氟代烷基、鹵素、-NO2、-NR8R9、-CN、-OH以及用1至5個氟取代的C1~C3烷基的一個或多個取代的苯基,或者R2為選自由吡啶、噻吩、苯并異噁唑、 苯并噻吩、噁二唑、吡咯、吡唑、咪唑和呋喃組成的組中的雜環,其每種均 可任選地被獨立地選自C1~C3烷基、C1至C3烷氧基、C1至C3全氟代烷基、鹵素、 -NO2、-NR8R9、-CN和用1至5個氟取代的C1至C3烷基的一個或三個基團取代;
X2為鍵或-CH2-;
R3為苯基、萘基,或獨立地被獨立地選自C1~C3烷基、羥基、苯基、酰 基、鹵素、-NH2、-CN、-NO2、C1至C3烷氧基、C1至C3全氟代烷基、用1至5 個氟取代的C1至C3烷基、NR14R15、-C(O)R10、-C(O)NR10Rl1、-C(O)NR11A、 -C≡CR8、-CH=CHR8、-WA、-C≡CA、-CH=CHA、-WAY、-WYNR11-A、-WYR10、 -WY(CH2)jA、-WCHR11(CH2)jA、-W(CH2)jA、-W(CH2)jR10、 -CHR11W(CH2)jR10、-CHR11W(CH2)jA、-CHR11NR12YA、-CHR11NR12YR10、吡 咯、-W(CH2)jA(CH2)kD(CH2)pZ、-W(CR18R19)A(CH2)kD(CH2)pZ、 -(CH2)jWA(CH2)kD(CH2)pZ、-CH=CHA(CH2)kD(CH2)pZ、 -C≡CA(CH2)kD(CH2)pZ、-W(CH2)jC≡CA(CH2)kD(CH2)pZ和-W(CH2)jZ的一個至 四個基團取代的苯基或萘基,或者R3為選自嘧啶、噻吩、呋喃、苯并噻吩、 吲哚、苯并呋喃、苯并咪唑、苯并噻唑、苯并噁唑和喹啉的雜環,其每種均 可任選地被獨立地選自C1~C3烷基、C1~C3烷氧基、羥基、苯基、酰基、鹵素、 -NH2、-CN、-NO2、C1至C3全氟代烷基、用1至5個氟取代的C1至C3烷基、 -C(O)R10、-C(O)NR10R11、-C(O)NR11A、-C≡CR8、-CH=CHR8、-WA、-C≡CA、 -CH=CHA、-WAY、-WYR10、-WY(CH2)jA、-W(CH2)jA、-W(CH2)jR10、 -CHR11W(CH2)jR10、-CHR11W(CH2)jA、-CHR11NR12YA、-CHR11NR12YR10、 -WCHR11(CH2)jA、-W(CH2)jA(CH2)kD(CH2)pZ、-W(CR18R19)A(CH2)kD(CH2)pZ、 -(CH2)jWA(CH2)kD(CH2)pZ、-CH=CHA(CH2)kD(CH2)pZ、 -C≡CA(CH2)kD(CH2)pZ、-W(CH2)jC≡CA(CH2)kD(CH2)pZ和-W(CH2)jZ的一個至 三個基團取代;
W為鍵、-O-、-S-、-S(O)-、-S(O)2-、-NR11-或-N(COR12)-;
Y為-CO-、-S(O)2-、-CONR13、-CONR13CO-、-CONR13SO2-、-C(NCN)-、 -CSNR13、-C(NH)NR13或-C(O)O-;
j為0至3;
k為0至3;
t為0至2;
D為鍵、-CH=CH-、-C≡C-、-C=、-C(O)-、苯基、-O-、-NH-、-S-、-CHR14-、 -CR14R15-、-OCHR14、-OCR14R15-或-CH(OH)CH(OH)-;
p為0至3;
Z為-CO2R11、-CONR10R11、-C(NR10)NR11R12、-CONH2NH2、-CN、-CH2OH、 -NR16R17、苯基、CONHCH(R20)COR12、苯鄰二甲酰亞胺、吡咯烷-2,5二酮、 噻唑烷-2,4-二酮、四唑基、吡咯、吲哚、噁唑、2-硫代-l,3-噻唑啉-4-酮 (2-thioxo-1,3-thiazolin-4-one)、C1~C7胺類;C3~C7環胺類,或用一個或兩個 OH取代的C1~C3烷基;其中,所述吡咯可任選地被獨立地選自由-CO2CH3、 -CO2H、-COCH3、-CONH2和-CN組成的組中的一個或兩個取代基取代;
其中,所述C1至C7胺類可任選地被獨立地選自由-OH、鹵素、-OCH3和 -C≡CH組成的組中的一個到兩個取代基取代;
其中所述苯基可任選地被CO2R11取代,并且,其中所述C3~C7環胺可任 選地被獨立地選自由-OH-CH2OH、C1~C3烷基、-CH2OCH3、-CO2CH3和 -CONH2組成的組中的一個或兩個取代基取代,并且,其中所述噁唑可任選地 被CH2CO2R11取代;
A為苯基、萘基、四氫萘基、茚滿或聯苯基,其每個均可任選地被獨立 地選自鹵素、C1~C3烷基、C2~C4烯基、C2~C4炔基、酰基、羥基、鹵素、-CN、 -NO2、-CO2R11、-CH2CO2R11、苯基、C1~C3全氟代烷氧基、C1~C3全氟代烷 基、-NR10R11、-CH2NR10R11、-SR11、用1~5個氟取代的C1~C6烷基、用1~2 個OH取代的C1~C3烷基、可任選地被1~5個氟取代的C1~C6烷氧基或任選地被 1~2個CF3基團取代的苯氧基的1個至4個基團取代;或者
A為選自吡咯、吡啶、吡啶-N-氧化物、嘧啶、吡唑、噻吩、呋喃、喹啉、 噁唑、噻唑、咪唑、異噁唑、吲哚、苯并[1,3]-間二氧雜環戊烯、苯并[1,2,5]- 噁二唑、異色烯-l-酮、苯并噻吩、苯并呋喃、2,3-二-5氫苯并[1,4]-二噁英(2,3-di- 5 hydrobenzo[1,4]-dioxine)、聯噻吩基(bitheinyl)、喹唑啉-2,4-9[3H]二酮以 及3-H-異苯并呋喃-l-酮的雜環,其每種均可任選地被獨立地選自鹵素、C1~C3烷基、乙酰基、羥基、-CN、-NO2、C1~C3全氟代烷基、-NR10R11、-CH2NR10R11、 -SR11、用1~5個氟取代的C1~C3烷基以及任選地用1~5個氟取代的C1~C3烷氧基 的1~3個基團取代;
R4、R5和R6各自獨立地為-H或-F;
R7為C1~C4烷基、C1~C4全氟代烷基、鹵素、-NO2、-CN、苯基或被獨立 地選自鹵素、C1~C2烷基和OH的一種或兩種基團取代的苯基;
條件是如果X1R2形成氫,則R3選自:
(a)被-W(CH2)jA(CH2)kD(CH2)pZ、-W(CR18R19)A(CH2)kD(CH2)pZ、 -(CH2)jWA(CH2)kD(CH2)pZ、-CH=CHA(CH2)kD(CH2)pZ、-C≡CA(CH2)kD(CH2)pZ 或-W(CH2)jC≡CA(CH2)kD(CH2)pZ取代的苯基,其中苯基部分可進一步任選地 被獨立地選自C1~C2烷基、C1~C2全氟代烷基、鹵素和CN的一個或兩個基團 取代;以及
(b)選自嘧啶、噻吩和呋喃的雜環,其每個均被 -W(CH2)jA(CH2)kD(CH2)pZ、-W(CR18R19)A(CH2)kD(CH2)pZ、 -(CH2)jWA(CH2)kD(CH2)pZ、-CH=CHA(CH2)kD(CH2)pZ、 -C≡CA(CH2)kD(CH2)pZ或-W(CH2)jC≡CA(CH2)kD(CH2)pZ的一種取代;
每個R8均獨立地為-H或C1至C3烷基;
每個R9均獨立地為-H或C1至C3烷基;
每個R10均獨立地為-H、-CH、C1至C3烷氧基、C1至C7烷基、C3~C7烯基、 C3~C7炔基、C3~C7環烷基、-CH2CH2OCH3、2-甲基-四氫呋喃、2-甲基-四氫 吡喃、4-甲基哌啶、嗎啉、吡咯烷或者任選地用1或2個C1至C3烷氧基取代的 苯基,其中,所述C1~C7烷基可任選地被獨立地選自C1~C3烷氧基、C1~C3硫 代烷氧基和CN的1、2或3個基團取代;
每個R11均獨立地為-H、C1至C3烷基或R22;或者當R10與R11連接到相同的 原子時,共同與所述原子形成:5~7元的飽和環,其可任選地被選自C1~C3烷 基、OH和C1~C3烷氧基的1至2個基團取代;或包含1或2個雜原子的5~7元環, 其可任選地被獨立地選自C1~C3烷基、OH和C1~C3烷氧基的1至2個基團取代;
每個R12均獨立地為-H或C1至C3烷基;
每個R13均獨立地為-H或C1至C3烷基;
每個R14和R15均獨立地為C1至C7烷基、C3至C8環烷基、C2至C7烯基、C2至C7炔基、-CH、F、C7至C14芳烷基,其中,所述芳烷基可任選地被獨立地 選自NO2、C1至C6烷基、C1至C3全鹵代烷基、鹵素、CH2CO2R11、苯基和C1至C3烷氧基的1至3個基團取代,或者R12和R15與它們連接的原子共同形成3~7 元的飽和環;
每個R16和R17均獨立地為氫、C1至C3烷基、C1至C3烯基、C1至C3炔基、 苯基、芐基或C3至C8環烷基,其中,所述C1至C3烷基可任選地被一個OH基團 取代,并且其中,所述芐基可任選地被選自C1至C3烷基和C1至C3烷氧基的1 至3個基團取代;或者R16和R17與它們連接的原子共同形成3~8元雜環,其可 任選地被獨立地選自由C1至C3烷基、-OH、CH2OH、-CH2OCH3、-CO2CH3和 -CONH2組成的組中的1或2個取代基取代;
每個R18和R19均獨立地為C1至C3烷基;
每個R20均獨立地為H、苯基或天然產生的α氨基酸的側鏈;
每個R22均獨立地為可任選地被CH2COOH取代的芳烷基;并且
每個R23均為苯基;
或其藥學上可接受的鹽。
可如通過引用合并于本文的美國專利No.7,576,215中所描述地,合成化 學式II的化合物。化學式II的化合物可為化合物26~32的任一種或其藥學上 可接受的鹽。


下面提供了化學式III:

其中:X選自氫、C1-C8烷基、鹵素、-OR10、-NR10R11、硝基、氰基、-COOR10或-COR10
Z為CH、CR3或N,其中,當Z為CH或CR3時,k為0~4,并且t為0或1,并 且當Z為N時,k為0~3,并且t為0;
Y選自-O-、-S-、-N(R12)-和-C(R4)(R5)-;
W1選自C1-C6烷基、C0-C6烷基、C3-C6環烷基、芳基和Het,其中,所述 C1-C8烷基、C3-C8環烷基、Ar和Het可任選地未取代,或者被獨立地選自鹵素、 氰基、硝基、C1-C6烷基、C3-C6烯基、C3-C6炔基、-C0-C6烷基-CO2R12、-C0-C6烷基-C(O)SR12、-C0-C6烷基-CONR13R14、-C0-C6烷基-COR15、-C0-C6烷基 -NR13R14、-C0-C6烷基-SR12、-C0-C6烷基-OR12、-C0-C6烷基-SO3H、-C0-C6烷基 -SO2NR13R14、-C0-C6烷基-SO2R12、-C0-C6烷基-SOR15、-C0-C6烷基OCOR15、 -C0-C6烷基-OC(O)NR13R14、-C0-C6烷基-OC(O)OR15、-C0-C6烷基 -NR13C(O)OR15、-C0-C6烷基-NR13C(O)NR13R14和-C0-C6烷基-NR13COR15的一 個或多個基團取代,其中,所述C1-C6烷基可任選地未取代或被一個或多個鹵 素取代基取代;
W2選自H、鹵素、C1-C6烷基、C2-C6烯基、C2-C6炔基、-C0-C6烷基-NR13R14、 -C0--C6烷基-SR12、-C0-C6烷基-OR12、-C0-C6烷基CO2R12、-C0-C6烷基-C(O)SR12、 -C0-C6烷基CONR13R14、-C0-C6烷基-COR15、-C0-C6烷基OCOR15、-C0-C6烷基 -OCONR13R14、-C0-C6烷基-NR13CONR13R14、-C0-C6烷基-NR13COR15、-C0-C6烷基-Het、-C0-C6烷基-Ar和–C0-C6烷基-C3-C7環烷基,其中,所述C1-C6烷基 可任選地未取代或者被一個或多個鹵素取代基取代,并且其中,所述–C0-C6烷基-Het、-C0-C6烷基-Ar和–C0-C6烷基-C3-C7環烷基的C3-C7環烷基、Ar和Het 部分可任選地未取代,或者被獨立地選自鹵素、氰基、硝基、C1-C6烷基、C3-C6烯基、C3-C6炔基、-C0-C6烷基-CO2R12、-C0-C6烷基-C(O)SR12、-C0-C6烷基 -CONR13R14、-C0-C6烷基-COR15、-C0-C6烷基-NR13R14、-C0-C6烷基-SR12、 -C0-C6烷基-OR12、-C0-C6烷基-SO3H、-C0-C6烷基-SO2NR13R14、-C0-C6烷基 -SO2R12、-C0-C6烷基-SOR15、-C0--C6烷基-OCOR15、-C0-C6烷基OC(O)NR13R14、 -C0-C6烷基-OC(O)OR15、-C0-C6烷基-NR13C(O)OR15、-C0-C6烷基 -NR13C(O)NR13R14和–C0-C6烷基-NR13COR15的一個或多個基團取代,其中, 所述C1-C6烷基可任選地未取代或被一個或多個鹵素取代基取代;
W3選自由下述組成的組:H、鹵素、C1-C6烷基、-C0-C6烷基-NR13R14、-C0-C6烷基SR12、-C0-C6烷基-OR12、-C0-C6烷基-CO2R12、-C0-C6烷基-C(O)SR12、-C0-C6烷基-CONR13R14、-C0-C6烷基-COR15、-C0-C6烷基-OCOR15、-C0-C6烷基 -OCONR13R14、-C0-C6烷基NR13CONR13R14、-C0-C6烷基-NR13COR15、-C0-C6烷基-Het、-C1-C6烷基-Ar和–C1-C6烷基-C3-C7環烷基,其中,所述C1-C6烷基 可任選地未取代或者被一個或多個鹵素取代基取代;
Q選自C3-C8環烷基、Ar和Het;其中,所述C3-C8環烷基、Ar和Het可任選 地未取代或被獨立地選自鹵素、氰基、硝基、C1-C6烷基、C3-C6烯基、C3-C6炔基、-C0-C6烷基CO2R12、-C0-C6烷基-C(O)SR12、-C0-C6烷基CONR13R14、-C0-C6烷基-COR15、-C0-C6烷基NR13R14、-C0-C6烷基-SR12、-C0-C6烷基-OR12、-C0-C6烷基-SO3H、-C0-C6烷基-SO2NR13R14、-C0-C6烷基-SO2R12、-C0-C6烷基-SOR15、 -C0-C6烷基-OCOR15、-C0-C6烷基-OC(O)NR13R14、-C0-C6烷基-OC(O)OR15、 -C0-C6烷基NR13C(O)OR15、-C0-C6烷基-NR13C(O)NR13R14和–C0-C6烷基 -NR13COR15的一種或多種基團取代,其在,所述C1-C6烷基可任選地未取代或 被一個或多個鹵素取代基取代;
p為0-8;
n為2-8;
m為0或1;
q為0或1;
t為0或1;
每個R1和R2均獨立地選自H、鹵素、C1-C6烷基、C3-C6烯基、C3-C6炔基、 -C0-C6烷基-NR13R14、-C0-C6烷基-OR12、-C0-C6烷基-SR12、-C1-C6烷基-Het、 -C1-C6烷基-Ar和–C1-C6烷基-C3-C7環烷基,或者R1和R2與它們連接的碳共同 形成3~5元碳環或雜環,其中,所述雜環包括一個或多個選自N、O和S的雜 原子,其中,所述C1-C6烷基的任一個任選地未取代或被一個或多個鹵素取代 基取代;
每個R3同相均或不同,并獨立地選自鹵素、氰基、硝基、C1-C6烷基、C3-C6烯基、C3-C6炔基、-C0-C6烷基-Ar、-C0-C6烷基-Het、-C0-C6烷基-C3-C7環烷基、 -C0-C6烷基-CO2R12、-C0-C6烷基-C(O)SR12、-C0-C6烷基-CONR13R14、-C0-C6烷基-COR15、-C0-C6烷基-NR13R14、-C0-C6烷基-SR12、-C0-C6烷基-OR12、-C0-C6烷基-SO3H、-C0-C6烷基SO2NR13R14、-C0-C6烷基-SO2R12、-C0-C6烷基SOR15、 -C0-C6烷基-OCOR15、-C0-C6烷基-OC(O)NR13R14、-C0-C6烷基-OC(O)OR15、 -C0-C6烷基-NR13C(O)OR15、-C0-C6烷基-NR13C(O)NR13R14和–C0-C6烷基 -NR13COR15,其中,所述C1-C6烷基可任選地未取代,或者被一個或多個鹵素 取代基取代;
R4和R5的每個均獨立地選自H、鹵素、C1~C6烷基、-C0-C6烷基-Het、-C0-C6烷基-Ar和–C0-C6烷基-C3-C7環烷基;
R6和R7均獨立地選自H、鹵素、C1~C6烷基、-C0-C6烷基-Het、-C0-C6烷基 -Ar和–C0-C6烷基-C3-C7環烷基;
R8和R9均獨立地選自H、鹵素、C1~C6烷基、-C0-C6烷基-Het、-C0-C6烷基 -Ar和–C0-C6烷基-C3-C7環烷基;
R10和R11均獨立地選自H、C1-C12烷基、C3-C12烯基、C3-C12炔基、-C0-C8烷基-Ar、-C0-C8烷基-Het、-C0-C8烷基-C3-C7環烷基、-C0-C8烷基-O-Ar、-C0-C8烷基-O-Het、-C0-C8烷基-O-C3-C7環烷基、-C0-C8烷基-S(O)x-C0-C6烷基、-C0-C8烷基-S(O)x-Ar、-C0-C8烷基-S(O)x-Het、-C0-C8烷基-S(O)x-C3-C7環烷基、-C0-C8烷基-NH-Ar、-C0-C8烷基-NH-Het、-C0-C8烷基-NH-C3-C7環烷基、-C0-C8烷基 -N(C1-C4烷基)-Ar、-C0-C8烷基-N(C1-C4烷基)-Het、-C0-C8烷基-N(C1-C4烷基 -C3-C7環烷基、-C0-C8烷基-Ar、-C0-C8烷基-Het和–C0-C8烷基-C3-C7環烷基, 其中,x為0、1或2,或者R10和R11與它們共同連接的N形成4~7元的雜環,其 可任選地包含一個或多個選自N、O和S的另外的雜原子,其中,所述C1-C12烷基、C3-C12烯基或C3-C12炔基可任選地被獨立地選自由鹵素、-OH、-SH、 -NH2、-NH(未取代的C1-C6烷基)、-N(未取代的C1-C6烷基)(未取代的C1-C6烷基)、未取代的–OC1-C6烷基、-CO2H、-CO2(未取代的C1-C6烷基)、-CONH2、 -CONH(未取代的C1-C6烷基)、-CON(未取代的C1-C6烷基)(未取代的C1-C6烷 基)、-SO3H、-SO2NH2、-SO2NH(未取代的C1-C6烷基)和-SO2N(未取代的C1-C6烷基)(未取代的C1-C6烷基)組成的組中的一個或多個取代基取代;
R12選自H、C1-C6烷基、C3-C6烯基、C3-C6炔基、-C0-C6烷基-Ar、-C0-C6烷基-Het和–C0-C6烷基-C3-C7環烷基;
每個R13和每個R14均獨立地選自H、C1-C6烷基、C3-C6烯基、C3-C6炔基、 -C0-C6烷基-Ar、-C0-C6烷基-Het和-C0-C6烷基-C3-C7環烷基,或者R13和R14與它 們共同連接的N形成4~7元雜環,其可任選地包含一個或多個選自N、O和S的 另外的雜原子;
并且R15選自C1-C6烷基、C3-C6烯基、C3-C6炔基、-C0-C6烷基-Ar、-C0-C6烷基-Het和–C0-C6烷基-C3-C7環烷基;
或其藥學上可接受的鹽。
在一些實施方式中,X為氫,p為0,t為0,Z為CH,并且Y為–O-。
在另外的實施方式中,X為氫,p為0,t為0,Z為CH,并且Y為–O-, W1和W2為苯基,W3為氫,q為1,R8和R9為氫。
在其它實施方式中,X為氫,p為0,t為0,Z為CH,并且Y為–O-, W1和W2為苯基,W3為氫,q為1,R8和R9為氫,并且Q為Ar。
因此,化學式III的化合物包括但不限于具有下面顯示的結構的化 合物GW3965 2和SB742881 25:

可如通過引用合并于本文的美國專利No.7,365,085和7,560,586中所描 述地,合成化學式III的化合物。
下面顯示了化學式IV:

或其藥學上可接受的鹽,其中:
J11為-N=,并且J21為-CR300-,或者J11為–CR200-,并且J21為=N-;
R00為Gl、G21或RN
R200為G1、G21或RC
如果R300、R400和R500的一個且僅有一個是Q,那么R300和R400獨立地為RC或Q;
Q為C3~6環烷基、雜芳基或雜環基,每個均可任選地被1至4個RQ取代,或 者Q為-X-Y-Z;其中每個RQ均獨立地為芳氧基、芳烷基氧基(aralkyloxy)、 芳氧基烷基、芳基C0-C6烷基羧基、C(R110)=C(R110)-COOH、氧代、=S、-Z、 -Y'-Z或-X-Y-Z,其中,每個RQ均可任選地被1至4個R80取代;
R500為G1G21、Q或RC;條件是R00、R200和R500僅有一個是Gl,并且R00、 N=和R500僅有一個是G21
G21為–J0-K0,其中,J0和K0獨立地為芳基或雜芳基,其每個均可任選地 被一個至4個RK基團取代,每個RK均獨立地為氫、鹵素、CR110=CR110COOR110、 硝基、-Z、-Y-Z或-X-Y-Z;
Gl為–L10-R,其中,L10為鍵、L50、L60、-L50-L60-L50-或-L60-L50-L50-,其 中
每個L50均獨立地為-[C(R150)2]m-;
每個L60均獨立地為-CS-、-CO-、-SO2-、-O-、-CON(R110)-、 -CONR110N(Rll0)-、-C(=NRll0)-、-C(NORll)-、-C(=N-N(R110)2)-、-C3-C8-環烷基 或–雜環基-,其中,所述環烷基或雜環基可任選地被一個至4個R140基團取代; 或者每個L60獨立地為C2-C6烷二基(alidiyl),其中,所述烷二基鏈可任選地 被-C(R100)2-、-C(R110)2C(R110)z-、-C(R11)C(R110)-、-C(R110)2O-、-C(R110)zNR110-、 -C C-、-O-、-S-、-N(RO)CO-、-N(R100)CO2-、-CON(R110)-、-CO-、-CO2-、 -OC(=O)-、-OC(=O)N(R100)-、-SO2-、-N(R100)SO2-或-SO2N(R100)中斷;
R為芳基、雜環基、雜芳基或-(C3-C6)環烷基,其中,R可任選地被1至4 個RA取代,其中,每個RA均獨立地為鹵素、硝基、雜環基、C1-C6烷基、C2-C6烯基、C2-C6炔基、C3-C8環烷基、(C3-C8環烷基)-C1-C6烷基-、(C3-C8環烯 基)-C1-C6烷基-、(C3-C8環烷基)-C1C6烯基-、芳烷基、芳氧基、芳基Cl-6烷氧基、 C1-C6鹵代烷基、SO2R110、OR110、SR110、N3、SOR110、COR110、SO2N(R110)2、 SO2NR110COR110、C≡N、C(O)OR110、CON(R110)2、-CON(R110)OR110、 OCON(R110)2、-NR110COR110、NR110CON(R110)2、NR110COOR110、 -C(=N-OH)R110、-C(=S)N(R110)2、-S(=O)N(R110)2、-S(=O)OR110、 -N(R110)S(=O)2R110、-C(=O)N(R110)N(R110)2、-OC(=O)-R110、-OC(=O)-OR110或 N(R11)2,其中,每個RA均可任選地被1至4個獨立地為-鹵素、-Cl-C6烷基、芳 氧基、C0-6烷基SO2R110、C0-6烷基COOR110、Cl-6烷氧基芳基、C1-C6鹵代烷基、 -SO2R110、-OR110、-SR110、-N3、-SO2R110、-COR110、-SO2N(R110)2、 -SO2NR110COR110、-C≡N、-C(O)OR110、-CON(R110)2、-CON(R110)OR110、 -OCON(R110)2、-NR110COR110、-NR110CON(R110)2、-NR110COOR110或-N(R110)2的基團取代;
RN為–L31-R60,其中,L31為鍵、-X3(CHz)n-X3-、-(CH2)m-X3-(CH2)n-或 -(CH2)1+w、-Y3-(CH2)w-,其中,每個w均獨立地為0~5;并且每個X3均獨立地 為鍵、-C(R110)2-、-C(R110)2C(R110)2-、-C(R110)=C(R110)-、-C≡C-、-CO-、-CS-、 -CONR100-、-C(=N)(R100)-、-C(=N-OR110)-、-C[=N-N(R110)2]、-CO2-、-SO2- 或–SO2N(R110)-;并且
Y3為-O-、-S-、-NR70-、-N(R100)CO-、-N(R110)CO2-、-OCO-、-OC(=O)N (R100)-、-NR100CONR100-、-N(R110)SO2-或–NR100CSNR100-;
或者,L31為C2~6烷二基鏈,其中,所述烷二基鏈可任選地被-C(R110)2-、 -C(R110)2C(R110)2-、-C(R110)=C(R110)-、-C(R110)2O-、-C(R110)2NR110-、-C≡C-、 -O-、-S-、-N(R100)CO-、-N(R100)CO2-、-CON(R100)-、-CO-、-CO2-、-OC(=O)-、 -OC(=O)N(R110)-、-SO2-、-N(R100)SO2-或-SO2N(R100)中斷;并且
R60為C1-C6烷基、C1-C6鹵代烷基、芳基、C3-C8環烷基、雜芳基、雜環基、 -CN、-C(=O)R110、-C(=O)OR110、-C(=O)N(R110)2、-N(R110)2、-SO2R110、 -S(=O)2N(R110)2、-C(=O)N(R110)N(R110)2或-C(=O)N(R11)(OR110),其中,所述芳 基、雜芳基、環烷基或雜環基可任選地被1至4個R60a取代,其中,
每個R60a均獨立地為-Z、-Y’-Z或-X-Y-Z;
每個RC均獨立地為–L30-R70,其中,每個L30均獨立地為鍵或 -(CH2)m-V10-(CH2)n-,其中,V10為-C(R110)2-、-C(R110)2C(R110)2、 -C(R110)=C(R110)-、-C(R110)2O-、-C(R110)2NR110-、-C≡C-、-O-、-S-、-NR10-、 -N(R100)CO-、-N(R100)CO2-、-OCO-、-CO-、-CS-、-CONR100-、-C(=N-R110)-、 -C(=N-OR110)-、-C[=N-N(R110)2]、-CO2-、-OC(=O)-、-OC(=O)N(R100)-、SO2-、 -N(R100)SO2-、-SO2N(R100)-、-NR100CONR100-、-NR100CSNR100-、C3-C6環烷基 或C3-C6環鹵代烷基;或者每個L30均獨立地為C2-C6烷二基,其中,所述烷二 基鏈可任選地被–C(R110)2-、-C(R110)2C(R110)2-、-C(R110)C(R110)-、-C(R110)2O-、 -C(R110)2NR110-、-C≡C-、-O-、-S-、-N(R100)CO-、-N(R100)CO2-、-NR110-、 -CON(R100)-、-CO-、-CO2-、-O(C=O)-、-O(C=O)N(R100)-、-SO2-、-N(R100)SO2- 或–SO2N(R100)-打斷;
每個R70均獨立地為氫、鹵素、硝基、芳基、雜芳基、雜環基、-Z、-Y-Z 或-X-YZ,其中,所述芳基、雜芳基和雜環基的每個均可任選地被1至4個R70a取代,其中,每個R70a均獨立地為芳氧基、芳烷基氧基、芳氧基烷基、芳基 C0-C6烷基羧基、C(R110)=C(R110)COOH、氧代、-Z、-Y'-Z或-X-Y-Z,其中, 每個R70a均可任選地被1至4個R80取代,并且,其中,每個R80均獨立地為鹵素、 C1-C6烷基、C1-C6烷氧基、C1-C8鹵代烷基、C1-C8鹵代烷基(OR110)、C0-C6烷 基OR110、C0-C6烷基CON(R110)2、C0-C6烷基COR110、C0-C6烷基COOR110或C0-C6烷基SO2R110
每個R100均獨立地為–R110、-C(=O)R110、-CO2R110或-SO2R110
每個R110均獨立地為鹵素、-C1-C6烷基、C2-C6烯基、Cl-C6炔基、-C1-C6鹵代烷基或-N(R12)2,其中,可任選地用1至4個R120的自由基取代R110的任一 個;
每個R120均獨立地為鹵素、氰基、硝基、氧代、-B(OR130)、C0-C6烷基N(R13)2、 C1-C6鹵代烷基、C1-C6烷基、C1-C6烷氧基、(C0-C6烷基)C=O(OR130)、C0-C6烷 基OR130、C0-C6烷基COR130、C0-C6烷基SO2R130、Co-C6烷基CON(R13)2、C0-C6烷基CONR130OR130、C0-C6烷基SO2N(R130)2、C0-C6烷基SR130、C0-C6鹵代烷基 OR130、C0-C6烷基CN、-C0-C6烷基N(R13)2、-NR13SO2R13或-OC0~6烷基COOR130
每個R130均獨立地為氫、C1-C6烷基、C2-C6烯基或C2-C6烯基;
每個R140均獨立地為C1-C6烷基、C1-C6烷氧基、鹵素、C1-C6鹵代烷基、 C0-C6烷基CON(R110)o、C0-C6烷基CONR110R10、C0~C6烷基OR110或C0-C6烷基 COOR110;并且
每個R150均獨立地為氫、鹵素、OR130、(C1-C6)烷基或(C1-C6)鹵代烷基, 其中每個烷基均可任選地被各自獨立地為鹵素、氰基、硝基、疊氮基、OR130、 C(O)R130、C(O)OR13C(O)N(R130)2、N(R130)2、N(R130)C(O)R130、N(R130)S(O)2R130、 -OC(O)OR130、OC(O)N(R130)2、N(R130)C(O)OR130、N(R130)C(O)N(R130)、SR130、 S(O)R130、S(O)2R'或S(O)2N(R130)2的至少一個基團取代;或者兩個R150(鍵合 到相同或不同的原子)可合起來形成C3~C6環烷基;
每個X均獨立地為-O-、-S-或-N(R100)-;
每個Y均獨立地為-[C(R150)2]p-或-C2-C6烯基,其中,p為1、2、3、4、5 或6;
每個Y均'獨立地為-[C(R150)2]p-、-C2-C6烯基、C3-C8環烷基或雜環基,其 中所述環烷基或雜環基可任選地被1至3個Z基團取代;
每個Z均獨立地為-H、鹵素、-OR110、-SR110、-C(=O)R110、-C(=O)OR110、 -C(=O)N(R110)2、-N(R100)2、-N3、-NO2、-C(=N-OH)R110、-C(=S)N(R110)2、-CN、 -S(=O)R110、-S(=O)N(R110)2、-S(=O)OR110、-S(=O)2R110、S(=O)2N(R110)2、 -NR110COR110、-N(R110)C(=O)N(R110)2、-N(R110)COOR110、-N(R110)S(=O)2R110、 -C(=O)N(R110)N(R110)2、-C(=O)N(R110)(OR110)、-OC(=O)-R110、-OC(=O)-OR110, 或-OC(=O)-N(R110)2;并且
M和n的每個均獨立地為0、1、2、3、4、5或6。
在一些實施方式中,化學式IV的化合物具有化學式V或VI的結構:

在其它實施方式中,化學式VI的化合物具有化學式VII的結構:

在另一些其它實施方式中,化學式VI的化合物具有化學式VIII的結構:

在另一些實施方式中,化學式VI的化合物具有化學式IX的結構:

因此,可用于本發明的方法中的化學式IV的化合物包括但不限于具有 下面顯示的結構的化合物,以及其藥學上可接受的鹽:




選自包括下列的列表:
332-(1-(3氯代-3'-氟代-4'-(羥甲基)-5'-(甲基磺酰基)聯苯基-4-基)-2-(2-(2,6 二氯苯基)丙-2-基)-1H-咪唑-4-基)丙-2-醇;342-(2-(2(2-氯代-3-氟代苯基)丙 -2-基)-1-(3'-氟代-4'-(羥甲基)-5'(甲基磺酰基)聯苯基-4-基)-1H-咪唑-4-基)丙 -2-醇;35 2-(2-(2(2,6-二氯苯基)丙-2-基)-1-(3'-氟代-4'-(羥甲基)-5'(甲基磺酰基) 聯苯基-4-基)-1H-咪唑-4-基)丙-2-醇;362-(2-(2(2,6-二氯苯基)丙-2- 基)-1-(3,3'-二氟代-4'-(羥甲基)-5'(甲基磺酰基)聯苯基-4-基)-1H-咪唑-4-基)丙 -2-醇;和372-(2-[1(2,6-二氯苯基)乙基]-1-[3,3'-二氟代-4'-(羥甲基)-5'(甲基磺酰 基)聯苯基-4-基]-1H-咪唑-4-基)丙-2-醇。化合物12還稱為WO2010 0138598實 施例9。化合物38還稱為WO2007 002563實施例19。化合物39還稱為WO2012  0135082中已知。
可如通過引用合并于本文的PCT公開No.US2010/0069367和 WO2010/138598中所述合成化學式IV的化合物。
可用于治療和/或預防轉移的LXR激動劑可為化合物24或其藥學上可接 受的鹽。

在另外的實施方式中,可在由下述組成的列表中的PCT中公開發現用于 治療和/或預防轉移的化合物:WO2006/094034,WO2008/049047、 WO2009/020683、WO2009/086138、WO2009/086123、WO2009/086130、 WO2009/086129、WO2007/002559、WO2007/002563、WO2007/081335、 WO2006/017055、WO2006/102067、WO2009/024550、US2006/0074115、 US2006/0135601、WO2009/021868、WO2009/040289、WO2007/047991、 WO2007/050425、WO2006/073363、WO2006/073364、WO2006/073365、 WO2006/073366、WO2006/073367、US2009/0030082、WO2008/065754、 JP2008/179562、WO2007/092065、US2010/0069367、US7998995、US7247748、 WO2010/138598、US7365085、US75776215、US63136503、US2004/0072868、 US2005/0107444、US2005/0113580、US2005/0131014、US2005/0282908、 US2009/0286780,其通過引用并入本文。
首先被多個團體大致同時發現的LXRα和LXRβ(Apfel et al.,1994;Willy  et al.,1995;Song et al.,1994;Shinar et al.,1994;Teboul et al.,1995)屬于被膽 固醇內源地活化的細胞核激素受體家族,并且其被氧化的衍生物調節涉及維 持葡萄糖、膽固醇和脂肪酸代謝的基因的轉錄(Janowski et al.,1996;Calkin  and Tontonoz,2012)。考慮到脂質代謝和癌細胞生長之間復雜的聯系(Cairns  et al.,2011),LXRβ在黑素瘤中廣泛地表達不可能是巧合(coincidental),允 許黑素瘤細胞合成脂質和脂質體顆粒,以維持它們的生長。然而,同時,這 樣的穩定的基礎表達水平使得LXRβ成為理想的治療靶點,如黑素瘤細胞對 LXRβ活性治療的廣泛的響應所例證的。
化合物已經顯示對LXRβ或LXRα有選擇性。該選擇性可允許提高的活 性和/或減少脫靶效應(off target effects)。表1中顯示了對LXRβ或LXRα有 選擇性的化合物的實例。
表1.所選擇地抗LXRα和LXRβ的化合物的EC50

化合物 EC50–LXRα(nM) EC50–LXRβ(nM) GW3965 2 200 40 SB742881 25 74 25 TO901317 1 20 50 LXR-623 3 179 24

12 <100 11 38 101~1000 630

如文中使用,LXR激動劑對LXRα和LXRβ的活性是指如使用通過引 用合并于本文的Spencer et al.Journal of Medicinal Chemistry 2001,44, 886-897中描述的配體敏感檢測(ligand sensing assay,LiSA)測量的活性。 在一些實施方式中,LXR激動劑在配體敏感檢測中具有小于1μM的EC50(例 如0.5nm至500nM,10nM至100nM)。例如,可使用具有對LXRβ的活性 比對LXRα的激動劑活性大至少3倍的LXRβ激動劑進行本發明的方法,或 具有比LXRα的激動劑活性大至少10倍的對于LXRβ活性,或者具有比LXRα 的激動劑活性大至少100倍的對于LXRβ活性,或者具有比LXRα的激動劑 活性大至少3倍以內的對于LXRβ活性的LXRβ激動劑。LiSA檢測中,術 語“更大的活性”是指較小的EC50。例如,GW3965 2對LXRβ的活性比對 LXRα(EC50=190)的活性大大約6倍(EC50=30)。
如文中使用,術語“提高ApoE體外表達的水平”是指某些LXR激動劑 能夠在小于5μM的濃度(例如,在100nM至2μM的濃度,在小于或等于1 μM的濃度),在實施例21的qPCR檢測中,提高ApoE的表達水平2.5倍。 LXR激動劑體外呈現的此效果可高度有效地用于本發明的方法中。
本申請中使用的術語“烷基”涉及飽和的分支的或不分支的脂族單價取 代基。烷基取代劑具有1~100個碳原子(例如,1~22個碳原子,1~10個碳 原子,1~6個碳原子,1~3個碳原子)。因此,烷基取代基的實例包括甲基、 乙基、正丙基、異丙基、正丁基、異丁基、仲丁基、叔丁基、正戊基和正己 基。
術語“烷氧基”表示具有化學式–OR的化學取代基,其中,除非另 外說明,R是可任選地為取代的C1~C6烷基。在一些實施方式中,烷基可被 取代,例如,烷氧基可具有文中限定的1、2、3、4、5或6個取代基。
如文中定義,術語“烷氧烷基”表示雜烷基,即所述為烷氧基取代的烷 基。示例性的未取代的烷氧烷基包括2~12個碳。在一些實施方式中,烷基 和烷氧基的每個均可進一步被文中限定的用于各個基團的1、2、3或4個取 代基取代。
如文中使用,術語“環烷基”是指單環、雙環或三環取代基,其可飽和 或部分飽和,即具有一個或多個雙鍵。單環取代基由包含3~8個碳原子的飽 和的環狀烴基示例。單環環烷基取代基的實例包括環丙基、環丁基、環戊基、 環戊烯基、環己基、環己烯基、環庚基和環辛基。雙環稠合的環烷基取代基 由稠合到另一個環烷基環的環烷基環示例。雙環環烷基取代基的實例包括但 不限于萘烷、1,2,3,7,8,8a-六氫化萘等。三環環烷基取代基由稠合到另外的環 烷基取代基的環烷基雙環稠合環示例。
本申請中使用的術語“烯基”涉及飽和的分支的或不分支的二價脂肪族 取代基(例如,烯基取代基具有1~6個碳原子、1~3個碳原子)。因此,烯 基取代基的實例包括亞甲基、亞乙基、三亞甲基、亞丙基、四亞甲基、異亞 丙基、五亞甲基和六亞甲基。
本申請中使用的術語“亞烯基或烯基”是在兩個相鄰的碳原子之間具有 雙鍵的不飽和的分支或未分支的脂族二價取代基(例如,亞烯基取代基具有 2~6個碳原子,2~4個碳原子)。因此,亞烯基取代基的實例包括但不限于亞 乙烯基、亞1-丙烯基、亞2-丙烯基、甲基亞乙烯基、亞1-丁烯基、亞2-丁烯 基、亞3-丁烯基、2-甲基-1-亞丙烯基、2-甲基-2-亞丙烯基、亞2-亞戊烯基、 2-亞己烯基。
本申請中使用的術語“亞炔基或炔基”是在兩個相鄰的碳原子之間具有 三鍵的不飽和的分支的或未分支的脂族二價取代基(例如,亞炔基取代基具 有2~6個碳原子,2~4個碳原子)。亞炔基取代基的實例包括但不限于亞乙炔 基、亞1-丙炔基、亞1-丁炔基、亞2-丁炔基、亞1-戊炔基、亞2-戊炔基、亞 3-戊炔基和亞2-己炔基。
本申請中使用的術語“亞二烯基”是在兩個相鄰的碳原子之間具有兩個 雙鍵的不飽和的分支的或未分支的脂族二價取代基(例如亞二烯基取代基具 有4~10個碳原子)。因此,亞二烯基取代基的實例包括但不限于亞2,4-戊二 烯基、亞2,4-己二烯基、4-甲基-亞2,4-戊二烯基、亞2,4-庚二烯基、亞2,6- 庚二烯基、3-甲基-亞2,4-己二烯基、亞2,6-辛二烯基、3-甲基-亞2,6-庚二烯 基、2-甲基-亞2,4-庚二烯基、亞2,8-壬二烯基、亞3-甲基-2,6-辛二烯、亞 2,6-癸二烯基、亞2,9-癸二烯和3,7-二甲基-亞2,6-辛二烯基取代基。
如文中使用,術語“雜脂族取代基或雜烷基”是指單價或雙價取代基, 其中,一個或多個碳原子已經被雜原子取代,例如被氧、硫、氮、磷或硅原 子取代,其中,氮原子和硫原子可任選地被氧化,并且氮雜原子可任選地被 季銨化。雜原子O、N和S可位于雜脂族取代基的內部的任何位置。實例包 括-CH2-CH2-O-CH3、-CH2-CH2-NH-CH3、-CH2-CH2-N(CH3)-CH3、 -CH2-S-CH2-CH3、-S(O)-CH3、-CH2-CH2-S(O)2-CH3、-CH=CH-O-CH3、 -CH2-CH=N-OCH3和-CH=CH-N(CH3)-CH3。雜脂族取代基可為直鏈的或支鏈 的,和飽和的或不飽和的。
在一個實施方式中,雜脂族取代基具有1~100(例如1~42個碳原子)。 在再一個實施方式中,雜脂族取代基為聚乙二醇殘基。
如文中使用,“芳香取代基或芳基”指在每個環中多達10個原子的任何 穩定的單環、雙環或多環碳環,其中,至少一個環是芳香族的,并可被取代 或未取代。這樣的芳香取代基的實例包括苯基、對甲苯基(4-甲基苯基)、萘 基、四氫化萘基、茚基、聯苯基、菲基、蒽基或苊基。在芳香取代基是雙環, 并且一個環為非芳香環的情況下,應理解連接是通過芳香環。
術語“烷基芳基取代基或芳烷基”是指如上面所述的烷基取代基, 其中,到其中包含的氫的一個或多個鍵被上述到芳基取代基的鍵所取代。應 理解,如果本發明的化合物通過來自烷基取代基的鍵,則芳烷基連接到羰基。 芳烷基取代基的實例包括但不限于芐基(苯甲基)、對三氟甲基芐基(4-三氟 甲基苯甲基)、1-苯乙基、2-苯乙基、3-苯丙基、2-苯丙基等。
如文中使用的術語“雜芳基取代基或雜芳基”表示每個環中多達10個原 子的穩定的單環、雙環或多環的環,其中,至少一個環為芳香族的并包含1~4 個選自由O、N和S組成的組的雜原子。雙環雜芳香族取代基包括如下所述 的苯基、吡啶、嘧啶或噠嗪環:
a)稠合到具有一個氮原子的6元芳香族(不飽和)的雜環;
b)稠合到具有兩個氮原子的5元或6元芳香族(不飽和)的雜環;
c)稠合到具有一個氮原子以及一個氧原子或硫原子的任一個的5元芳香 族(不飽和)的雜環;或
d)稠合到具有一個選自O、N或S的雜原子的5元芳香族(不飽和)的 雜環。
該定義范圍內的雜芳基包括但不限于:苯并咪唑基、苯并呋喃基、苯并 呋吖基、苯并吡唑基、苯并三唑基、苯并苯硫基、苯并噁唑基、咔唑基、咔 啉基、噌啉基(cinnolinyl)、呋喃基、二氫吲哚基、吲哚基、吲唑基、吲嗪 基(indolazinyl)、吲唑基、異苯并呋喃基、異吲哚基、異喹啉基、異噻唑基、 異噁唑基、萘吡啶基、噁二唑基、噁唑基、噁唑啉、異噁唑啉、氧雜環丁烷 基(oxetanyl)、吡喃基、吡嗪基、吡唑基、噠嗪基、吡啶并吡啶基 (pyridopyridinyl)、噠嗪基、吡啶基、嘧啶基、吡咯基、喹唑啉基、喹啉基、 喹喔啉基、四唑基、四唑吡啶基、噻二唑基、噻唑基、噻吩基、三唑基、氮 雜環丁基(azetidinyl)、吖丙啶基、1,4-二氧己環基(1,4-dioxanyl)、六氫吖 庚因基(hexahydroazepinyl)、二氫苯并咪唑基、二氫苯并呋喃基、二氫苯并 苯硫基、二氫苯并噁唑基、二氫呋喃基、二氫咪唑基、二氫吲哚基、二氫異 噁唑基、二氫異噻唑基、二氫噁二唑基、二氫噁唑基、二氫吡嗪基、二氫吡 唑基、二氫吡啶基、二氫嘧啶基、二氫吡咯基、二氫喹啉基、二氫四唑基、 二氫噻二唑基、二氫噻唑基、二氫噻吩基、二氫三唑基、二氫氮雜環丁烷基、 亞甲基二氧苯甲酰基、四氫呋喃基、四氫噻吩基、吖啶基、咔唑基、噌嗪基、 喹喔啉基、吡唑基、吲哚基、苯并三唑基、苯并噻唑基、苯并噁唑基、異惡 唑基、異噻唑基、呋喃基、噻吩基、苯并噻吩基、苯并呋喃基、喹啉基、異 喹啉基、惡唑啉基、異惡唑基、吲哚基、吡嗪基、噠嗪基、吡啶基、嘧啶基、 吡咯基、四氫喹啉。在雜芳基取代基是雙環,并且一個環是非芳香或不包含 雜原子的情況下,應理解分別通過芳環或包含雜原子的環連接。如果雜芳基 包含氮原子,則應理解其相應的N氧化物也包括在該定義內。
所述脂族、雜脂族、芳香和雜芳香取代基可任選地被取代一次或多次, 用包括但不限于下述的任一種或多種,以相同或不同的方式:脂族、雜脂族、 芳香和雜芳香取代基,芳基、雜芳基;烷芳基;雜烷芳基;烷基雜芳基;雜 烷基雜芳基;烷氧基;芳氧基;雜烷氧基;雜芳基氧基;烷硫基;芳硫基; 雜烷硫基;雜芳硫基;F;CI;Br;I;-OH;-NO2;-CN;-CF3;-CH2CF3; -CHCl2;-CH2OH;-CH2CH2OH;-CH2NH2;-CH2SO2CH3;-C(O)Rx;-CO2(Rx); -CON(Rx)2;-OC(O)Rx;-OCO2Rx;-OCON(Rx)2;-N(RX)2;-S(O)Rx;-S(O)2Rx; -NRx(CO)Rx,其中,獨立地出現的每個Rx包括但不限于脂族、脂環族、雜脂 族、雜環、芳香族、雜芳香族、芳基、雜芳基、烷芳基、烷基雜芳基、雜烷 基芳基或雜烷基雜芳基,其中,上述脂族、脂環族、雜脂族、雜環、烷芳基 或烷基雜芳基取代基的任一個為被取代或未取代,分支或未分支,飽和或未 飽和,并且,其中,上述以及本文的芳香的、雜芳香的、芳基、雜芳基、(烷 基)芳基或(烷基)雜芳基取代基的任一個可為取代的或未取代的。此外,應理 解,任何兩個合起來的鄰近的取代基可表示4、5、6或7元取代或未取代的 脂環族或雜環族取代基。通常可用的取代基的另外的實例通過下面顯示的具 體實施方式說明。
術語“鹵素(halo和halogen)”是指選自由F、Cl、Br和I組成的組中 的鹵素原子。
術語“鹵代的烷基取代基,鹵代烷基”是指用至少一個鹵素原子取代的 上述烷基取代基。在實施方式中,鹵代烷基取代基全鹵化。在另一個實施方 式中,全氟烷基是指鹵代烷基取代基是化學式CnF2n+1的單價的全氟代取代 基。例如,鹵代烷基取代基可具有1~6個碳原子(例如1~3個碳原子)。因 此,烷基的實例包括三氟代甲基、2,2,2-三氟代乙基、正全氟代丙基、正全氟 代丁基和正全氟代戊基。
如文中使用的術語“氨基”表示–N(RN1)2,其中,每個RN1均獨立地為H、 OH、NO2、N(RN2)2、SO2ORN2、SO2RN2、SORN2、N保護基團、烷基、烯基、 炔基、烷氧基、芳基、烷芳基、環烷基、烷基環烷基、雜環(例如雜芳基)、 烷基雜環(例如烷基雜芳基),或者兩個RN1結合已形成雜環基或N保護基 團,并且,其中,每個RN2均獨立地為H、烷基或芳基。在優選的實施方式 中,氨基為–NH2或–NHRN1,其中RN1獨立地為OH、NO2、NH2、NRN22、 SO2ORN2、SO2RN2、SORN2、烷基或芳基,并且每個RN2均可為H、烷基或芳 基。如文中使用,術語“氨基烷基”表示如文中定義的雜烷基,即描述為被 文中定義的氨基取代的如文中定義的烷基。烷基和氨基各自可進一步被1、2、 3或4個如文中定義的各自的取代基取代。例如,烷基部分可包括氧代(=O) 取代基。
如文中使用,術語“芳氧基”是指通過氧原子連接到另一個殘基的芳香 或雜芳香系統。O-芳基典型的實例為苯氧基。相似地,“芳烷基”是指通過 碳鏈連接到另一個殘基的芳香或雜芳香系統,所述碳鏈為飽和或不飽和,飽 和時通常為C1-C8、C1-C6,或更具體地C1-C4或C1-C3,或者當不飽和時 為C2-C8、C2-C6、C2-C4或C2-C3,包括其雜化形態。更大確定地,芳烷基 因此包括連接到如上面定義的烷基、雜烷基、烯基、雜烯基、炔基或雜炔基 部分的如上面定義的芳基或雜芳基。典型的芳烷基可為芳基(C6-C12)烷基 (C1-C8)、芳基(C6-C12)烯基(C2-C8)或芳基(C6-C12)炔基(C2-C8),加上其雜 化形態。典型的實例為苯基甲基(通常稱為芐基)。
芳香或雜芳香基團上通常可選擇的取代基獨立地包括鹵素、CN、 NO2、CF3、OCF3、COOR’、CONR’2、OR’、SR’、SOR’、SO2R’、NR’2、 NR’(CO)R’、NR’C(O)OR’、NR’C(O)NR’2、NR’SO2NR’2或NR’SO2R’,其中, 每個R’均獨立地為H,或者可任選地為選自烷基、烯基、炔基、雜烷基、雜 烯基、雜炔基、雜芳基和芳基(全部如上面所定義)的取代的基團;或者取 代基可任選地為選自烷基、烯基、炔基、雜烷基、雜烯基、雜炔基、芳基、 雜芳基、O-芳基、O-雜芳基和芳基烷基的取代的基團。
非芳香基團(例如烷基、烯基和炔基)上可選擇的取代基通常選自 適于芳香或雜芳香基團的取代基相同的列表,除了文中另外注明。非芳香基 還可包含選自=O和=NOR’的取代基,其中,R’為H或可任選地為選自烷基、 烯基、炔基、雜烷基、雜烯基、雜炔基、雜芳基和芳基(全部如上面所定義 的)的取代的基團。
通常,取代基(例如烷基、烯基、炔基或芳基(包括上面定義的全 部雜化形態)自身可任選地被其它取代基取代。這些取代基的性質與上述基 本結構上的取代基引用的那些性質相似。因此,當取代基的實施方式為烷基 時,該烷基可任選地被列為取代基的剩余取代基取代,請在這具有化學意義, 并且請在,這不破壞烷基本身的大小限制;例如被烷基或烯基取代的烷基可 簡單地擴大這些實施方式的碳原子的上限,并且不被包括。然而,可包括被 芳基、氨基、鹵素等取代的烷基。例如,當基團被取代時,基團可被1、2、 3、4、5或6個取代基取代。可選擇的取代基包括但不限于:C1-C6烷基或 雜芳基、C2-C6烯基或雜烯基、C2-C6炔基或雜炔基、鹵素;芳基、雜芳基、 疊氮基(-N3)、硝基(-NO2)、氰基(-CN)、酰氧基(-OC(=O)R’)、酰基(-C(=O)R’)、 烷氧基(-OR’)、氨基(-NR’C(=O)R”或–C(=O)NRR’)、氨基(-NRR’)、羧 酸基(-CO2H)、羧酸酯(-CO2R’)、氨基甲酰(-OC(=O)NR’R”或-NRC(=O)OR’)、 羥基(-OH)、異氰基(-NC)、磺酸基(-S(=O)2OR)、磺胺基(-S(=O)2NRR’ 或–NRS(=O)2R’)或磺酰基(-S(=O)2R),其中,R或R’的每個均獨立地選自 H、C1-C6烷基或雜芳基、C2-C6烯基或雜烯基、2C-6C炔基或雜炔基、芳基 或雜芳基。取代的基團可具有,例如1、2、3、4、5、6、7、8或9個取代基。
如文中使用,術語“雜環基、雜環或Het”表示環狀雜烷基或雜烯 基,即例如3元、4元、5元、6元或7元環,除非另外說明,包括一個、兩 個、三個或四個獨立地選自由氮、氧和硫組成的組中的雜原子。5元環具有0 至2個雙鍵,并且6元和7元環具有0至3個雙鍵。術語“雜環基”還表示 具有橋接的多環結構的雜環化合物,其中,一個或多個碳和/或雜原子橋接單 環的兩個非相鄰的成員,例如奎寧環基。術語“雜環”包括雙環、三環和四 環基團,其中,上述雜環的任一個稠合到一個、兩個或三個碳環,例如芳環、 環己烷環、環己烯環、環戊烷環、環戊烯環或另一個單環雜環,例如吲哚基、 喹啉基、異喹啉基、四氫喹啉基、苯并呋喃基、苯并噻吩基等。
本發明的一些化合物可包括一個或多個立體異構中心,并因此可以 各種同分異構形態存在,例如立體異構體和/或非對映體。因此,本發明的化 合物以及其藥物組合物可為單個的對映異構體、非對映異構體或幾何異構體 的形態,或可為立體異構體的混合物的形態。在某些實施方式中,本發明的 化合物為對映體純化合物。在某些其它實施方式中,提供了立體異構體或非 對映異構體的混合物。此外,當本發明的混合物以互變異構體的形態存在時, 文中包含每種互變異構體。
此外,文中所述的某些化合物可具有一個或多個以Z或E同分異構 體存在的雙鍵,除非另外表明。本發明還包括基本不含有其它異構體的單個 異構體的化合物,以及備選地,作為各種同分異構體的混合物,例如立體異 構體的外消旋混合物。除了上述化合物自身,本發明還包括這些化合物的藥 學上可接受的衍生物,并且所述組合物包括一種或多種本發明的化合物以及 一種或多種藥學上可接受的賦形劑或添加劑。
處理方法
如文中所述,鑒定miR-1908、miR-199a-3p、miR-199a-5p和CTGF為黑 素瘤中轉移性侵襲、內皮募集和定植的內源轉移促進子,而DNAJA4、ApoE、 LRP1、LRP8、LXR和miR7的功能為同一過程的轉移抑制子或抑制物。此 外,發現這些miRNA會聚地靶向ApoE和熱激因子DNAJA4。癌癥分泌的 ApoE通過活化黑素瘤細胞LRP1和內皮LRP8受體而分別抑制侵襲和內皮募 集。然后,DNAJA4誘導ApoE的表達。這些miRNA強烈地預測了人轉移 的結果。用靶向miR-199a-3p、miR-199a-5p和miR-1908的鎖核酸(LNA) 預處理抑制了至多個器官的轉移,而這些LNA的治療性遞送顯著地抑制了 小鼠模型中人黑素瘤細胞的轉移。
因此,本發明提供了通過提高受試者中轉移抑制子之一的表達水平或活 性水平而治療黑素瘤的方法。其中,通過一種或多種代謝抑制子DNAJA4、 ApoE、LRP1和LRP8的強制表達或降低miR-199a-3p、miR-199a-5p和 miR-1908的一個或多個的表達水平或活性水平,而獲得增加。此外,可通過 降低一個或多個轉移促進子的表達水平或活性水平而獲得治療。
本發明還提供了治療受試者中血管生成障礙或血管生成疾病的方法。術 語“血管生成障礙”、“血管生成的疾病”和“血管生成疾病”在文中可交換 地使用,并指以病理性血管生成為特征的疾病。以病理性血管生成為特征的 疾病是指其中反常的或異常的血管生成單獨或與其它結合促成了疾病的原 因、起源或癥狀的疾病。該病癥的實例包括各種癌癥(例如血管化的腫瘤)、 眼科疾病、炎癥和其它。
可用所述方法治療的典型的血管化的腫瘤包括實體瘤,特別是從上皮組 織中發展而來的惡性腫瘤(carcinomas),其需要供應氧和營養的血管組分。 示例性實體瘤包括但不限于肺癌、乳腺癌、骨癌、卵巢癌、胃癌、胰腺癌、 喉癌、食道癌、睪丸癌、肝癌、腮腺癌、膽道癌、結腸癌、直腸癌、宮頸癌、 子宮癌、子宮內膜癌、腎癌、膀胱癌、前列腺癌、甲狀腺癌、鱗狀細胞癌、 腺癌、小細胞癌、黑素瘤、膠質瘤、膠質母細胞瘤、神經母細胞瘤、卡波濟 肉瘤、肉瘤。
除了癌癥,還可用上述方法治療大量疾病和病癥。實例包括關節炎、風 濕性關節炎、牛皮癬、動脈粥樣硬化、糖尿病性視網膜病變、老年性黃斑變 性、格雷夫斯病、血管再狹窄(包括血管形成術后的再狹窄)、動靜脈畸形 (AVM)、腦膜瘤、血管瘤、新生血管性青光眼、慢性腎病、糖尿病性腎病、 多囊性腎病、間質性肺病、肺動脈高血壓、慢性阻塞性肺病(COPD)、肺氣 腫、自身免疫性肝炎、慢性炎癥性肝病、肝硬化、皮膚T細胞淋巴瘤、紅斑 痤瘡和基底細胞癌。
其它治療的靶標包括例如美國申請2009004297、20090175791和 20070161553中描述的那些,例如血管纖維瘤、動脈粥樣硬化斑塊、角膜移 植新血管形成、血友病性關節炎、增生性瘢痕、奧-韋伯綜合征、化膿性肉芽 腫晶狀體后纖維增生癥、硬皮病、沙眼、血管粘連、滑膜炎、皮炎、其它各 種炎性疾病和病癥及子宮內膜異位癥。
轉移抑制子的強制性表達
上述轉移抑制子(例如DNAJA4、ApoE、LRP1、LRP8和LXR)的多肽 和編碼所述多肽的核酸均可用于實施本發明。當可使用許多多肽制劑時,優 選高度純化或分離的多肽。文中可交換地使用的術語“肽”、“多肽”和“蛋 白質”,以描述聚合物中的氨基酸的排列。除了稀有氨基酸以及合成的氨基酸 類似物,肽、多肽或蛋白質可由標準的20種天然產生的氨基酸組成。它們可 為氨基酸的任何鏈,不考慮長度或翻譯后修飾(例如糖基化或磷酸化)。
“本發明”的多肽包括重組或合成產生的任何上述轉移抑制子的融 合或嵌合的形式,具有所述網絡涉及的特定的結構域或部分。該術語還包括 具有增加的氨基末端蛋氨酸(用于在原核細胞中表達)的多肽。
在本發明的范圍內,融合蛋白包括一條或多條上述序列以及異源序列。 “嵌合的”或“融合的”是指不同來源的氨基酸序列通過它們的編碼核苷酸 序列在閱讀框內的組合而在一條多肽鏈中組合。該術語明確地包括內部融合, 即除了融合到其一個末端,在多肽鏈內插入不同來源的序列。異源的多肽、 核酸或基因是起源于外來物種的一種,或者如果來自相同的物種,則與其原 型相比,大幅地被修飾。兩個融合的結構域或序列如果在天然產生的蛋白質 或核酸中彼此不鄰近,則彼此異源。
“分離的”或“純化的”多肽是指已經從與它天然關聯的其它蛋白 質、脂質和核酸分離的多肽。多肽可構成純化制劑的干重的至少10%(即10% 和100%之間任何的百分比,例如20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、 85%、90%、95%和99%)。可通過任何合適的標準方法,例如通過柱色譜、聚 丙烯酰胺凝膠電泳或HPLC分析測量純度。可從天然來源純化,通過重組 DNA技術或通過化學方法生產本發明中描述的分離的多肽。
“重組的”多肽是指通過重組DNA技術產生的多肽;即由編碼期 望的多肽的外源DNA構建物轉化的細胞產生。“合成的”多肽是指通過化學 合成制備的多肽。涉及例如細胞、核酸、蛋白質或載體時,術語“重組的” 表示細胞、核酸、蛋白質或載體已經通過引入外源核酸或蛋白質或者改變天 然核酸或蛋白質而被修飾,或者細胞來自這樣修飾的細胞。
“過表達”是指引入到宿主細胞的核酸編碼的RNA或多肽的表達, 其中,所述RNA或多肽或蛋白質通常不存在于宿主細胞中,或者,其中, RNA或多肽以比編碼RNA或多肽的內源基因通常表達高的水平存在于所述 宿主細胞中。
上述多肽的每條的氨基酸組成可變化,而不破壞它們的功能-上調上述 網絡的能力(例如,提高ApoE/LRP信號通路的激活水平),從而抑制到多個 器官的轉移。例如,它可包含一個或多個保守的氨基酸取代。“保守的氨基酸 取代”是氨基酸殘基被具有相似側鏈的氨基酸殘基取代。在本領域中已經定 義了具有相似的側鏈的氨基酸殘基的家族。這些家族包括具有堿性側鏈的氨 基酸(例如賴氨酸、精氨酸、組氨酸)、酸性側鏈的氨基酸(例如天冬氨酸、 谷氨酸)、不帶電荷的極性側鏈的氨基酸(例如甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、 絲氨酸、蘇氨酸、酪氨酸、半胱氨酸)、非極性側鏈的氨基酸(例如,丙氨酸、 纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、蛋氨酸、色氨酸)、β分支 側鏈的氨基酸(例如蘇氨酸、纈氨酸、異亮氨酸)和芳族側鏈的氨基酸(例 如酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、組氨酸)。因此,優選用來自相同側鏈家族的 另一種氨基酸殘基取代上述多肽(例如SEQ ID NO:2、4、6、8、10、12、 14、16和18)的一條中的預計的非必需氨基酸殘基。備選地,可沿全部或部 分的序列隨機引入突變,例如通過飽和誘變,并且可篩選產生的突變體上調 上述網絡或ApoE/LRP信號通路以及引發各個細胞反應的能力,以識別保持 在下面的實施例中描述的活性的突變體。
本發明的多肽的功能等價物是指多肽的衍生物,例如具有一個或多個點 突變、插入、刪除、截斷的蛋白質、融合蛋白或其組合。它基本保持了上述 多肽的活性。本發明的分離多肽可包括SEQ ID NO:2、4、6、8、10、12、 14、16和18的一條的序列或其功能等價物或其片段。通常,功能等價物與 SEQ ID NO:2、4、6、8、10、12、14、16和18的一條至少75%(例如75% 與100%之間的任何數,包括例如70%、80%、85%、90%、95%和99%)的 同一性。
可以重組多肽形式獲得本發明描述的多肽。為制備重組多肽,編碼它的 核酸可連接到編碼融合配偶體的另一個核酸,例如谷胱甘肽-s-轉移酶(GST)、 6×His表位標簽或M13基因3蛋白質。產生的融合核酸在合適的宿主細胞中 表達可通過本領域中已知的方法分離的融合蛋白。可進一步處理分離的融合 蛋白,例如通過酶切,以去除融合配偶體,并獲得本發明的重組多肽。備選 地,可化學合成本發明的多肽(參見,例如Creighton,“Proteins:Structures and  Molecular Principles,”W.H.Freeman&Co.,NY,1983)。對于另外的指南,技 術人員可查閱Ausubel等人(Current Protocols in Molecular Biology and Short  Protocols in Molecular Biology,3rd Ed.1987&1995),Sambrook et al. (Molecular Cloning,A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Press,Cold  Spring Harbor,NY,1989)以及chemical synthesis Gait,M.J.Ed.(Oligonucleotide  Synthesis,IRL Press,Oxford,1984)。
歸因于它們作為細胞蛋白或膜蛋白的功能,DNAJA4、LRP1、LRP8和 LXR可與一條或多條包括細胞穿膜肽(CPP)序列等的氨基酸序列相關聯(例 如連接到或融合到)。這樣,如下面所述的本發明的組合物可包括轉運增強子。 細胞穿膜肽(CPP)通常由少于30個氨基酸組成,并具有凈正電荷。CPP以 內吞或受體/能量獨立的方式在活的動物細胞中內化。有數類具有各自來源的 CPP,由全部由蛋白衍生的CPP經嵌合的CPP到完全合成的CPP。本領域中 已知CPP的實例。參見,例如U.S申請No.20090099066和20100279918。 已知CPP可遞送各自外源蛋白質到各種細胞中。
上述多肽的天然產生的版本、遺傳工程版本和化學合成版本全部可用于 實施文中公開的本發明。通過重組DNA技術獲得的多肽可具有與天然產生 的版本相同的氨基酸序列(例如,SEQ ID NO:2、4、6、8、10、12、14、 16和18的一條)或其功能等價物。它們還包括化學修飾版本。化學修飾多 肽的實例包括發生構象改變、增加或刪除側鏈的多肽,以及已經結合例如聚 乙二醇的化合物的那些多肽。一旦通過標準的方法,或根據下面實施例中描 述的方法或本領域中已知的其它方法純化和檢測,那么所述多肽可包含在合 適的組合物中。
為了表達上述因子,本發明提供了編碼上述多肽的任一條的核酸。優選 地,分離和/或純化核苷酸序列。核酸是指DNA分子(例如但不限于cDNA 或基因組DNA)、RNA分子(例如但不限于mRNA)或DNA或RNA類似 物。可由核苷酸類似物合成DNA或RNA類似物。核酸分子可為單鏈或雙鏈。 “分離的核酸”為其結構與任何天然產生的核酸或天然產生的基因組核酸的 任何片段不同的核酸。因此,該術語包括,例如(a)具有天然產生的基因組 DNA分子的一部分序列的DNA,但是其兩側均不是其天然產生的生物體的 基因組中所述分子的所述部分兩側的編碼序列;(b)以產生的分子不與任何 天然產生的載體或基因組DNA相同的方式,整合到載體或原核生物或真核 生物的基因組DNA中的核酸;(c)分離的分子,例如cDNA、基因組片段、 通過聚合酶鏈式反應(PCR)產生的片段或限制酶切片段;和(d)為雜交基 因(即編碼融合蛋白的基因)的一部分的重組核酸序列。
術語“RNA”、“RNA分子”和“核糖核酸分子”文中可交換使用,并指 核糖核苷酸的聚合物。術語“DNA”或“DNA分子”或“脫氧核糖核酸” 是指脫氧核糖核苷酸的聚合物。可自然地合成DNA和RNA(例如分別通過 DNA復制或DNA的轉錄)。RNA可被轉錄后修飾。還可化學合成DNA和 RNA。DNA和RNA可為單鏈(即分別為ssRNA和ssDNA),或多鏈(例如 雙鏈,即分別為dsRNA和dsDNA)。
本發明還提供了具有一個或多個文中所述的核苷酸序列的重組構建物。 所述構建物的實例包括載體,例如本發明的核酸序列正向或反向插入其中的 質粒或病毒載體。在優選的實施方式中,所述構建物進一步包括調控序列, 包括有效地連接到所述序列的啟動子。本領域技術人員已知大量的合適的載 體和啟動子,并且可商購。還在Sambrook等人(2001,Molecular Cloning:A  Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Press)中描述了原核宿主和真核宿主 使用的合適的克隆和表達載體。
表達載體的實例包括染色體的、非染色體的和合成的DNA序列, 例如猴病毒40(SV40)、細菌質粒、噬菌體DNA、桿狀病毒、酵母質粒、衍 生自質粒和噬菌體DNA的組合的載體、病毒DNA(例如牛痘、腺病毒、雞 痘病毒)和偽狂犬病,或者它們的衍生物。然而,可使用任何其它載體,只 要它可在宿主中復制并存活。可通過各種方法將合適的核酸序列插入到載體 中。通常,編碼上述多肽的一條的核酸序列可通過本領域已知的方法插入到 合適限制性內切酶的位點。這樣的方法和相關的亞克隆方法在本領域技術人 員的能力范圍內。
上述表達載體中的核酸序列優選有效地連接到合適的轉錄控制序列(啟 動子),以指導mRNA合成。這樣的啟動子的實例包括:逆轉錄病毒長末端 (LTR)或SV40啟動子,大腸桿菌(E.coli)lac或trp啟動子,噬菌體λ PL啟動子以及其它已知在原核細胞或真核細胞或病毒中控制基因表達的啟 動子。表達載體還包括用于翻譯起始的核糖體結合位點以及轉錄終止子。載 體包括用于擴大表達的合適的序列。此外,優選地,表達載體包括一個或多 個可選擇的標記基因,以為選擇轉化的宿主細胞提供表型性狀,例如對于真 核細胞培養物的二氫葉酸還原酶或抗新霉素,或者例如大腸桿菌中四環素或 氨芐青霉素抗性。
可使用包含合適的如文中所述的核酸序列以及合適的啟動子或控制序列 的載體轉化合適的宿主,以允許宿主表達上述多肽。在基因治療中可使用這 樣的載體。合適的表達宿主的實例包括細菌細胞(例如大腸桿菌、鏈霉菌屬 (Streptomyces)、鼠傷寒沙門氏菌(Salmonella typhimurium))、真菌細胞(酵 母)、昆蟲細胞(例如果蠅(Drosophila)和草地貪夜蛾(Spodoptera frugiperda) (Sf9))、動物細胞(例如CHO、COS和HEK 293)、腺病毒和植物細胞。合 適宿主的選擇在本領域技術人員的能力范圍內。在一些實施方式中,本發明 提供了通過用具有編碼所述多肽的一條的核酸序列的表達載體轉染宿主細胞 而產生上述多肽的方法。然后,在允許多肽表達的合適的條件下培養宿主細 胞。
轉移促進子(promoter)的降低的表達或活性水平
如上所述,在黑素瘤治療中可使用降低miR-199a-3p、miR-199a-5p、 miR-1908或CTGF的表達或活性水平的抑制子。抑制劑(即抑制子)可為核 酸、多肽、抗體或小分子化合物。在一個實例中,抑制子在轉錄、mRNA穩 定性、翻譯、蛋白質穩定性/降解、蛋白修飾和蛋白質結合的水平起作用。
核酸抑制子可編碼靶向上述基因(例如CTGF)的一個或多個的小干擾 RNA(例如RNAi劑),并抑制其表達或活性。術語“RNAi劑”是指RNA 或其類似物,其具有與靶RNA充分的序列互補性,以指導RNA干擾。實例 還包括可用于生成RNA的DNA。RNA干擾(RNAi)是指序列特異或選擇 的過程,通過該過程下調了靶分子(例如靶基因、蛋白或RNA)。通常,干 擾RNA(“iRNA”)是雙鏈的短干擾(siRNA)、短發卡RNA(shRNA)或 單鏈微小RNA(miRNA),其導致特定mRNA的催化降解,還可用于降低或 抑制基因表達。
術語“短干擾RNA”或“siRNA”(還稱為“小干擾RNA”)是指 RNA劑,優選雙鏈制劑,具有約10~50個核苷酸的長度,優選約15~25個核 苷酸的長度,更優選約17、18、19、20、21、22、23、24或25個核苷酸的 長度,所述鏈任選地具有包括例如1、2或3個突出的核苷酸(或核苷酸類似 物)的突出的末端,其能夠指導或介導RNA干擾。天然產生的siRNA通過 細胞的RNAi機制(例如Dicer或其同系物)由更長的dsRNA分子(例如>25 個核苷酸的長度)產生。
術語“miRNA”或“microRNA”是指RNA劑,優選單鏈劑,具有 約10~50個核苷酸的長度,優選約15~25個核苷酸之間的長度,更優選約17、 18、19、20、21、22、23、24或25個核苷酸的長度,其能夠指導或介導RNA 干擾。天然產生的miRNA通過Dicer由莖環前體RNA(即pre-miRNA)產 生。如文中使用,術語“Dicer”包括Dicer以及能夠加工dsRNA結構成siRNA、 miRNA、siRNA樣或miRNA樣分子的任何Dicer直系同源物或同系物。基 于已經發現天然產生的microRNA(或“miRNA”)以短暫的方式(例如在發 育的過程中)表達的事實,術語microRNA(或“miRNA”)與術語“小的短 暫RNA”(或“stRNA”)可交換地使用。
如文中使用,術語“shRNA”是指具有莖環結構的RNA劑,其包括互 補序列的第一區域和第二區域,互補的程度以及區域的方向足以使堿基對出 現在區域之間,第一區域和第二區域被環區域連接,環由環區域中的核苷酸 (或核苷酸類似物)之間缺少堿基配對而產生。
在本發明的范圍內,利用以RNA分子(例如在細胞內)的降解為特征 的RNAi。由酶促RNA誘導的沉默復合體(RISC)催化降解。RNA劑具有 足以與靶RNA序列(例如上述CTGF基因)互補的序列以指引RNAi的意 思是RNA劑具有與靶RNA序列至少50%的同源性(例如50%、60%、70%、 80%、90%、95%、98%、99%或100%的同源性),使得兩條序列彼此充分地 互補,以雜交,并引發利用RNAi機制(例如RISC復合物)或過程的對靶 RNA的破壞。RNA劑具有“足以與靶RNA序列充分互補的序列,以指引 RNAi”還意味著RNA劑具有通過RNAi機制或過程足以引發靶RNA的翻譯 抑制的序列。RNA劑還可具有充分地與靶DNA序列編碼的靶RNA序列互 補的序列,使得靶DNA序列染色體(chromatically)沉默。換句話說,RNA 劑具有足以誘導轉錄的基因沉默的序列,例如通過在靶DNA序列或其附近 引起染色質結構的變化而下調靶基因或其附近的基因表達。
可使用本領域中已知的聚合的、可生物降解的微粒或微膠囊遞送裝置遞 送上述多核苷酸。獲得多核苷酸的吸收的另一種方式是使用標準方法制備的 脂質體。多核苷酸可單獨結合到這些遞送載體中,或與組織特異的抗體共結 合。備選地,可制備由通過靜電力或共價力連接到多聚-L-賴氨酸的質粒或其 它載體組成的分子綴合物。多聚-L-賴氨酸結合到可結合到靶細胞上的受體的 配體(Cristiano,et al.,1995,J.Mol.Med.73:479)。備選地,可通過使用本領 域中已知的組織特異的轉錄調控元件獲得組織特異的靶向。遞送裸露的DNA (即不用遞送載體)到肌肉內、皮膚內或皮下位點是獲得體內表達的另一種 方式。
可利用本領域中公知的方法設計siRNA、miRNA和asRNA(反義RNA) 分子。可使用本領域中已知的程序(包括但不限于由AMBION,Inc.和 DHARMACON,Inc在網上維護的那些)設計具有足以提供特異地降解任何 RNA所需要的序列特異性的同源性的siRNA、miRNA和asRNA分子。本領 域技術人員可常規地進行數種用于優化siRNA、miRNA和asRNA序列的設 計種類的系統檢測。設計短的干擾核酸分子的考慮包括但不限于生物物理、 熱動力學和結構的考慮,在正義鏈的特定位置的堿基偏好性以及同源性。本 領域中熟知這些考慮,并提供了設計上述RNA分子的指南。
本發明的反義多核苷酸(優選DNA)可為任何反義多核苷酸,只要它具 有與編碼上述網絡的成分的基因的堿基序列互補或實質上互補的堿基序列。 所述堿基序列與編碼多肽的基因的互補物具有至少約70%、80%、90%或95% 的同源性。可使用DNA合成儀合成這些反義DNA。
本發明所述的反義DNA可包含帶電荷的或修飾的糖、堿基或連接。還 可以特定的形式(例如脂質體、微球)提供所述反義DNA以及上述RNAi 劑,或者可用于基因治療,或者可以連接的部分組合提供。這樣的連接的部 分包括多聚陽離子(例如作用為磷酸骨架的電荷中和劑的聚賴氨酸)或疏水 部分(例如增強與細胞膜的相互作用或提高核酸的攝取的脂質(例如磷脂、 膽固醇等))。將被連接的脂質的優選實例為膽固醇或其衍生物(例如膽固醇 氯甲酸酯、膽酸等)。這些部分可連接到核酸的3'或5'端,并可通過堿基、糖 或分子內核酸連接連接其上。其它部分可為特異地置于核酸的3'或5'端的端 封基團,以防止被例如核酸外切酶、RNAase等降解。這樣的端封基團包括 但不限于本領域中已知的羥基保護基團,包括醇類,例如聚乙二醇、四乙二 醇等。可使用本發明的基于細胞系或動物的基因表達系統體內或體外檢測反 義DNA的抑制作用。
可在用于體外或體內遞送到細胞的載體中克隆編碼上述一種或多種多肽 的核酸或RNAi劑。對于體內用途,遞送可靶向特定的組織或器官(例如皮 膚)。靶向遞送涉及使用在全身施予后靶向特定器官或組織的載體(例如器官 歸巢(organ-homing)肽)。例如,載體可具有生物素結合蛋白的共價綴合物 和靶向肝臟特異的蛋白質的單克隆抗體。
在某些實施方式中,本發明提供了用于體內表達上述轉移抑制子的方法。 這樣的方法將通過引入編碼所述因子的任一種的核酸序列到需要抑制內皮募 集、癌癥細胞侵襲或轉移性血管生成的人或非人動物的細胞或組織中而獲得 其治療效果。可使用充分表達載體(例如嵌合病毒或膠體分散系統)實現核 酸序列的遞送。優選的核酸序列的治療性遞送為使用靶向的脂質體。
可用于文中公開的基因治療的各種病毒載體包括腺病毒、腺伴隨病毒 (AAV)、皰疹病毒、牛痘,或優選地,RNA病毒,例如逆轉錄病毒和慢病 毒。優選地,所述逆轉錄病毒載體為慢病毒或鼠和禽逆轉錄病毒的衍生物。 其中可插入單個外源基因的逆轉錄病毒載體的實例包括但不限于:莫洛尼鼠 白血病病毒(MoMuLV)、Harvey鼠肉瘤病毒(HaMuSV)、鼠類乳癌病毒 (MuMTV)和勞斯氏肉瘤病毒(RSV)。許多另外的逆轉錄病毒載體可整合 多個基因。
全部這些載體可轉移或包含選擇性標記的基因,使得可識別和產生轉化 的細胞。可通過連接例如糖、糖脂或蛋白質而制造靶特異性的逆轉錄病毒載 體。通過使用靶特異性抗體或在靶中具有受體的激素而實現優選的靶向。本 領域技術人員理解,特異的多核苷酸序列可插入到逆轉錄病毒基因組中,或 連接到病毒包膜,以允許逆轉錄病毒載體的靶特異性遞送。
用于遞送核酸的另一個靶向系統為膠狀分散系統。膠狀分散系統包括高 分子復合物、納米膠囊、微球、珠子,以及基于脂質的系統(包括水包油乳 劑、微膠粒、混合的微膠粒和脂質體)。本發明優選的膠體系統為脂質體。脂 質體為用作體外和體內遞送載體的人造膜載體。RNA、DNA和完整的病毒 體可在水性環境內封裝并以生物活性形態遞送到細胞。本領域中已知使用脂 質體載體有效轉移基因的方法。脂質體的組成通常為磷脂(通常與類固醇, 特別是膽固醇結合)的組合。還可使用其它磷脂或其它脂質。脂質體的物理 特性依賴于pH、離子強度和二價陽離子的存在。
用在脂質體生產中的脂質的實例包括磷脂酰化合物,例如磷脂酰甘油、 磷脂酰膽堿、磷脂酰絲氨酸、磷脂酰-乙醇胺、鞘脂類、腦苷脂類和神經節苷 脂。示例的磷脂包括卵磷脂酰膽堿、二棕櫚酰磷脂酰膽堿和雙硬脂酰-磷脂酰 膽堿。脂質體的靶向還可能基于,例如器官特異性、細胞特異性和細胞器特 異性并且是本領域中已知的。
當體內使用時,期望使用可逆的遞送表達系統。為此,可使用Cre-loxP 或FLP/FRT系統和其它相似的系統以可逆地遞送-表達一種或多種上述核酸。 參見WO2005/112620、WO2005/039643、美國申請20050130919、 20030022375、20020022018、20030027335和20040216178。具體地,可使用 美國申請NO.20100284990中描述的可逆的遞送-表達系統,以提供選擇性的 或緊急的停止(shut-off)。
在另一個實施例中,上述抑制子可為多肽或蛋白質復合體,例如抗體。 術語“抗體”是指免疫球蛋白分子或其免疫活性部分,即抗原結合部分。實 例包括但不限于具有至少一條或兩條重鏈(H)可變區(VH)以及至少一條 或兩條輕鏈(L)可變區(VL))的蛋白質。所述VH和VL區域可進一步分成 稱為“互補決定區”(“CDR”)的高可變性的區域,中間散布稱為“框架區” (FR)的更保守的區域。如文中使用,術語“免疫球蛋白”是指由一條或多 條基本由免疫球蛋白基因編碼的多肽組成的蛋白質。已知的人免疫球蛋白基 因包括κ、λ、α(IgA1和IgA2)、γ(IgG1、IgG2、IgG3和IgG4)、δ、ε和μ 恒定區基因,以及無數的免疫球蛋白可變區基因。
術語抗體的“抗原結合部分”(或“抗體部分”)是指保持特異地結合抗 原的能力的一個或多個抗體片段(例如LRP1、LRP8和CTGF)。已經顯示, 可通過全長的抗體的片段執行抗體的抗原結合功能。術語抗體的“抗原結合 部分”包括的結合片段的實例包括(i)Fab片段,其是由VL、VH、CL和CH1 結構域組成的單價片段;(ii)F(ab')2片段,其是包括通過在鉸鏈區的二硫鍵 連接的兩個Fab片段的二價片段;(iii)由VH和CH1結構域組成的Fd片段; (iv)由抗體單臂的VL和VH結構域組成的Fv片段,(v)dAb片段(Ward et  al.,(1989)Nature 341:544-546),其由VH結構域組成;以及(vi)分離的互補 決定區(CDR)。此外,雖然Fv片段的兩個結構域VL和VH由單獨的基因編 碼,可使用重組方法通過合成的連接子連接它們,合成的連接子使它們成為 其中VL和VH區域配對以形成單價分子的的單個蛋白質鏈(稱為單鏈Fv (scFv);參見例如Bird et al.(1988)Science 242:423-426;和Huston et al.(1988) Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85:5879-5883)。這樣的單鏈抗體也包含在術語抗體 的“抗原結合部分”的范圍內。使用本領域技術人員已知的常規技術獲得這 些抗體片段,并篩選片段用于以與完整抗體相同的方式使用。
可使用本領域中已知的方法制造特異性結合上述靶蛋白質(例如CTGF) 的一種的抗體。該抗體可為多克隆或單克隆抗體。在一個實施方式中,抗體 可由組產生,例如通過噬菌體展示或組合方法產生。在另一個實施方式中, 抗體是全人抗體(例如,在小鼠中產生的抗體,所述小鼠已經被基因工程化, 以產生來自人免疫球蛋白序列的抗體)、人源化抗體或非人類抗體,例如但不 限于嚙齒動物(小鼠或大鼠)、山羊、靈長類動物(例如但不限于猴)、兔或 駱駝抗體。產生抗體的人源化版本的方法的實例包括但不限于CDR移植 (Queen et al.,美國專利No.5,585,089;Riechmann et al.,Nature 332:323 (1988))、鏈替換(美國專利No.5,565,332);和鑲合(veneering)或重塑 (resurfacing)(EP 592,106;EP 519,596);Padlan,Molecular Immunology 28(415):489-498(1991);Studnicka et al.,Protein Engineering 7(6):805-814 (1994);Roguska.et al.,PNAS 91:969-973(1994))。產生全人抗體的方法的實 例包括但不限于從表達人免疫球蛋白基因的小鼠中產生抗體,以及使用噬菌 體展示技術以產生和篩選人免疫球蛋白基因文庫。
“分離的抗體”指基本不含有具有不同的抗原特異性的抗體(例如, 特異地結合CTGF的分離的抗體基本不含有特異地結合除了這樣的抗原的抗 原的抗體)。此外,分離的抗體可基本不含有其它細胞物質和/或化學物質。
如文中使用,術語“單克隆抗體”或“單克隆抗體組合物”是指具有單 一分子組成的抗體分子的制備物。單克隆抗體組合物顯示單一的結合特異性, 以及對特定表位的親和性。
如文中使用,術語“人抗體”包括具有可變區的抗體,其中,框架區和 CDR區均衍生自人種系免疫球蛋白序列。此外,如果抗體包括恒定區,則恒 定區也衍生自人種系免疫球蛋白序列。本發明的人抗體可包括非人類種系免 疫球蛋白序列編碼的氨基酸殘基(例如通過體外隨機或位點特異誘變或通過 體內體細胞突變引入的突變)。然而,如文中使用,術語“人抗體”不包括其 中衍生自另一種哺乳動物種類(例如小鼠)的種系的CDR序列已經被移植 到人框架序列的抗體。
術語“人單克隆抗體”是指顯示單一結合特異性的抗體,其具有其中框 架區和CDR區域都衍生自人種系免疫球蛋白序列的可變區。在一個實施方 式中,通過雜交瘤(其包括從轉基因非人動物(例如轉基因小鼠)獲得的B 細胞產生人單克隆抗體,其具有包括融合到永生化細胞的人重鏈轉基因和輕 鏈轉基因的基因組。
如文中使用,術語“重組人抗體”包括通過重組方式制備、表達、創制 或分離的全部的人類抗體,例如(a)從轉基因或轉染色體人免疫球蛋白基因 的動物(例如小鼠)或從其制備的雜交瘤(下面進一步描述)分離的抗體,(b) 從轉化表達人抗體的宿主細胞(例如從轉染瘤)分離的抗體,(c)從重組的、 組合的人類抗體文庫分離的抗體,以及(d)通過涉及人免疫球蛋白基因序列 拼接到其它DNA序列的任何其它方式制備、表達、創制或分離的抗體。這 樣的重組人類抗體具有其中框架區和CDR區衍生自人類種系免疫球蛋白的 列的可變區。然而,在某些實施方式中,這樣的重組人類抗體可經體外誘變 (或者,當使用轉基因人類Ig序列的動物時,體內體細胞突變),因此重組 抗體的VH和VL區域的氨基酸序列為雖然衍生自人種系VH和VL序列或與人 種系VH和VL序列相關,但是可能未天然地存在于體內的人類抗體種系組庫 (repertoire)中的序列。
如文中使用,“同種型”是指由重鏈恒定區基因編碼的抗體種類(例如 IgM或IgG1)。短語“識別抗原的抗體”和“對于抗原特異的抗體”與術語 “特異地結合抗原的抗體”在文中可交換地使用。如文中使用,術語IgG抗 體的“高親和力”是指抗體對靶抗原具有10-7M或更小,優選10-8M或更小, 更優選10-9M或更小,甚至更優選10-10M或更小的KD。然而,“高親和力” 結合對于其它抗體同種型也可變化。例如,對于IgM同種型的“高親和力” 結合是指抗體具有10-7M或更小,更優選10-8M或更小的KD
在一個實施例中,組合物包括中和CTGF的單克隆抗體。在一個實施方 式中,該抗體可為全人抗體、人源化的抗體或非人類抗體,例如但不限于嚙 齒動物(小鼠或大鼠)、山羊、靈長類(例如但不限于猴)、兔或駱駝抗體。 在一個實施方式中,該單克隆抗體的一個或多個氨基酸可被取代,以改變其 物理性質。這些性質包括但不限于結合特異性、結合親和性、免疫原性和抗 體同種型。包含上述抗體的全人類本或人源化版本的藥物組合物可用于治療 黑素瘤或防止內皮募集、癌細胞侵襲或轉移性血管生成。
如文中使用,“受試者”是指人或非人類的動物。非人類動物的實例包括 全部的脊椎動物,例如哺乳動物(例如非人類的哺乳動物、非人類的靈長類 (尤其是更高等的靈長類)、狗、嚙齒動物(例如小鼠或大鼠)、豚鼠、貓和 兔,以及非哺乳類,例如禽、兩棲動物、爬行動物等。在一個實施方式中, 受試者是人。在另一個實施方式中,受試者是實驗動物或適于作為疾病模型 的動物。可通過標準的診斷疾病的技術識別將被治療病癥的受試者。任選地, 可通過本領域中已知或者上述治療前的方法檢查受試者的上述miR-199a-3p、 miR-199a-5p、miR-1908和CTGF的一種或多種的突變、表達水平或活性水 平。如果受試者具有基因的特定突變,或者如果基因表達或活性水平例如在 來自受試者的樣本中大于來自正常人的樣本中,則該受試者是用于本發明的 治療的候選。
為證實抑制或治療,可在給藥步驟前/后使用本領域中已知的技術評估和 /或核實內皮募集或造成的血管生成的抑制。示例的技術包括血管造影術或動 脈造影,其是用于顯現身體的血管和器官的內部或內腔的醫學成像技術,通 常可通過注射無線電不透明的造影劑到血管中并使用基于X射線的技術(例 如熒光檢查)進行成像而進行。
如文中使用的“治療”或“處理”是指施予化合物或制劑給患有疾病的 受試者,目的為治愈、減輕、緩解、補救、延遲發作、預防或改善所述疾病、 疾病的癥狀、所述病癥的繼發性疾病狀態,或得所述病癥的傾向。“有效量” 或“治療有效量”是指化合物或制劑能夠在治療的受試者中產生醫學期望的 結果的量。可體內或離體進行進行治療方法,單獨地或與其它藥物或治療結 合。可在一次或多次給藥、應用或劑量中施予治療有效量,并且不限于具體 的劑型或給藥路徑。
如文中使用,表述“有效量”是指本發明的化合物足以呈現期望的治療 效果的量。需要的確切的量將根據受試者的種類、年齡和一般狀況、具體的 治療劑等而在受試者之間變化。為了易于給藥以及劑量的均勻,本發明的化 合物優選以劑量單位形態配制。如文中使用,表述“劑量單位形式”是指適 于被治療的患者的治療劑的物理上分開的單位。然而,應理解,應由主治醫 生在健全的醫療判斷的范圍內決定本發明的化合物和組合物的總的每日使 用。對于任何特定患者或器官的具體的治療有效劑量水平將依賴于各種因素, 包括被治療的病癥以及病癥的嚴重性,使用的具體化合物的抗癌活性,使用 的具體的化合物,患者的年齡、體重、總體健康狀況、性別和飲食,給藥的 時間,給藥路徑,以及使用的具體的化合物的排泄率,治療的持續時間,與 使用的具體化合物結合或一致使用的藥物以及本領域中公知的類似因素。
可體內或離體施予治療劑,單獨地或與與其它藥物或治療結合的共施予 (即聯合療法)。如文中使用,術語“共施予”或“共施予的”是指施予至少 兩種制劑或治療給受試者。例如,在腫瘤(尤其是血管化的惡性腫瘤)的治 療中,可單獨使用所述制劑,或與例如化療、放療、細胞凋亡、抗血管生成 制劑和/或免疫毒素或共凝集配體(coaguligand)結合施予所述制劑。在一些 實施方式中,共施予兩種或更多種制劑/治療是并行的。在其它實施方式中, 在第二制劑/治療前施予第一制劑/治療。本領域技術人員理解,使用的各種 制劑/治療的劑型和/或給藥路徑可變化。
在體內方法中,施予化合物或制劑給受試者。通常,化合物懸浮在藥學 可接受的載體(例如,如但不限于生理鹽水)中,并口服施予或通過靜脈灌 注、或皮下注射或植入,肌肉內、鞘內、腹腔內、直腸內、陰道內、鼻內、 胃內、氣管內或肺內施予。
需要的劑量依賴于給藥路徑的選擇,制劑的性質,患者疾病的性質,受 試者的大小、重量、表面積、年齡和性別,正施予的其它藥物以及主治醫師 的判斷。合適的劑量在0.01~100mg/kg的范圍內。考慮到可用的化合物的變 化以及各種給藥路徑的不同效率,預期到需要的劑量的變化。例如,預期口 服給藥需要的劑量比通過靜脈注射所需的劑量更高。可以使用本領域很好理 解的用于優化的標準經驗途徑來調節這些劑量水平的變化。在合適的遞送載 體(例如聚合物微粒或可植入裝置)中封裝化合物可提高遞送的效率,特別 是對于口服遞送。
組合物
在本發明的范圍內,組合物包括合適的載體和一種或多種上述治療劑。 組合物可為包括藥學上可接受的載體的藥物組合物、包括食品可接受的合適 載體的食品組合物或包含化妝品可接受的載體的化妝品組合物。
術語“藥物組合物”是指活性劑與惰性的或活性的載體的組合,使得所 述組合物特別適于用于體內或離體診斷或治療應用。“藥學上可接受的載體” 在施予受試者后或施予受試者時不引起不良的生理效應。藥物組合物中的載 體必須在與活性成分相容并能夠穩定它的意義上是“可接受的”。一種或多種 增溶劑可用作遞送活性化合物的藥物載體。藥學上可接受的載體的實例包括 但不限于生物相容的載體、佐劑、添加劑和稀釋劑,以獲得可用作劑型的組 合物。其它載體的實例包括膠體二氧化硅、硬脂酸鎂、纖維素、十二烷基硫 酸鈉和D&C Yellow#10。
如文中使用,術語“藥學上可接受的鹽”是指健全的醫療判斷范圍內的 那些適用于與人的組織或低等動物接觸而無異常的毒性、刺激、變態反應等, 并且具有合理的由優點/風險比的鹽。本領域中公知胺類、羧酸和其它類型的 化合物的藥學上可接受的鹽。例如,在通過引用合并于本文的S.M.Berge et al., J.Pharmaceutical Sciences,66:1-19(1977)中詳細地描述了藥學上可接受的 鹽。可在最終分離和純化本發明的化合物的過程中原位制備鹽,或者可如下 面通常描述的,通過游離的堿或游離的酸官能與合適的試劑反應而單獨地制 備。例如,游離的堿官能可與合適的酸反應。此外,當本發明的化合物攜帶 酸性部分時,其合適的藥學上可接受的鹽可包括金屬鹽,例如堿金屬鹽,如 鈉鹽或鉀鹽;以及堿土金屬鹽,如鈣鹽或鎂鹽。藥學上可接受的無毒的酸加 成鹽的實例為用無機酸(例如鹽酸、氫溴酸、磷酸、硫酸和高氯酸)或有機 酸(例如乙酸、草酸、馬來酸、酒石酸、檸檬酸、琥珀酸或丙二酸)或通過 使用本領域中使用的其它方法(例如離子交換)形成的氨基的鹽。其它藥學 上可接受的鹽包括己二酸鹽、藻酸鹽、抗壞血酸鹽、天冬氨酸鹽、苯磺酸鹽、 苯甲酸鹽、硫酸氫鹽、硼酸鹽、丁酸鹽、樟腦酸鹽、樟腦磺酸鹽、檸檬酸鹽、 環戊丙酸鹽、二葡糖酸鹽、十二烷基硫酸鹽、乙磺酸鹽、甲酸鹽、延胡索酸 鹽、葡庚糖酸鹽、甘油磷酸鹽、葡萄糖酸鹽、半硫酸鹽、庚酸鹽、己酸鹽、 氫碘化物、2-羥基-乙磺酸鹽、乳糖醛酸鹽、乳酸鹽、月桂酸鹽、十二烷基硫 酸鹽、蘋果酸鹽、馬來酸鹽、丙二酸鹽、甲磺酸鹽、2-萘磺酸鹽、煙酸鹽、 硝酸鹽、油酸鹽、草酸鹽、棕櫚酸鹽、雙羥萘酸鹽、果膠酸鹽、過硫酸鹽、 3-苯基丙酸鹽、磷酸鹽、苦味酸鹽、三甲基乙酸鹽、丙酸鹽、硬脂酸鹽、琥 珀酸鹽、硫酸鹽、酒石酸鹽、硫氰酸鹽、對甲苯磺酸鹽、十一烷酸鹽、戊酸 鹽等。代表性的堿金屬或堿土金屬鹽包含鈉、鋰、鉀、鈣、鎂等。適當時, 其它藥學上可接受的鹽包括無毒的銨、季銨以及使用抗衡離子(例如鹵化物、 氫氧化物、羧酸鹽、硫酸鹽、磷酸鹽、硝酸鹽、低級烷基磺酸鹽和芳基磺酸 鹽)形成的胺陽離子。
如上述,本發明的藥物組合物另外包括藥學可接受載體,如文中使用,其 包括任何以及全部的溶劑、稀釋劑或其它液體載體、分散系或懸浮助劑、表 面活性劑、等滲劑、增稠劑或乳化劑、防腐劑、固體粘結劑、潤滑劑等,當 適于期望的具體劑型時。Remington’s Pharmaceutical Sciences,Sixteenth  Edition,E.W.Martin(Mack Publishing Co.,Easton,Pa.,1980)公開了用于配 制藥物組合物的各種載體以及用于制備它的已知的技術。除了與本發明的化 合物不相容的任何常規載體介質(例如產生任何非期望的生物效應,或者否 則與藥物組合物的任何其它組分以有毒的方式相互作用)外,其使用預期在 本發明的范圍內。用作藥學上可接受的載體的材料的一些實例包括但不限于 糖(例如乳糖、葡萄糖和蔗糖);淀粉(例如玉米淀粉和馬鈴薯淀粉);纖維 素及其衍生物(例如羧甲基纖維素鈉、乙基纖維素和醋酸纖維素);黃芪膠粉; 麥芽;明膠;滑石;賦形劑(例如可可脂和栓劑蠟);油(例如花生油、棉籽 油;紅花油、芝麻油;橄欖油;玉米油和大豆油);二醇類,例如乙二醇;酯 類,例如油酸乙酯和月桂酸乙酯;瓊脂;天然的和合成的磷脂,例如大豆和 卵黃磷脂、卵磷脂、氫化大豆卵磷脂、二肉豆蔻酰基卵磷脂、二棕櫚酰基卵 磷脂、雙硬脂酰卵磷脂、二油酰卵磷脂、氫化卵磷脂、溶血磷脂酰膽堿、心 磷脂、鞘磷脂、磷脂酰膽堿、磷脂酰乙醇胺、二硬脂酰磷脂酰乙醇胺(DSPE) 及其聚乙二醇化的酯(例如DSPE-PEG750和DSPE-PEG2000)、磷脂酸、磷 脂酰甘油和磷脂酰絲氨酸。優選的商品級卵磷脂包括以商品名可得到的那些,并包括Phosal 53 MCT、Phosal 50 PG、Phosal 75 SA、Phospholipon 90H、Phospholipon 90G和Phospholipon 90 NG;特別優選 大豆磷脂酰膽堿(SoyPC)和DSPE-PEG2000;緩沖劑,例如氫氧化鎂和氫 氧化鋁;海藻酸;無熱原水;等滲的鹽水;Ringer氏溶液;乙醇和磷酸鹽緩 沖劑,以及其它無毒的相容的潤滑劑,例如十二烷基硫酸鈉和硬脂酸鎂,以 及著色劑、脫模劑、涂布劑、甜味劑、調味劑和芳香劑,根據藥劑師的判斷, 防腐劑和抗氧化劑也可存在于組合物中。
任何上述形態的上述組合物均可用于治療黑素瘤或文中描述的任何其它 疾病或病癥。有效量是指需要在被治療的受試者上產生治療效果的活性化合 物/制劑的量。如本領域技術人員所理解的,有效劑量將根據治療的疾病的類 型、給藥路徑、賦形劑的使用以及與其它治療處理共使用的可能性而變化。
本發明的藥物組合物可腸胃外、經口、經鼻、經直腸、局部地或經頰施 予。如文中使用,術語“腸胃外”是指皮下、皮內、靜脈內、肌肉內、關節 內、動脈內、滑膜內、胸骨內、鞘內、病灶內或顱內注射以及任何合適的灌 注技術。
無菌的可注射組合物可為在無毒的腸道外可接受的稀釋劑或溶劑 中的溶液或懸浮液。這樣的溶液包括但不限于1,3-丁二醇、甘露醇、水、Ringer 氏溶液和等滲的氯化鈉溶液。此外,通常使用不揮發油作為溶劑或懸浮介質 (例如合成的單甘油酯或甘油二酯)。脂肪酸(例如但不限于油酸及其甘油酯 衍生物)用于制備注射物,如同天然的藥物可接受的油類,例如但不限于橄 欖油或蓖麻油,其聚氧乙烯化形式。這些油溶液或懸浮液還可包括長鏈醇稀 釋劑或分散劑,例如但不限于羧甲基纖維素或相似的分散劑。其它通常使用 的表面活性劑,例如但不限于吐溫類或Spans或其它相似的乳化劑或生物利 用度增強劑,欺通常用于制造藥學上可接受的固體、液體或其它可用于本發 明的目的的劑型。
用于口服給藥的組合物可為任何口服可接受的劑型,包括膠囊劑、片劑、 乳劑和水懸浮劑、分散劑和溶液劑。在片劑的情況下,通常使用的載體包括 但不限于乳糖和玉米淀粉。通常還加入潤滑劑,例如但不限于硬脂酸鎂。對 于膠囊形式的口服給藥,有用的稀釋劑包括但不限于乳糖和干燥的玉米淀粉。 當口服施予水懸浮液或乳劑時,活性成分可懸浮或溶解于與乳化劑或懸浮劑 組合的油相中。如果期望,可加入某些甜味劑、調味劑或著色劑。
根據本發明的局部投藥的藥物組合物可配制為溶液劑、軟膏劑、霜劑、 懸浮劑、洗劑、粉劑、糊劑、凝膠劑、噴霧劑、氣霧劑或油劑。備選地,局 部制劑可為浸有活性成分的貼劑或包扎材料(其可任選地包括一種或多種賦 形劑或稀釋劑)。在一些優選的實施方式中,局部制劑包括通過皮膚或其它受 累區域增強活性成分的吸收或滲透的材料。
局部組合物包括安全和有效量的適于應用于皮膚的皮膚學上可接受的載 體。“美容學上可接受的”或“皮膚病學上可接受的”組合物或組分是指適于 與人類皮膚接觸的組合物或成分,而沒有不適當的毒性、不相容性、不穩定 性、變態反應等。載體使得活性劑和可任選的成分以合適的濃度遞送到皮膚。 因此,載體的作用可為稀釋劑、分散劑、溶劑等,以確保活性物質以合適的 濃度應用于并均勻地分布于選擇的靶上。載體可為固體、半固體或液體。載 體還可為洗劑、乳劑或凝膠劑的形態,特別是具有充足的稠度或屈服點(yield  point)的一種,以防止活性物質沉淀。載體可以是惰性的或具有皮膚病學益 處。其還應與文中描述的活性成分物理地且化學地相容,并且不應過度地損 害穩定性、功效或與所述組合物相關的其它應用益處。
聯合治療
在一些實施方式中,所述藥物組合物可進一步包括另外的具有抗增殖活 性的化合物。所述具有抗增殖活性的另外的化合物可選自包括表2中顯示的 抗增殖劑的組中。
還應理解,可配制本發明的化合物和藥物組合物,并用在聯合治療中, 即化合物和藥物組合物可與一種或多種期望的治療法或醫療程序配制,或與 一種或多種期望的治療法或醫療程序同時、之前或之后施予。用在組合療法 中的治療(療法或程序)的具體組合將考慮期望的治療法和/或醫療程序的相 容性以及期望獲得的治療效果。還應理解,使用的治療法對于相同的疾病可 獲得期望的效果,或者它們可獲得不同的效果(例如控制任何副作用)。
“抗增殖劑”意思是任何抗增殖劑,包括表2中列出的那些抗增殖 劑,它們的任一種可與LXR激動劑聯合使用,以治療文中引用的病癥。抗增 殖劑還包括有機鉑(organo-platine)衍生物、萘醌和苯醌衍生物、大黃根酸 和其蒽醌衍生物。





診斷和預后方法
上述基因可用于確定受試者是否患有轉移性黑素瘤或者具有患轉移性 黑素瘤的風險。備選地,它們可用于確定受試者中這樣的疾病的預后。
診斷方法
在一個方面,本發明提供了定性和定量信息,以確定受試者是否患有轉 移性黑素瘤或其它表征為內皮募集、癌細胞侵襲或轉移性血管生成的疾病, 或容易患轉移性黑素瘤或其它表征為內皮募集、癌細胞侵襲或轉移性血管生 成的疾病。可基于上述基因或它們的產物(mRNA、microRNA或多肽)在 來自受試者的實驗樣本中的表達水平、模式或譜(profile)確定患有這樣的 疾病或有這樣的傾向的受試者。換句話說,產物可用作標記,以表明疾病存 在或不存在。本發明的診斷或預后檢測包括用于評價產物的表達水平的方法。 所述方法允許檢測所述疾病。例如,一個或多個促進子(即miR-199a-3p、 miR-199a-5p、miR-1908和CTGF)表達水平的相對提高表示存在疾病。相反, 較低的表達水平或缺少表達表示沒有該疾病。
可通過從測試受試者獲得檢測樣本并使所述檢測樣本與能夠檢測核酸 (例如RNA或DNA探針)或多肽的化合物或制劑接觸而評估mRNA、 microRNA或多肽產物在檢測樣本中的存在、水平和缺少。“檢測樣本”包括 從受試者分離的組織、細胞和生物體液,以及受試者中存在的組織、細胞和 液體。可以大量方式(包括測量基因編碼的RNA)而測量目標基因的表達水 平。
可使用大量公知方法的任一種從生物樣本分離表達的RNA樣本。例如, 可在胍鹽類裂解緩沖液中裂解生物樣本,任選地包括另外的化合物以穩定 RNA。在一些實施方式中,裂解緩沖液可包含作為對照的純化的RNA,以監 測來自細胞培養物的RNA的回收率及穩定性。這樣的純化的RNA模板的實 例包括PROMEGA的卡那霉素陽性對照RNA(Kanamycin Positive Control  RNA)(Madison,WI)和7.5kb的LIFE TECHNOLOGIES的多聚(A)加尾的 RNA(Rockville,MD)。可立即使用裂解產物,或冷凍儲藏(例如在-80℃)。
任選地,在自動化可兼容的96孔模式(例如RNEASY純化平臺(QIAGEN, Inc.,Valencia,CA))中使用基于硅土的分離從細胞裂解產物(或其它類型的 樣本)純化總RNA。也考慮其它RNA分離方法,例如用涂布硅土的珠或胍 鹽提取。本領域技術人員可想出用于RNA分離和制備的其它方法。
可使用粗制樣本(例如血液、血清、血漿或細胞裂解物)進行本發明的 方法,消除了分離RNA的需要。可任選地加RNA酶抑制劑到粗制樣本。當 使用粗制的細胞裂解物時,應注意,基因組DNA可根據樣本不同而提供一 個或多個拷貝的靶序列(例如基因)。在其中靶序列衍生自一個或多個高表達 的基因的情況下,來自基因組DNA的信號可能不顯著。但是對于低水平表 達的基因,可通過用DNA酶處理樣本,或通過使用靶向用于cDNA或擴增 產物的隨后引發的引物而消除背景。
可原位和體外確定相應于基因的RNA在細胞中的水平。從檢測樣本分 離的RNA可用在雜交或擴增檢測中,其包括Southern或Northern分析、PCR 分析和探針檢測。用于檢測RNA水平的優選診斷方法包括使分離的RNA與 可雜交到所述基因編碼的RNA上的探針接觸。探針可為全長核酸或其一部 分,例如具有至少10個核苷酸長度并在嚴格條件下足以特異地雜交到RNA 的寡核苷酸。
在一種形式中,RNA(或由其制備的cDNA)固定到表面上,并接觸探 針,例如通過在瓊脂糖凝膠上使分離的RNA跑膠,并從所述凝膠上轉移RNA 到膜上,例如硝酸纖維素。在另一種形式中,固定探針到表面上,并使RNA (或cDNA)與例如基因芯片陣列中的探針接觸。技術人員可改造已知的RNA 檢測方法,用于檢測RNA的水平。
在使用本領域中已知的技術檢測擴增的分子前,用核酸擴增,例如通過 標準的PCR(美國專利No.4,683,202)、RT-PCR(Bustin S.J Mol Endocrinol. 25:169-93,2000)、定量PCR(Ong Y.et al.,Hematology.7:59-67,2002)、實時 PCR(Ginzinger D.Exp Hematol.30:503-12,2002)和原位PCR(Thaker V. Methods Mol Biol.115:379-402,1999)或任何其它的核酸擴增方法,評估樣本 中將被檢測的基因編碼的RNA(或由其制備的cDNA)的水平。在另一個實 施方式中,本發明的方法進一步包括使對照樣本與能夠檢測基因的RNA的 化合物或試劑接觸,并比較對照樣本中RNA的存在與檢測的樣本中RNA的 存在。
上述方法和標記物可用于評估受試者發展黑素瘤的風險。具體地,本發 明可應用于已經具有某些風險的那些高風險隊列中的那些,以獲得對早期檢 測的關鍵洞察。可在受試者的細胞中發展轉化的或瘤形成表型前,或在其早 期階段,檢測與黑素瘤相關的miR基因產物水平的變化。因此,本發明還提 供了用于篩選處于發展黑素瘤的風險的受試者的方法,包括評估從受試者皮 膚獲得的生物樣本中與黑素瘤相關的至少一種基因產物或基因產物的組合的 水平。因此,與對照樣本中相應基因產物的水平相比,生物樣本中基因產物 或基因產物的組合的水平的改變是受試者處于發展黑素瘤的風險的指示。用 于此類篩選的生物樣本可包括正常或疑似癌性的皮膚組織。具有與黑素瘤相 關的一種或多種基因產物的水平變化的受試者是進一步的監測和檢測的候 選。這樣的進一步的檢測可包括組織樣本的組織學檢查或者本領域技術人員 能力內的其它技術。
如文中使用,術語“診斷”意思是檢測疾病或病癥,或確定疾病或病癥 的階段或程度。通常,疾病或病癥的診斷基于指示疾病的一種或多種因素和/ 或癥狀的評估。即,可基于指示疾病或病癥的存在或不存在的因素的存在、 不存在或量做出診斷。認為指示特定疾病的診斷的每個因素或癥狀不必唯一 地與所述特定疾病相關,即,可從診斷因素或癥狀推斷出不同的診斷。相似 地,可能有指示特定疾病的因素或癥狀在不具有特定疾病的個體中存在的情 況。可獨立地使用診斷方法,或者與醫藥領域中已知的用于特定疾病或病癥 (例如黑素瘤)的其它診斷和/或分級方法結合使用。
預后方法
上述診斷方法可鑒別具有黑素瘤或處于發展為黑素瘤的風險的受試者。 此外,生物樣本(例如外周血樣本)中上述基因的表達水平和/或趨勢的變化 可提供恢復或其缺少的早期指示。例如,促進子基因(或抑制子基因)的進 一步提高(或減低)或持續地改變的基因表達水平指示差的預后,即缺少改 善或健康衰退。因此,這些基因允許評估黑素瘤的治療后恢復。該所選擇的 基因的組或其亞組的分析指示病癥的結果。
文中所述的預后檢測可用于確定受試者是否適于施予試劑(例如,激動 劑、拮抗劑、肽模擬物、蛋白質、肽、核酸、小分子或其它藥物候選物),以 治療黑素瘤或其它與內皮募集、癌細胞侵襲或轉移性血管生成相關的疾病。 例如,這樣的測定可用于確定是否可施予化療劑給受試者。
因此,本發明還提供了監測受試者中細胞增生疾病的治療的方法。 為此目的,可在經歷治療前、期間或之后,確定來自受試者的檢測樣本中文 中公開的基因的表達水平。然后,評估與基線水平相比,水平變化的幅度。 上述促進子基因(miR-199a-3p、miR-199a-5p、miR-1908和CTGF)的表達 在治療后的減小表明可用相同的治療進一步治療受試者。相似地,抑制子 (DNAJA4、ApoE、LRP1和LRP8)的增加還指示可用相同的治療進一步治 療受試者。相反地,一個或多個促進子基因的進一步提高或持久的高表達水 平指示缺少改善或健康衰退。
從上述測定的實施獲得的信息用于疾病或其它影響個體受試者的健康狀 況的有害病癥的預測、鑒別進展和臨床管理。在優選的實施方式中,上述診 斷測定提供了對于黑素瘤和其它以內皮募集、癌細胞侵襲或轉移性血管生成 為特征的病癥的預測、鑒別進展和管理有用的信息。上述信息更具體地在設 計化療或其它治療方案以從受折磨的受試者(人)的身體根除這樣的疾病中 幫助臨床醫生。
如文中使用,術語“預后”是指預測臨床病癥或疾病的可能進程和結果。 通常通過評估指示疾病的期望或非期望進程或結果的疾病的因素或癥狀而進 行預后。如文中使用,短語“確定預后”是指技術人員由此可預測患者中的 病癥的進程或結果的過程。術語“預后”不是指100%準確地預測病癥的進 程或結果的能力,而是,技術人員將理解,術語“預后”是指將出現某些進 程或結果的增加的可能性;即,與未呈現病癥的那些個體相比,在呈現指定 病癥的患者中更可能出現進程或結果。
如文中使用,術語“預后良好”和“積極的預后”或“不利的預后”和 “消極的預后”是與用于預測疾病或病癥的可能進程和/或可能的結果相關的 術語。良好的或積極的預后比不利的或消極的預后預測更好的結果。在通常 的意義上,“良好的預后”是比與特定病癥相關的許多其它可能的預后相比相 對好的結果,而不利的預后預測比與特定的病癥相關的許多其它可能的預后 相比相對差的結果。良好或積極的預后的典型實例包括比平均治愈率更好, 較低的轉移傾向、比預期壽命更長、從癌性進展分化為良性進展等。例如, 積極的預后是其中患者在治療后對特定癌癥具有50%的治愈可能性,而具有 相同癌癥的患者平均僅具有25%的被治愈的可能性。
術語“測定”、“測量”、“評估”和“檢測”相互交換地使用,并包 括定量和定性的測量,并包括確定特性、性狀、特征是否存在或不存在。評 估可是相對的或絕對的。“評估靶的存在”包括確定存在的靶的量,以及確定 其是否存在或不存在。
陣列
本發明中還提供了生物芯片或陣列。生物芯片/陣列包含具有連接文中所 述的一個探針或多個探針的固體或半固體基底。探針能夠在嚴格的雜交條件 下雜交到靶序列。探針可在基底上的空間限定的位置連接。每條靶序列可使 用多于一條的探針,可為重疊的探針或靶向具體靶序列的不同部分的探針。 探針能夠雜交到與本領域技術人員理解的單個病癥相關的靶序列。可首先合 成探針,然后連接到生物芯片,或者可直接在生物芯片上合成。
如文中使用,涉及核酸(例如探針)和固體支持物的“連接”或“固定” 可意味著探針和固體支持物之間的連接在結合、洗滌、分析和去除的條件下 是足夠穩定的。連接可為共價或非共價的。共價鍵可直接形成在探針和固體 支持物之間,或者通過交聯劑形成,或通過在固體支持物或探針或兩種分子 上包含特定的反應基團而形成。非共價結合可為靜電、親水以及疏水相互作 用的一種或多種。非共價結合包括例如鏈霉親和素的分子共價連接到支持物 上,并且生物素化的探針非共價結合到鏈霉親和素上。固定還可涉及共價和 非共價相互作用的組合。
固體基底可為被造以包含不連續的適于附著或連接探針的單獨的位點并 能夠經受至少一種檢測方法的材料。這樣的基底的實例包括玻璃和改性的或 功能化的玻璃、塑料(包括丙烯酸、聚苯乙烯以及苯乙烯與其它材料的共聚 物、聚丙烯、聚乙烯、聚丁烯、聚氨酯、聚四氟乙烯等)、多糖、尼龍或硝基 纖維素、樹脂、硅土或基于硅土的材料(包括硅和改性硅)、碳、金屬、無機 玻璃和塑料。基底允許光學檢測而沒有略微的熒光。
盡管也可使用其它的基底結構,基底可以是平面的。例如,為了流入式 (flow-through)樣本分析,探針可放在管的內表面上,以使樣本體積最小化。 相似地,基底可為柔性的,例如軟泡沫,包括由特定塑料制造的閉孔泡沫。
可用用于陣列/生物芯片和探針隨后的連接的化學官能團衍生化陣列/生 物芯片和探針。例如,可衍生化生物芯片的化學官能團包括但不限于:氨基、 羧基、橋氧基或硫醇基。通過使用這些官能團,可使用在探針上的官能團直 接或間接地使用連接子(linker)連接探針。探針可通過5'末端、3'末端或通 過內部核苷酸連接到固體支持物上。探針還可非共價地連接到固體支持物上。 例如,可制造可結合到共價地涂布鏈霉親和素的表面上以引起連接的生物素 化的寡核苷酸。備選地,可使用例如光聚合和光蝕刻的技術在表面上合成探 針。可在例如美國專利No.5837832、6087112、5215882、5707807、5807522、 5958342、5994076、6004755、6048695、6060240、6090556和6040138中找 到用于連接核酸到支持基底的方法的詳細討論。
在一些實施方式中,在核酸陣列中呈現表達的轉錄本(例如文中公開的 microRNA基因的轉錄本)。在這樣的實施方式中,一組結合位點可包括具有 與表達的轉錄本的不同序列片段互補的不同核酸的探針。這樣的核酸的實例 可為15~200個堿基、20~100個堿基、25~50個堿基、40~60個堿基的長度。 除了與其靶序列互補的序列,每個探針序列還包括一條或多條連接子序列。 連接子序列是與其靶序列互補的序列和支持物表面之間的序列。例如,本發 明的核酸陣列具有一條對于每條靶microRNA基因特異的探針。然而,如果 期望,核酸陣列可包括至少2、5、10、100、200、300、400、500或更多個 對于一些表達的轉錄本特異的探針(例如文中描述的microRNA基因的轉錄 本)。
試劑盒
在另一方面,本發明提供了具體化文中所述的方法、組合物以及用于分 析多肽和microRNA表達系統的試劑盒。這樣的試劑盒可包含文中所述的核 酸以及下述的任一種或全部:測定試劑、緩沖劑、探針和/或引物,以及無菌 的鹽水或另一種藥學地可接受的乳劑和懸浮基。此外,試劑盒可包含指導材 料,其包括實施文中所述的方法的指示(例如方案)。例如,試劑盒可為用于 擴增、檢測、識別或量化靶mRNA或microRNA序列的試劑盒。為此,試劑 盒可包含合適的引物(例如發卡引物)、正向引物、反向引物和探針。
在一個實例中,本發明的試劑盒包括一個或多個上面布置多種不同的核 酸(每種均相應于上述基因的一個)的微陣列片(或備選的微陣列形式)。試 劑盒還可包括多個標記的探針。備選地,探針可包括多個適于用作探針的多 核苷酸序列,以及適用于定制包含的多核苷酸序列的標簽的選擇,或專業人 員自由裁量的其它多核苷酸序列。通常,包含的至少一條多核苷酸序列對應 于對照序列,例如歸一化的基因等。示例的標簽包括但不限于連接到核酸引 物的熒光團、染料、放射性標記、酶標簽。
在一個實施方式中,可提供適于擴增相應于表達的RNA樣本的核酸的 試劑盒。這樣的試劑盒包括適用于上述擴增方法任一種中的試劑和引物。備 選地或另外地,試劑盒適于擴大相應于探針和靶核酸樣本之間的雜交的信號 (例如置于芯片上)。
此外,試劑盒中可任選地包括用于制備用于生物表達分析的生物樣本需 要的一種或多種材料和/或試劑。此外,任選地,試劑盒包括一種或多種適于 擴增核酸的酶(包括各種聚合酶(RT、Taq等)、一種或多種脫氧核苷酸,以 及為擴增提供必要的反應混合物的緩沖劑。
通常,使用試劑盒并使用mRNA或microRNA作為起始模板分析基因表 達模式。RNA模板可以總的細胞RNA或分離的RNA提供;兩種類型的樣 本產生可比較的結果。在其它實施方式中,本發明中描述的方法和試劑盒允 許定量其它的基因表達產物,包括tRNA、rRNA或其它的轉錄產物。
任選地,本發明的試劑盒進一步包括軟件,以促進數據的產生、分析和/ 或存儲,并有助于訪問數據庫。軟件包括可用于數據的收集、存儲和/或分析 的邏輯指令、指令集或合適的計算機程序。使用提供的軟件對數據進行比較 分析和相關分析是可能的。
任選地,試劑盒包括用于每一種單獨試劑和/或酶組分的不同的容器。通 常,每種組分適于在其各個容器中分量(aliquoted)。任選地,試劑盒的容器 包括至少一個小瓶、安瓿或試管。可在其中放置和/或分量試劑的瓶、罐或其 它容器也是可能的。優選地,保留商業銷售嚴格限制的試劑盒的各個容器。 合適的較大的容器可包括在其中保留期望的小瓶的注射或吹塑成型的塑料容 器。試劑盒可任選地提供了說明書,例如詳述本發明的試劑盒的使用的書面 說明書或錄像帶演示。
在其它方面,本發明提供了文中任何的組合物或試劑盒用于實施文中的 任何方法或測定的用途,和/或任何裝置或試劑盒用于實施文中的任何測定或 方法的用途。
如文中使用,“試樣”或“生物樣本”指包含核酸的生物組織或液體的樣 本。這樣的樣本包括但不限于從動物分離的組織或體液。生物樣本還可包括 組織的切片,例如活組織檢查和尸體樣本、用于組織學目的取出的冷凍切片、 血液、血漿、血清、唾液、糞便、眼淚、粘液、尿、滲出物、羊水、腹水、 頭發和皮膚。生物樣本還包括來源于患者組織的外植塊和原發性和/或轉化的 細胞培養物。可通過從動物移出細胞樣本而提供生物樣本,但是還可通過使 用以前分離細胞(例如,由他人在另一個時間點和/或為了其它目的分離)而 實現,或通過文中描述的體內方法進行。還可使用存檔的組織,例如具有處 理或結果的歷史的那些。
術語“體液”或“身體的液體”是指來自動物的身體的任何液體。體液 的實例包括但不限于血漿、血清、血液、淋巴液、腦脊液、滑液、尿、口水、 粘液、痰和唾液。可通過任何合適的方法收集體液樣本。可立即使用體液樣 本,或者可為了以后使用而存儲。本領域中已知的任何合適的存儲方法可用 于存儲體液樣本:例如,可在約-20℃至約-70℃凍結樣本。合適的體液為無 細胞液體。“無細胞”液體包括體液樣本,其中不存在細胞,或者存在的細胞 的量如此低,使得確定的miRNA水平反映其在樣本的液體部分而非在細胞 部分的水平。通常通過例如離心或過濾以去除細胞而處理包含細胞的體液, 從而產生這樣的無細胞體液。典型地,無細胞體液不包含完整的細胞,然而, 一些樣本可包括細胞碎片或細胞殘骸。無細胞液體的實例包括血漿或血清, 或從其去除細胞的體液。
文中使用的術語“基因”是指天然(例如基因組)或合成的基因,其包 括轉錄的和/或翻譯的調控序列和/或編碼區和/或非翻譯的序列(例如,內含 子、5'非翻譯和3'非翻譯序列)。基因的編碼區可為編碼氨基酸序列或功能 RNA(例如tRNA、rRNA、催化RNA、siRNA、miRNA或反義RNA)的核 苷酸序列。基因還可為相應于編碼區(例如外顯子和miRNA)的mRNA或 cDNA,其任選地包括連接其上的5'-或3'-非翻譯序列。基因還可為體外產生 的擴增的核酸分子,其包括全部或部分的編碼區和/或連接其上的5'-或3'-非 翻譯序列。該術語還包括喪失它們的蛋白質編碼年齡或否則不再在細胞中表 達的與已知基因的不正常功能相關的假基因。
如文中使用,“表達譜”(expression profile)是指基因組表達譜,例如 microRNA的表達譜。可通過任何用于確定核酸序列的水平的常規方式,例 如microRNA、cRNA等的定量雜交,定量PCR,用于定量的ELISA等產生 所述譜,并允許分析兩種樣本之間的差異的基因表達。分析受試者或患者的 樣本,例如細胞或其集合,例如組織。通過本領域中已知的任何常規方法收 集樣本。目標核酸序列為被發現具有預言性的核酸序列,包括文中描述的那 些的核酸序列,其中,表達譜可包括5、10、20、25、50、100或更多個(包 括全部)列出的核酸序列的表達數據。術語“表達譜”還指測量在測量的樣 本中的核酸序列的豐度。
“差異的表達”是指在細胞和組織內部和其中時間的和/或細胞基因表達 模式的定性或定量差別。因此,差異表達的基因可定性地具有其改變的表達, 包括在例如正常組織相對疾病組織中的活化或失活。基因可以相對于另一種 狀態的特定狀態被打開或關閉,從而允許兩種或多種狀態的比較。定性調節 的基因將呈現可被標準方法檢測的狀態或細胞類型內的表達模式。一些基因 可以在一種而非兩種狀態或細胞類型中表達。備選地,表達差異可是定量的, 例如,由于表達被調節,上調導致轉錄本的量的提高,或者下調導致轉錄本 的量下降。表達差異的程度大到僅需要足以通過標準的表征技術量化即可, 例如表達陣列、定量反轉錄PCR、Northern分析和RNase保護。
如文中使用,“核酸”或“寡核苷酸”或“多核苷酸”是指共價連接到一 起的至少兩個核苷酸。單鏈的描述還限定了互補鏈的序列。因此,核酸還包 括所描述的單鏈的互補鏈。核酸的許多變體可用于與指定的核酸相同的目的。 因此,核酸還包括實質上相同的核酸以及其互補物。單鏈提供了可在嚴格的 雜交條件下雜交到靶序列的探針。因此,核酸還包括在嚴格雜交條件下雜交 的探針。
核酸可為單鏈或雙鏈,或者可包含雙鏈和單鏈序列二者的一部分。核酸 可為DNA(基因組DNA和cDNA二者)、RNA或雜合體,其中,核酸可包 括脫氧核糖核苷酸和核糖核苷酸的組合,以及包括尿嘧啶、腺嘌呤、胸腺嘧 啶、胞嘧啶、鳥嘌呤、肌苷、黃嘌呤、次黃嘌呤、異胞嘧啶和異鳥嘌呤的堿 基的組合。可通過化學合成方法或重組方法獲得核酸。
術語“引物”是指能夠在其3'端雜交到互補核酸分子并提供可被核酸聚 合酶延伸的游離3'羥基末端的任何核酸。如文中使用,擴增引物為一對核酸 分子,其可退火到基因的5’或3’區域(分別為正鏈和負鏈,或反之亦然), 并在其間包含短的區域。在合適的條件下,并使用合適的試劑,這樣的引物 允許具有引物兩側的核苷酸序列的核酸分子的擴增。對于原位方法,可制備 細胞或組織樣本,并固定在支持物(例如載玻片)上,然后接觸可雜交到RNA 的探針。擴增相應于表達的RNA樣本的核酸的備選方法包括例如美國專利 No.7,897,750中公開的那些。
如文中使用,術語“探針”是指能夠通過一種或多種類型的化學鍵(通 常通過互補的堿基配對,通常通過氫鍵形成)結合互補序列的靶核酸的寡核 苷酸。根據雜交條件的嚴格性,探針可結合缺少與探針序列缺少完全的互補 性的靶序列。可能有任何數目的將干擾文中所述的靶序列與單鏈序列之間的 雜交的堿基對。然而,如果突變的數目如此大,使得甚至在最不嚴格的雜交 條件下也不發生雜交,則序列不是互補靶序列。探針可為單鏈,或者部分單 鏈且部分雙鏈。通過結構、組成和靶序列的性質描述探針的鏈型 (strandedness)。探針可被例如鏈霉親和素復合物后來結合的生物素直接標 記或間接地標記。
如文中使用,“互補體”或“互補的”是指核酸可是核酸分子的核苷酸或 核苷酸類似物之間的Watson-Crick(例如A-T/U和C-G)或胡斯坦堿基配對。 完全互補體或完全互補的可意味著核酸分子的核苷酸或核苷酸類似物之間 100%互補的堿基配對。
如文中使用,“嚴格的雜交條件”是指在該條件下第一核酸序列(例如探 針)雜交到第二核酸序列(例如靶標)的條件,例如核酸的復雜混合物。嚴 格的條件為序列依賴的,并且在不同環境下是不同的,并可由本領域技術人 員合適地選擇。可選擇嚴格的條件為在限定的離子強度pH下比具體序列的 熱熔點(Tm)低約5~10℃。Tm可為平衡時50%的與靶標互補的探針雜交到 靶序列的溫度(在限定的離子強度、pH和核酸濃度)(因為在Tm,靶序列 過量存在,平衡時占用50%的探針)。嚴格的條件可為其中在pH 7.0~8.3、鹽 濃度小于約1.0M的鈉離子,例如約0.01~1.0M的鈉離子濃度(或其它鹽), 并且溫度對于短的探針(例如約10~50個核苷酸)為至少約30℃,并且對于 長(例如大于約50個核苷酸)的探針為至少約60℃。還可通過加入去穩定 劑(例如甲酰胺)獲得嚴格的條件。對于選擇性或特異的雜交,陽性信號可 為雜交背景至少2~10倍。示例的嚴格雜交條件包括如下:50%甲酰胺、5×SSC 和1%SDS,在42℃孵育,或者5×SSC,1%SDS,在65℃孵育,于65℃在 0.2×SSC和0.1%SDS中洗滌。然而,除了溫度之外的幾個因素,例如鹽濃 度,可影響雜交的嚴格性,并且本領域技術人員可合適地選擇所述因素,以 獲得相似的嚴格性。
如文中使用,術語“參考值”是指當與檢測結果比較時,與具體的結果 統計相關的值。在優選的實施方式中,由比較microRNA表達與已知的臨床 結果的研究的統計分析確定參考值。參考值可為閾計分值(thereshold score  values)或截止計分值(cutoff score value)。典型地,參考值可為大于(或小 于)其一個結果更可能,并且小于其選擇的閾值更可能的閾值。
在一個實施方式中,參考水平可為表示為取自對照健康受試者(無疾病) 群體的樣本的循環miRNA的平均水平的一種或多種循環miRNA水平。在 另一個實施方式中,參考水平可為在相同受試者中不同時間的水平,例如在 該測定之前,例如在受試者發展出所述疾病之或開始治療前測定的水平。通 常,通過公因子歸一化樣本。例如,可通過體積體液歸一化無細胞的體液樣 本,并且可通過蛋白含量或細胞計數歸一化包含細胞的樣本。還可相對于內 部對照核酸歸一化核酸樣本。
如文中討論,一條或多條多肽或RNA(mRNA或microRNA)的水平的 差異指示了疾病或其階段。短語“水平的差異”是指與對照或參考水平相比, 樣本中具體標記物例如核酸的量的差異。例如,與參考水平相比,以具有腫 瘤疾病的患者樣本中提高的量或減小的量存在具體生物標記物的量。在一個 實施方式中,“水平的差異”可為樣本中存在的具體生物標記物的量與對照(例 如參考值)間至少約1%、2%、3%、5%、10%、15%、20%、25%、30%、 35%、40%、50%、60%、75%、80%、100%、150%、200%或更大的差異。 在一個實施方式中,“水平的差異”可為樣本中存在的生物標記的量與對照間 統計學上顯著的差異。例如,如果生物標記物的測量水平落在任何對照組或 參考組的平均值的約1.0的標準偏差、約1.5的標準偏差、約2.0的標準偏差 或約2.5標準偏差外,則差異在統計學上顯著。關于miRNA的測量,可由實 時PCR測量水平為Ct值,其被歸一化為下面實施例中描述的ΔCt值。
藥物篩選
本發明提供了鑒別用于治療黑素瘤或抑制內皮募集、細胞侵襲或轉移性 血管生成的化合物的方法。
可使用本領域中已知的組合文庫方法中無數方法的任一種獲得將被篩選 的候選化合物(例如蛋白質、多肽、肽模擬物、類肽、抗體、小分子或其它 藥物)。這樣的文庫包括:肽文庫、類肽文庫(具有肽的功能性的分子的文庫, 但是具有抗酶降解的新的非肽骨架)、空間尋址并行固相或液相文庫、通過重 疊合法或親和層析選擇獲得的合成的文庫,以及“一珠一化合物”文庫。參 見,例如Zuckermann et al.1994,J.Med.Chem.37:2678-2685;and Lam,1997, Anticancer Drug Des.12:145。用于合成分子文庫的方法的實例可在,例如 DeWitt et al.,1993,PNAS USA 90:6909;Erb et al.,1994,PNAS USA 91:11422; Zuckermann et al.,1994,J.Med.Chem.37:2678;Cho et al.,1993,Science 261:1303;Carrell et al.,1994,Angew.Chem.Int.Ed.Engl.33:2059;Carell et al., 1994,Angew.Chem.Int.Ed.Engl.33:2061;and Gallop et al.,1994J.Med. Chem.37:1233中發現。化合物的文庫可存在于溶液中(例如Houghten,1992, Biotechniques 13:412-421)或珠子上(Lam,1991,Nature 354:82-84)、芯片 (Fodor,1993,Nature 364:555-556)、細菌(美國專利No.5,223,409)、孢子(美 國專利No.5,223,409)、質粒(Cull et al.,1992,PNAS USA 89:1865-1869)或 噬菌體上(Scott and Smith 1990,Science 249:386-390;Devlin,1990,Science 249:404-406;Cwirla et al.,1990,PNAS USA 87:6378-6382;Felici 1991,J.Mol. Biol.222:301-310;和美國專利No.5,223,409)。
為鑒別有用的化合物,可將測試化合物與包含測試細胞的系統接觸,所 述測試細胞表達由有效地連接到選自上述轉移促進子或抑制子的標記基因的 啟動子的核酸編碼的報告基因。所述系統可為體外細胞系模型或體內動物模 型。細胞可天然地表達所述基因,或可被修飾以表達重組核酸。重組核酸可 包括編碼連接到異源啟動子的報告多肽的核酸。然后,可測量miRNA、多肽 或報告多肽的表達水平。
對于多肽,可在mRNA水平或蛋白質水平確定表達水平。本領域中公知 測量細胞、組織樣本或體液中的mRNA水平的方法。為測量mRNA的水平, 裂解細胞,并通過例如雜交測定(使用可檢測的標記的基因特異的DNA或 RNA探針)和定量和半定量RT-PCR(使用合適的基因特異的引物)確定裂 解物或從裂解物純化或半純化的RN A中的mRNA的水平。備選地,可使用 組織切片或未裂解細胞懸浮物以及可檢測地(例如熒光或酶)標記的DNA 或RNA探針進行定量或半定量原位雜交測定。另外的mRNA定量方法包括 RNA保護試驗(RPA)和SAGE。本領域中還已知測量細胞或組織樣本中蛋 白水平的方法。
為確定候選化合物治療黑素瘤或抑制內皮募集、細胞侵襲或轉移性血管 生成的效力,可比較以上述方式獲得的水平與對照水平(例如,可在缺少候 選化合物時獲得的)。如果(i)轉移抑制子水平低于對照值或參考值或者(ii) 轉移的促進子水平高于對照水平或參考水平,則鑒別化合物為有效的。可使 用下面實施例中公開的體外細胞培養物模型或體內動物模型進一步驗證如此 鑒定的化合物的效力。
實施例
實施例1材料和方法
該實施例描述了下面實施例2~11中使用的材料和方法。
化合物
表3化合物的名稱

動物研究
根據洛克菲勒大學的動物保護和利用委員會(IACUC)批準的方案進行 全部的小鼠實驗。如以前描述(Minn et al.,2005;Tavazoie et al.,2008),將6~8 周年齡匹配的以及性別匹配的小鼠用于原發腫瘤生長以及轉移分析。參見擴 展的實驗程序。
細胞培養
如以前描述(Tavazoie et al.,2008),培養全部的癌細胞系。293T和人臍 靜脈內皮細胞(HUVEC)保持在在標準條件下。在擴展實驗程序中詳述了在 細胞系和體外功能測定中的miRNA和基因敲降/過表達研究。
微陣列雜交
為了識別在高轉移性衍生物中脫調控(deregulated)的miRNA,從來源 于MeWo和A375細胞系并由LC science描述的總RNA富集小RNA。為了 鑒別miR-199a-3p、miR-199a-5p和miR-1908的潛在基因靶標,標記來自 MeWo細胞系的總RNA,并雜交到洛克菲勒大學基因組學核心設備的 Illumina HT-12 v3 Expression BeadChip陣列上。對于用于達到miRNA和 mRNA靶標的閾值和標準,參見擴展實驗程序。
分析人黑素瘤皮膚損傷中的miRNA表達
根據IRB指南獲取、加工和分析該研究中使用的全部人類臨床樣本。從 先前由MSKCC患者切除的原發性黑素瘤皮膚損傷的石蠟包埋的截面提取總 RNA,并使用TaqMan miRNA Assays(Applied Biosystems)以不知情的方式 分析具體的miRNA表達水平。使用GraphPad Prism軟件包產生作為原發性 腫瘤miRNA表達值的函數的表示每個患者的無轉移的生存數據的 Kaplan-Meier曲線。
體內LNA治療
尾靜脈注射4×104個的MeWo-LM2細胞后,用以在0.1mL的PBS中輸 送的12.5mg/kg的組合劑量的與miR-199a-3p、miR-199a-5p和miR-1908反 義的體內優化的LNA(Exiqon)每周兩次靜脈注射處理NOD-SCID小鼠四周。
組織學
為了總的宏觀的轉移性結節的可視化,5-μm厚的肺組織切片被H&E染 色。對于體內內皮細胞含量的分析,用抗MECA-32的抗體(Developmental  Studies Hybridoma Bank,The University of Iowa,IA)和人類波形蛋白(Vector  Laboratories)雙重地染色肺切片,所述抗體標記小鼠內皮細胞,所述蛋白標 記人黑素瘤細胞。參見擴展的實驗步驟。
數據分析
全部的數據表示為平均值±SEM。柯爾莫哥羅夫-斯米爾諾夫檢驗用于測 定轉移性血管密度累積分布中差異的顯著性。使用Mantel-Cox時序檢驗檢測 miRNA預測轉移結果的預后能力的顯著性。單向Mann-Whitney t檢驗用于 確定對于非高斯生物發光測量的顯著值。對于全部其它比較,使用單側學生 t檢驗。認為P值<0.05為統計顯著性。
體內選擇、實驗性轉移和原發性腫瘤生長分析
根據洛克菲勒大學的動物保護和利用委員會(IACUC)批準的方案進行 全部的小鼠實驗。為了從兩個獨立的人黑素瘤細胞系產生多個轉移衍生物, 如前面所述(Minn et al.,2005Nature 436,518-524;Pollack and Fidler,1982J. Natl.Cancer Inst.69,137-141)進行體內選擇。簡言之,1×106染色的MeWo或 無染色的A375黑素瘤親本細胞懸浮在0.1mL的PBS中,并靜脈注射到6~8 周齡的免疫妥協的NOD-SCID小鼠。在肺轉移形成后,分離結節,并且體外 繁殖細胞,產生第一代肺轉移衍生物(LM1)。然后,通過尾靜脈注射2×105個細胞到NOD-SCID小鼠,而使LM1細胞經歷另一輪的體內選擇,產生轉 移性結節,其隨后的分解產生第二代的肺轉移性衍生物(LM2)。對于A375 細胞系,進行第三輪的體內選擇,產生高轉移性的A375-LM3衍生物。
為了通過生物發光成像體內監測轉移,用表達螢光素酶報告基因的逆轉 錄病毒構建物轉化A375和MeWo親本細胞以及它們的轉移性衍生物 (Ponomarev et al.,2004Eur J Nucl Med Mol Imaging 31,740-751)。對于全部 的轉移實驗,隨時間監測肺或系統性定植,并如前述通過非侵入性生物發光 成像量化(Minn et al.,2005)。為確定是否獲得體內選擇,4×104個MeWo親 本或MeWo-LM2細胞和1×105個A375親本或A375-LM3細胞在0.1mL的 PBS中重新懸浮,并通過尾靜脈注射到6~8周齡的NOD-SCID小鼠。對于檢 測推定的促進子miRNA對肺定植的效果的實驗轉移測定,4×104個過表達 miR-199a、miR-1908、miR-214或對照發夾的MeWo親本細胞,4×104個具 有miR-199a-3p、miR-199a-5p、miR-1908或對照序列的沉默表達的 MeWo-LM2細胞和2×105個抑制miR-199a-3p、miR-199a-5p、miR-1908或對 照序列的A375-LM3細胞重懸浮在0.1mL的PBS中,并尾靜脈注射到6~8 周齡的NOD-SCID小鼠中。對于上位性實驗(epistasis experiment),靜脈注 射1×105個表達靶向ApoE、DNAJA4或對照序列的shRNA或者在miRNA 抑制的情況下抑制LRP1或對照序列的siRNA的MeWo-LM2細胞到6~8周 齡的NOD-SCID小鼠中。對于ApoE預處理實驗,在37℃于100μg/mL的 ApoE或BSA存在下孵育MeWo-LM2細胞。在24個小時后,4×104個細胞 通過尾部靜脈注射到7周齡的NOD-SCID小鼠。為確定用靶向miR-199a-3p、 miR-199a-5p和miR-1908的LNA預處理高度轉移性黑素瘤細胞對轉移的影 響,單獨地用每種LNA、靶向全部三種miRNA的LNA的混合物或對照LNA 轉染MeWo-LM2細胞。在48個小時后,靜脈注射施予重懸在0.1mL的PBS 中的1×105的細胞到7周齡的NOD-SCID小鼠中,用于肺轉移性移植研究, 或心內注射到7周齡的無胸腺的裸鼠,用于全身轉移測定。為確定ApoE的 基因缺失對轉移的影響,用5×104個B16F10小鼠黑素瘤細胞靜脈注射8周 齡的C57BL/6-WT或C57BL/6-ApoE-/-小鼠。對于原發性腫瘤生長研究,1×106個過表達miR-199a、miR-1908或對照發夾的親本MeWo細胞與基質膠1:1 混合,然后皮下注射到6周齡的免疫缺陷NOD-SCID小鼠的右下脅腹。每周 觸診動物腫瘤的形成,然后每周測量大的腫瘤2次。如下計算腫瘤的體積(小 的直徑)2×(大的直徑)/2。
慢病毒miRNA抑制和基因敲降
293T細胞接種在10cm的板中,并讓其達到60%的融合度(confluency)。 在轉染前,用添加10%的FBS的新鮮的無抗生素的DMEM培養基替換細胞 培養基。使用60μL的TransIT-293轉染試劑(MIR 2700,Mirus Bio LLC, Madison,WI)共轉染6μg的載體A、12μg的載體K和12μg的合適的 miR-Zip(System Biosciences,Mountain View,CA)或shRNA質粒構建物 (MSKCC HTS Core Facility,New York,NY)。在37℃培養細胞48個小時, 并在通過0.45μm濾器過濾病毒前,以2000g旋轉細胞培養基10分鐘而收 獲病毒。在10μg/mL的聚凝胺(TR-1003-G,Millipore,Billerica,MA)的存在 下用2mL的合適的病毒轉染1×105個癌細胞6個小時。在48個小時后,加 2μg/mL的嘌呤霉素(P8833,Sigma-Aldrich,St Louis,MO)到細胞培養基中, 用于慢病毒選擇。保持細胞的嘌呤霉素篩選72個小時。使用下面的miR-Zip 序列:
miR-Zip-199a-3p:
5’-GATCCGACAGTAGCCTGCACATTAGTCACTTCCTGTCAGTAACCAAT G TGCAGACTACTGTTTTTTGAATT-3’
miR-Zip-199a-5p:
5’-GATCCGCCCAGTGCTCAGACTACCCGTGCCTTCCTGTCAGGAACAGG TAG TCTGAACACTGGGTTTTTGAATT-3’
miR-Zip-1908:
5’-GATCCGCGGCGGGAACGGCGATCGGCCCTTCCTGTCAGGACCAATC GCCGTCCCC GCCGTTTTTGAATT-3’
使用下面的shRNA序列:
shAPOE1:
5’CCGGGAAGGAGTTGAAGGCCTACAACTCGAGTTGTAGGCCTTCAACT CCTTCTTTTT3’
shAPOE2:
5’CCGGGCAGACACTGTCTGAGCAGGTCTCGAGACCTGCTCAGACAGT GTCTGCTTTTT3’
shDNAJA41:
5’CCGGGCGAGAAGTTTAAACTCATATCTCGAGATATGAGTTTAAACTTC TCGCTTTTT3’
shDNAJA42:
5’CCGGCCTCGACAGAAAGTGAGGATTCTCGAGAATCCTCACTTTCTGT CGAGGTTTTT3’
逆轉錄病毒miRNA和基因過表達
使用60μL的TransIT-293轉染試劑共轉染6μg的載體VSVG、12μg 的載體Gag-Pol和12μg的包含人類ApoE、DNAJA4或空載體的編碼序列或 包含miR-199a、miR-214、miR-1908或對照發夾的前體序列的miR-Vec的 pBabe質粒到60%融合度的293T細胞中。在37℃培養細胞48個小時,然后 收獲病毒,并在10μg/mL的聚凝胺的存在下轉染到癌細胞中6個小時。在 48個小時后,加2μg/mL的嘌呤霉素或10μg/mL的殺稻瘟菌素(15205, Sigma-Aldrich,St Louis,MO)到用于逆轉錄病毒篩選的細胞培養基中。保持 細胞的嘌呤霉素篩選72個小時以及殺稻瘟菌素篩選7天。下面的克隆引物用 于ApoE和DNAJA4的編碼序列的過表達:
ApoE_CDS_正向:5’-TCATGAGGATCCATGAAGGTTCTGTGGGCT-3’
ApoE_CDS_反向:5’-TAGCAGAATTCTCAGTGATTGTCGCTGGG-3’
DNAJA4_CDS_正向:5’-ATCCCTGGATCCATGTGGGAAAGCCTGACCC-3’
DNAJA4_CDS_反向:5’-TACCATGTCGACTCATGCCGTCTGGCACTGC-3’
基于LNA的miRNA敲降
使用lipofectamineTM 2000轉染試劑(11668-09,Invitrogen,Carlsbad,CA) 以50nM的終濃度轉染與成熟的miR-199a-3p、miR-199a-5p、miR-1908或對 照序列(分別為426917-00、426918-00、426878-00和1990050;Exiqon,Vedbaek, 丹麥)互補的LNA到50%融合度的在無抗生素培養基中培養的MeWo-LM2 癌細胞。在8個小時后,用新鮮的培養基替換轉染培養基。在48個小時后, 靜脈注射1×105個細胞到NOD-SCID小鼠中,以評價肺轉移性定植,或者通 過心臟內注射到無胸腺裸鼠,以評價全身轉移。對于細胞侵襲和內皮募集體 外測定,在轉染后96個小時使用所述細胞。
基于siRNA的mRNA敲降
使用lipofectamineTM 2000轉染試劑以100nM的終濃度轉染靶向 LRP1、LRP8、VLDLR、LDLR或對照序列的siRNA到癌細胞或HUVEC。 在5個小時后,用新鮮的培養基替換轉染培養基。細胞在轉染后96小時進行 基質膠侵襲和內皮募集測定。在轉染后72個小時,在miRNA抑制的情況下, 尾靜脈注射轉染靶向LRP1或對照序列的siRNA的細胞,用于肺定植檢測。 從Dharmacon獲得對照非靶向siRNA。使用下面的LRP1和LRP8靶向序列:
siLRP11:5’-CGAGGACGAUGACUGCUUA-3’;
siLRP12:5’-GCUAUGAGUUUAAGAAGUU-3’;
siLRP81:5’-CGAGGACGAUGACUGCUUA-3’;
siLRP82:5’-GAACUAUUCACGCCUCAUC-3’.
細胞增殖測定
為確定miR-199a或miR-1908過表達以及組合的LNA誘導的miRNA抑 制對細胞增殖的效果,2.5×104個細胞一式三份接種在6孔板中,并在5天后 計數活細胞。為評估重組的ApoE添加物對黑素瘤細胞或內皮細胞增殖的效 果,在ApoE(100μM)或BSA(100μM)的存在下培養3×104個黑素瘤 MeWo-LM2細胞或內皮細胞。在8、24、48、72和120個小時后計數活的 細胞。
基質膠侵襲測定
在0.2%的基于FBS DMEM的培養基中使癌細胞血清饑餓12個小時。在 測定開始前通過加入0.5mL的饑餓培養基到頂腔和底腔(chambers)而預平 衡穿孔侵襲腔(354480,BD Biosciences,Bedford,MA)。在30分鐘后,去除 頂腔中的培養基,并加入0.5mL的包含1×105個癌細胞的培養基到每個涂布 基質膠的穿孔插入物中,并在37℃培養24個小時。為了中和抗體和/或重組 蛋白實驗,在開始測定前以圖中表示的下述濃度加入抗體/重組蛋白質到每個 孔:5~40μg/mL的抗ApoE 1D7(Heart Institute,University of Ottawa)、5~40 μg/mL的抗IgG(AB-108-C,R&D Systems,Minneapolis,MN)、100μM的重 組人ApoE3(4696,BioVision,Mountain View,CA)和100μM的BSA(A2153, Sigma-Aldrich)。當完成ced時,用PBS洗滌涂布基質膠的插入物,刮去在 每個插入物的頂端的細胞,并在4%的多聚甲醛中固定插入物15分鐘。然后, 切掉插入物,并使用包含DAPI的VectaShield封固劑(H-1000,Vector  Laboratories,Burlingame,CA)封固在切片上。以5×的放大率使用倒置熒光顯 微鏡(Zeiss Axiovert 40CFL)成像每個插入物的基側,對每個插入物拍攝3 個代表的圖像。使用ImageJ(NIH)量化侵襲的細胞的數目。
內皮募集測定
在開始測定前大約24小時,將5×104個癌細胞接種到24孔板中。HUVEC 生長到80%的融合度,并在補充0.2%FBS的EGM-2培養基中血清饑餓16 個小時。然后,用Cell Tracker Red CMTPX染料(C34552,Invitrogen)脈沖 HUVEC 45分鐘。同時,用PBS洗滌癌細胞,并將0.5mL的0.2%FBS EGM-2 培養基加入到每個孔,并將3.0μm的HTS Fluoroblock插入物(351151,BD  Falcon,San Jose,CA)放入到每個孔中。1×105個在0.5mL的饑餓培養基中重 懸浮的HUVEC接種到每個穿孔插入物中,并在37℃進行募集測定16~18個 小時。然后,為了中和抗體和/或重組蛋白質實驗,以圖中表示的合適的濃度 加入抗體/蛋白到每個孔:40μg/mL的抗ApoE 1D7、40μg/mL的抗IgG、100 μM的rhApoE3和100μM的BSA。當完成檢測時,如上述基質膠侵襲實驗 處理和分析插入物(參見基質膠侵襲實驗)。
內皮遷移測定
用Cell Tracker Red CMTPX染料脈沖血清饑餓的HUVEC 45分鐘,并在 每個插入物0.5mL的饑餓培養基中以1×105個HUVEC的濃度接種到HTS  Fluoroblock穿孔插入物中。讓測定在37℃進行16~18個小時,并如上處理 和分析插入物(參見基質膠侵襲實驗)。
趨化性測定
HUVEC在0.2%FBS EGM-2培養基中血清饑餓16個小時,并用 Cell Tracker Red CMTPX染料標記45分鐘。同時,指定量的(1~5μg)的重 組人ApoE3或BSA與250μL的基質膠(356231,BD Biosciences)混合,并 讓其在24孔板的底部固化30分鐘。然后,加入250μL的包含0.2%FBS的 HUVEC EGM-2培養基到每個涂布基質膠的孔中,并且3.0μM的HTS  Fluoroblock插入物置入到每個孔。1×105個在0.5mL的饑餓培養基中重懸浮 的HUVEC接種到每個插入物,并讓其在37℃沿基質膠梯度遷移16~18個小 時。在完成檢測后,封固插入物到切片,并如上分析(參見基質膠侵襲實驗)。
內皮粘附測定
HUVEC接種在6孔板中,并讓其形成單層。癌細胞在0.2%的FBS  DMEM基培養基血清饑餓30分鐘,并用Cell Tracker Green CMFDA染料 (C7025,Invitrogen)脈沖45分鐘。2×105個在0.5mL的饑餓培養基中重懸 浮的癌細胞接種到每個內皮單層。讓癌細胞在37℃附著到HUVEC單層30 分鐘。然后,用PBS輕輕地洗滌內皮單層,并用4%的多聚甲醛固定15分鐘。 然后,用PBS涂布每個孔,然后以10×的放大率用倒置熒光顯微鏡(Zeiss  Axiovert 40 CFL)拍攝每個內皮單層的8個圖像。使用ImageJ定量附著到 HUVEC的癌細胞的數目。
失巢凋亡測定
1×106個過表達miR-199a、miR-1908或對照發夾的MeWo細胞接種到包 含補充0.2%的甲基纖維素的細胞培養基的低附著板上。在懸浮液中48個小 時后,使用臺盼藍計數死亡和存活細胞的數目。
血清饑餓測定
為確定miR-199a和miR-1908對黑素瘤細胞血清饑餓能力的影響,1×105個過表達miR-199a、miR-1908或對照發夾的MeWo親本細胞一式四份接種 到6孔板中,并在基于0.2%的FBS饑餓DMEM培養基中培養48小時,然 后,使用臺盼藍計數存活細胞的數目。為確定加入重組ApoE3對血清饑餓條 件下黑素瘤細胞或內皮細胞的存活的影響,在ApoE3(100μM)或BSA(100 μM)的存在下于低血清條件(0.2%FBS)下培養3×104的MeWo-LM2細胞 或內皮細胞。在8、16和24個小時后,計數存活細胞的數目。
集落形成檢測
50個過表達miR-199a、miR-1908或對照發夾的MeWo親本細胞一式四 份接種到6cm的板中。在兩周后,用PBS洗滌細胞,并用6%的戊二醛固定, 用0.5%的結晶紫染色。計數陽性染色的集落的數目。
miRNA微陣列雜交
為鑒別顯示高轉移性黑素瘤細胞系衍生物的脫調控表達的miRNA,來自 多種獨立的轉移性衍生物及它們各自的親本MeWo和A375細胞群的總RNA 用于富集小RNA,然后,其標記并雜交到LC sciences的微流控定制芯片平 臺。設計測定用于檢測894個相應于Sanger miRBase Release 13.0中列出的 miRNA轉錄本的成熟miRNA。在全部分析的探針中,相應于169個miRNA 的那些在分析的多個細胞系中產生大于背景閾值的信號。為每個細胞系中值 歸一化相應于雜交探針的原始信號強度。使用中值歸一化的表達值2倍或更 高上調的閾值,以鑒別通常在兩個獨立的人黑素瘤細胞系的多個轉移性衍生 物中誘導的miRNA。
基于微陣列的對于miR-199a和miR-1908的基因靶標預測
為了鑒別miR-199a-3p、miR-199a-5p和miR-1908潛在靶向的基因, 從喪失或獲得每個miRNA的功能的MeWo細胞系提取總RNA,并提交到洛 克菲勒大學的基因組學核心設備,用于雜交到Illumina HT-12 v3 Expression  BeadChip微陣列。然后,為每個細胞系樣本中值歸一化相應于探針雜交的原 始信號強度。產生三組微陣列譜比較:(1)MeWo對照細胞相對于過表達 miR-199a或miR-1908的MeWo細胞,(2)MeWo-LM2對照細胞相對于表 達靶向miR-199a-3p、miR-199a-5p或miR-1908的短的發夾(miR-Zip)的 MeWo-LM2細胞,以及(3)MeWo親本細胞相對于MeWo-LM2細胞。基 于來自這些陣列的中值歸一化的表達值,使用下面的標準獲得共同針對 miR-199a和miR-1908的可能的靶基因:(1)在過表達每個miR-199a和 miR-1908后下調超過1.5倍的基因,(2)在抑制miR-199a-3p和miR-1908 二者或miR-199a-5p和miR-1908二者后上調超過1.5倍的基因,和(3)相 對于MeWo親本細胞,生理表達更高水平的三種miRNA的LM2細胞中下調 超過1.5倍的基因。
分析細胞系中miRNA和mRNA的表達
使用miRvana試劑盒(AM1560,Applied Biosystems,Austin,TX)從 各種細胞系提取總RNA。使用Taqman miRNA表達測定(4427975-0002228, Applied Biosystems)量化成熟miRNA的表達水平。RNU44用作歸一化的內 源對照。對于mRNA表達分析,使用cDNA第一鏈合成試劑盒(18080-051, Invitrogen)反轉錄600ng的總RNA,然后,大約200ng的產生的cDNA與 SYBR green PCR Master Mix(4309155,Applied Biosystems)以及合適的引物 混合。一式四份進行每種反應,并使用ABI Prism 7900HT Real-Time PCR  System(Applied Biosystems)通過進行實時PCR擴增而量化mRNA表達。 GAPDH用作歸一化的內源對照。使用下面的引物:
ApoE_正向:5’-TGGGTCGCTTTTGGGATTAC-3’
ApoE_反向:5’-TTCAACTCCTTCATGGTCTCG-3’
DNAJA4_正向:5’-CCAGCTTCTCTTCACCCATG-3’
DNAJA4_反向:5’-GCCAATTTCTTCGTGACTCC-3’
GAPDH_正向:5’-AGCCACATCGCTCAGACAC-3’
GAPDH_反向:5’-GCCCAATACGACCAAATCC-3’
LRP1_正向:5’-TTTAACAGCACCGAGTACCAG-3’
LRP1_反向:5’CAGGCAGATGTCAGAGCAG-3’
LRP8_正向:5’-GCTACCCTGGCTACGAGATG-3’
LRP8_反向:5’-GATTAGGGATGGGCTCTTGC-3’
ELISA
通過在基于0.2%的FBS血清饑餓DMEM的培養基中培養細胞24 個小時而制備癌細胞條件培養基。使用APOE ELISA試劑盒(IRAPKT031, Innovative Research,Novi,Michigan)確定條件培養基中的ApoE水平。
螢光素酶報告基因測定
如前面描述,進行異源的螢光素酶報告基因測定(Tavazoie et al.,2008)。 簡言之,ApoE和DNAJA4的全長3’UTR和CDS克隆到psiCheck2雙螢光素 酶報告基因載體(C8021,Promega,Madison,WI)中的海腎螢光素酶報告基因 下游。使用TransiT-293轉染試劑用100ng的各個特異的報告基因構建物轉 染5×104個親本MeWo細胞,MeWo-LM2細胞,過表達miR-199a、miR-1908 或對照發夾的MeWo細胞,以及表達靶向miR-199a-3p、miR-199a-5p、 miR-1908或對照序列的miR-Zip發夾的MeWo-LM2細胞。轉染后24小時, 裂解細胞,使用雙螢光素酶測定(E1910,Promega)確定海腎與螢火蟲螢光 素酶表達的比。通過與互補的miRNA種子序列的比對(miR-199a-3p: 5’-CAGUAGUC-3’;miR-199a-5p:5’-CCAGUGUU-3’;miR-1908: 5’-GGCGGGGA-3’)鑒別每個靶向構建物中推定的miRNA結合位點。使用 QuickChange Multi Site-Directed Mutagenesis試劑盒(200514,Agilent  Technologies,Santa Clara,CA)突變每個靶向構建物上的miRNA互補位點。 基于miRNA種子序列互補性分析,在位點141(CTG至ACT)突變ApoE 的CDS,在位置83(GCC至ATA)和98(CTG至ACA)突變ApoE的3’UTR, 在位置373(CGC至TAT)和917(CTG至AGA)突變DNAJA4的CDS, 在位置576(CTG至ACA)、1096(CTG至TCT)、1396(CGC至TGT)和 1596(CTG至TGT)突變DNAJA4的3’UTR。使用下面的引物克隆ApoE 和DNAJA4的3’UTR和CDS:
ApoE_CDS_正向:5’-AGTACCTCGAGGGGATCCTTGAGTCCTACTC-3’
APOE_CDS_反向:
5’-TAATTGCGGCCGCTCAGACAGTGTCTGCACCCAG-3’
DNAJA4_CDS_正向:5’-TAATATCTCGAGATGTGGGAAAGCCTGACCC-3’
DNAJA4_CDS_反向:5’-CAATTGCGGCCGCTCATGCCGTCTGGCACTGC-3’
APOE_3’UTR_正向:5’-TTAGCCTCGAGACGCCGAAGCCTGCAGCCA-3’
APOE_3’UTR_反向:
5’-TTACTGCGGCCGCTGCGTGAAACTTGGTGAATCTT-3’
DNAJA4_3’UTR_正向:5’-TAATATCTCGAGCGTGGTGCGGGGCAGCGT-3’
DNAJA4_3’UTR_反向:
5’-CAATTGCGGCCGCTTATCTCTCATACCAGCTCAAT-3’
使用下面的引物突變每個靶上的miRNA結合位點:
APOE_CDS_mut:
5’-GCCAGCGCTGGGAACTGGCAACTGGTCGCTTTTGGGATTACCT-3’
APOE_3’UTR_mut1:
5’-CAGCGGGAGACCCTGTCCCCATACCAGCCGTCCTCCTGGGGTG-3’
APOE_3’UTR_mut2:
5’-TCCCCGCCCCAGCCGTCCTCACAGGGTGGACCCTAGTTTAATA-3’
DNAJA4_CDS_mut1:
5’-GGGATCGGTGGAGAAGTGCCTATTGTGCAAGGGGCGGGGGATG-3’
DNAJA4_CDS_mut2:
5’-GTAGGGGGCGGGGAACGTGTTATCCGTGAAGAGGTGGCTAGGG-3’
DNAJA4_3’UTR_mut1:
5’-CAGGGCCAACTTAGTTCCTAACATTCTGTGCCCTTCAGTGGAT-3’
DNAJA4_3’UTR_mut2:
5’-ACAGTTTGTATGGACTACTATCTTAAATTATAGCTTGTTTGGA-3’
DNAJA4_3’UTR_mut3:
5’-TAATTATTGCTAAAGAACTATGTTTTAGTTGGTAATGGTGTAA-3’
DNAJA4_3’UTR_mut4:
5’-CAGCTGCACGGACCAGGTTCCATAAAAACATTGCCAGCTAGTGAG-3’
分析在人黑素瘤皮膚病變中的miRNA表達
根據慣例的IRB指南獲得、處理和分析用在該研究中的全部人類臨 床樣本。從MSKCC獲得來自71個人類患者的原發黑素瘤皮膚病變的石蠟包 埋的切片。通過5個連續的二甲苯洗滌(每次5分鐘)而使樣本脫蠟。在脫 蠟后,通過H&E染色鑒別包含惡性腫瘤的區域,切開,并使用RecoverAll Total  Nucleic Acid Isolation試劑盒(AM1975,Applied Biosystems)從其提取總RNA。 以不知情的方式使用Taqman miRNA測定量化每個樣本中成熟miR-199a-3p、 miR-199a-5p和miR-1908的表達水平。RNU44用作歸一化的內標。比較傾 向于轉移的原發性黑素瘤與未轉移的原發性黑素瘤之間每種miRNA的表達 水平。使用患者的無轉移存活的數據作為對于每個患者腫瘤中的每種miRNA 表達水平的函數,繪制Kaplan-Meier曲線。以前已經記錄了轉移性復發到例 如肺、腦、骨和軟組織的器官,并考慮到鑒別的miRNA的表達水平與轉移 性復發間的關系的回顧性分析。
組織學
用PBS灌注動物,然后通過心內灌注和隨后的氣管內注射用4%的多聚 甲醛固定。切割肺,在4℃于4%的多聚甲醛中孵育過夜,包埋在石蠟中,并 切成5μm厚的增量。對于總的肉眼可見的轉移性結節的可視化,H&E染色 肺切片。對于在小鼠中由人黑素瘤MeWo細胞形成的轉移性結節的內皮含量 分析,用標記小鼠內皮細胞的抗MECA-32的一抗(Developmental Studies  Hybridoma Bank,The University of Iowa,IA)和標記人黑素瘤細胞的人波形蛋 白(VP-V684,Vector Laboratories)雙染色各個肺切片。各種綴合Alexa Flour 染料的二抗用于檢測原發性抗體。為確定轉移性結節內血管密度,使用蔡司 激光掃描共聚焦顯微鏡(LSM 510)測量熒光,并使用ImageJ(NIH)以不 知情的方式量化基于用人波形蛋白共染色而勾勒的每個轉移性結節中的 MECA-32信號。對于在野生型和ApoE遺傳缺失小鼠中由小鼠B16F10小鼠 黑素瘤細胞形成的轉移性結節的內皮含量分析,MECA-32染色代表性的肺切 片,并且以不知情的方式量化基于細胞染色區分的每個結節內的MECA-32 信號。通過背景減除(1個像素的滾球半徑)以及使用預定的閾值作為截止 值,獲得以相對于每個轉移性結節的總面積的血管覆蓋面積的百分比給出的 累積的血管面積。定義轉移性結節為大于2000μm2的總面積的任何區域。對 于大的結節,獲得四個代表性圖像的最小值,并計算它們的平均血管密度。
體內基質膠栓塞(plug)測定
如所示,10μg/mL的重組人ApoE3(4696,BioVision)、10μg/mL的BSA (A2153,Sigma Aldrich)或400ng/ml的VEGF與基質膠(356231,BD  Biosciences)混合。在免疫妥協的NOD-SCID小鼠的腹側正上方皮下注射400 μL的包含所述重組蛋白的基質膠。在注射后3天提取栓塞,并在4%的多聚 甲醛中固定48個小時。然后石蠟包埋栓塞,并且以5μm厚的增量切割。用 抗小鼠內皮抗原MECA-32的一抗(Developmental Studies Hybridoma Bank, The University of Iowa,IA)免疫組織化學染色栓塞截面切片,通過綴合過氧 物酶的二抗檢測,然后通過DAB氧化可視化。為量化內皮細胞侵襲入每個 基質膠栓塞的程度,對于每個栓塞在4~5個隨機區域中計數內皮細胞的數目, 并計算每個指定的栓塞區域中內皮細胞的平均數目。
組織培養
從MSKCC處的患者的Braf突變的黑素瘤軟組織轉移建立SK-Mel-334 原發人黑素瘤系。在體外最小擴增后,體內選擇細胞(Pollack and Fidler, 1982),以產生肺轉移性衍生物SK-Mel-334.2。SK-Mel-239耐威羅菲尼克隆 (C1)為來自Poulikos Poulikakos(Mount Sinai Medical School)的贈品,并 且B-RafV600E/+;Pten-/-;CDKN2A-/-原發性鼠科黑素瘤細胞系由Marcus  Rosenberg(耶魯大學)慷慨地提供。使用的全部其它細胞系購自ATCC。
ApoE Elisa
在處理后72個小時使用ApoE ELISA試劑盒(Innovative Research)量 化在用DMSO、GW3965或T0901317(每種均1μM)處理的黑素瘤細胞無 血清條件培養基中的細胞外ApoE水平。
Western印跡
在冰上于補充蛋白酶抑制劑(Roche)的RIPA緩沖液(Sigma-Aldrich) 中勻漿小鼠肺和腦組織樣本。在冰上于TNET緩沖液(1.5mM的Tris pH 7.5、 150mM的NaCl、2mM的EDTA、1%triton、蛋白酶抑制劑)中勻漿小鼠脂 肪組織。轉移通過SDS-PAGE分離的總蛋白裂解物(2μg)到PVDF膜上, 并用抗小鼠ApoE(ab20874,Abcam)和抗微管蛋白α/β(2148,Cell Signaling) 抗體進行印跡。
黑素瘤臨床樣本中的ApoE表達分析
嚴格地根據IRB指南進行全部實驗樣本的獲得、加工和分析。先前在 MSKCC從患者切除原發性黑素瘤皮膚病變,福爾馬林固定,石蠟包埋,并 切成5μm厚的切片。使用D6E10抗ApoE抗體(ab1906,Abcam)通過雙盲 免疫組織化學分析評估ApoE的蛋白表達。
組織化學
用PBS心臟內灌注動物,然后用4%的多聚甲醛(PFA)固定。固定的 肺包埋在石蠟中,并切成5μm厚的增量。通過H&E染色使肉眼可見的肺轉 移性結節可視化。對于腫瘤內皮細胞含量、增殖和細胞凋亡的分析,分別用 抗MECA-32(Developmental Studies Hybridoma Bank,University of Iowa)、 KI-67(ab15580,Abcam)和裂解的半胱天冬酶3(9661,Cell Signaling)的抗 體染色石蠟包埋的原發性腫瘤切片。
尾靜脈轉移測定
用穩定表達編碼螢光素酶報告基因的逆轉錄病毒構建物(Ponomarev et  al.,2004)轉化用于體內轉移測定的黑素瘤細胞,其允許通過生物發光成像監 測黑素瘤細胞的體內表達。通過尾靜脈靜脈注射重懸在100μL的PBS中的 下列數目的黑素瘤細胞:4×104個MeWo細胞、2.5×105個HT-144細胞、2×105個SK-Mel-334.2細胞、5×104個B16F10細胞和1×105個YUMM細胞。注射 MeWo、HT-144和SK-Mel-334.2細胞到6~8周齡的性別匹配的NOD scid小 鼠中,而注射B16F10和YUMM細胞到6~8周齡的性別匹配的C57BL/6小 鼠中。在評估GW3965對轉移形成的影響的全部實驗中,用對照食物或補充 GW3965(20mg/kg)的食物預處理小鼠10天。為評估GW3965處理對腦轉 移的影響,心臟內注射1×105個MeWo腦轉移性衍生物到無胸腺的裸鼠中。 注釋后立即隨機分配小鼠為對照食物或補充GW3965的食物(100mg/kg)。 為確定口服遞送GW3965是否可抑制初期轉移的進展,用4×104個MeWo細 胞靜脈注射NOD Scid小鼠,并讓細胞定植于肺42天,然后不知情地分配小 鼠為對照食物或補充GW3965(100mg/kg)的食物處理。
原位轉移測定
為確定GW3965處理對從原位分離的黑素瘤細胞的肺定植的效果,皮下 注射1×106個表達螢光素酶報告基因的MeWo細胞到NOD Scid小鼠的兩個 較低的脅腹。當形成測量的體積為~300mm3的腫瘤時,切除腫瘤,并隨機分 配小鼠對照食物或補充GW3965(100mg/kg)的食物處理。在切除腫瘤后一 個月,取出肺,并通過離體生物發光成像測量肺的定植。為了組織學地證實 黑素瘤的肺定植,然后在4%的PFA中固定肺過夜,石蠟包埋,切成5μM的 增量,并染色人波形蛋白(VP-V684,Vector Laboratories)。
產生耐達卡巴嗪的黑素瘤細胞
通過在DTIC(D2390,Sigma-Aldrich,St.Louis,MO)存在下連續地培養 細胞而產生耐達卡巴嗪的B16F10小鼠黑素瘤細胞。首先,用500μg/mL DTIC 處理細胞一周。在該初始的DTIC處理后,讓剩余(~10%)的活細胞恢復一 周,然后加入750μg/mL的DTIC到細胞培養基5天。在這個高劑量的處理 后,在低劑量的DTIC(100μg/mL)的存在下讓細胞恢復一周。然后,在移 植細胞到小鼠中前,在包含200μg/mL的DTIC的細胞培養基中連續地培養 細胞至少一個月。每3天加DTIC到新鮮的癌細胞培養基。對于腫瘤生長實 驗,皮下注射5×104個B16F10親本和耐DTIC細胞到7周齡的C57BL/6小 鼠的下脅腹。在形成測量的體積為5~10mm3的小腫瘤后,隨機分配小鼠到 下面的處理組:(1)對照食物+載體,腹腔注射;(2)對照食物+DTIC腹腔 注射(50mg/kg);(3)補充GW3965的食物(100mg/kg)+載體,腹腔注射。 在檸檬酸的存在下溶解DTIC(重量計1:1)到水中,并通過腹膜內注射每日 施予。在DTIC處理帶有測量的體積為600~800mm3的MeWo腫瘤的小鼠后, 產生耐DTIC的MeWo人黑素瘤細胞系克隆。在最初的兩周期間響應于每日 DTIC劑量(50mg/kg,腹腔注射)的最初腫瘤收縮后,腫瘤最終發展為抗性, 并重新開始生長,在此點分離腫瘤細胞,并建立耐DTIC的MeWo細胞系。 細胞在DTIC(200μg/mL)的存在下體外擴增一周,然后再注射5×105個耐 DTIC的MeWo細胞到8周齡的Nod SCIDγ小鼠。在腫瘤生長至5~10mm3的體積后,不知情地分配小鼠為下面的處理組:(1)對照食物;(2)對照食 物+DTIC(50mg/kg);(3)補充GW3965的食物(100mg/kg)。為確定DTIC 對親本的未選擇的MeWo細胞的腫瘤生長的影響,皮下注射5×105個MeWo 細胞到Nod SCIDγ小鼠中,并在形成測量的體積為5~10mm3的腫瘤后, 用對照載體或DTIC(50mg/kg)處理小鼠。如上述,在間隔2日無處理的間 隔的5個連續的每日處理組成的循環中每日施予DTIC。每周測量腫瘤的生 長兩次。
遺傳引發的黑素瘤進展模型
Dankort等人(2009)先前已經建立并表征了黑素瘤進展的 Tyr::CreER;B-RafV600E/+;Ptenlox/+/Tyr::CreER;B-RafV600E/+;Ptenlox/lox的條件模 型。簡言之,通過以25mg/kg連續3天腹腔內注射花生油中的4-HT(H6278, 70%同分異構體,Sigma-Aldrich,St Louis,MO)而在6周齡誘發這些小鼠中 的黑素瘤。通過在45℃加熱5分鐘并混合以50mg/mL溶解其于100%的EtOH 而制備4-HT的儲備溶液。一旦溶解,則在花生油中稀釋4-HT的儲備溶液 10倍,生產5mg/mL的4-HT工作溶液,其然后被注射到小鼠中。在第一次 注射4-HT后,不知情地分配小鼠接受對照食物或補充GW3965(100mg/kg) 的食物。一周三次檢查小鼠黑素瘤病變的存在和進展。在第35天,從對照處 理的和GW3965處理的小鼠收集背部皮膚樣本,在4%的PFA中固定,并以 10×拍攝。使用ImageJ量化總的皮膚區域中的染色的黑素瘤病變區域的百分 比。對于存活分析,根據標準的身體狀況評分每日監測小鼠的黑素瘤進展并 考慮垂死狀態以及與黑素瘤負擔的進展相關的不適的最初癥狀將其安樂死。 死后,收集肺、腦和唾液腺,并檢查肉眼可見的黑素瘤病變的存在。
小鼠的基因分型
如Jackson Lab所推薦的,使用標準的PCR條件進行全部的小鼠基因分 型。下面的基因分型引物用于各個PCR反應:
Tyr::CreER;B-RafV600E/+;Ptenlox/+和Tyr::CreER;B-RafV600E/+;Ptenlox/lox小鼠:
B-Raf正向:5’-TGA GTA TTT TTG TGG CAA CTG C-3’
B-Raf反向:5’-CTC TGC TGG GAA AGC GGC-3’
Pten正向:5’-CAA GCA CTC TGC GAA CTG AG-3’
Pten反向:5’-AAG TTT TTG AAG GCA AGA TGC-3’
Cre轉基因正向:5’-GCG GTC TGG CAG TAA AAA CTA TC-3’
Cre轉基因反向:5’-GTG AAA CAG CAT TGC TGT CAC TT-3’
陽性內對照正向:5’-CTA GGC CAC AGA ATT GAA AGA TCT-3’
陽性內對照反向:5’-GTA GGT GGA AAT TCT AGC ATC ATC C-3’
ApoE-/-小鼠:
共同的正向:5’-GCC TAG CCG AGG GAG AGC CG-3’
野生型反向:5’-TGT GAC TTG GGA GCT CTG CAG C-3’
突變體反向:5’-GCC GCC CCG ACT GCA TCT-3’
LXRα-/-小鼠:
共同的正向:5’-TCA GTG GAG GGA AGG AAA TG-3’
野生型反向:5’-TTC CTG CCC TGG ACA CTT AC-3’
突變體反向:5’-TTG TGC CCA GTC ATA GCC GAA T-3’
LXRβ-/-小鼠:
共同的正向:5’-CCT TTT CTC CCT GAC ACC G-3’
野生型反向:5’-GCA TCC ATC TGG CAG GTT C-3’
突變體反向:5’-AGG TGA GAT GAC AGG AGA TC-3’
細胞增殖和存活測定:
為確定GW3965、T0901317和蓓薩羅丁對體外細胞生長的影響,2.5×104個黑素瘤細胞一式三份接種在6孔板中,并在每種均1μM的DMSO、 GW3965、T0901317或蓓薩羅丁的存在下培養。在5天后,使用選擇性標記 死亡細胞的臺盼藍染料(72-57-1,Sigma-Aldrich)計數存活的細胞和死亡的 細胞的數目。
細胞侵襲測定
如先前所詳細說明的(Pencheva et al.,2012),使用穿孔基質膠侵襲腔系 統(354480,BD Biosciences)進行細胞侵襲實驗。簡言之,在1μM的DMSO、 GW3965、T0901317或蓓薩羅丁的存在下培養各種黑素瘤細胞56個小時, 然后在每種藥物的存在下,轉變黑素瘤細胞到饑餓培養基(0.2%的FBS)中 16個小時。在饑餓后,接種細胞到涂布基質膠的穿孔插入物中,并讓侵襲測 定在37℃進行24個小時。對于ApoE抗體中和實驗,在測定開始時加40 μg/mL的1D7抗ApoE封閉性抗體(Heart Institute,University of Ottawa,Ottawa, 加拿大)或40μg/mL的抗IgG對照抗體(AB-108-C,R&D Systems,Minneapolis, MN)到每個穿孔插入物。
內皮募集測定
如上述(Pencheva et al.,2012;Png et al.,2012)進行內皮募集測定。用1 μM的DMSO、GW3965、T0901317或蓓薩羅丁處理黑素瘤細胞56個小時, 然后,在每種藥物的存在下將5×104個細胞接種在24孔板中,并在開始測定 前附著16個小時。HUVEC細胞在含有0.2%FBS的EGM-2培養基中血清饑 餓過夜。次日,將1×105HUVEC細胞接種到裝入在包含有癌細胞的每個孔底 部中的3.0μm HTS Fluoroblock穿孔遷移插入物(351151,BD Falcon,San  Jose,CA)。在37℃讓HUVEC細胞向癌細胞遷移20個小時,然后如上述處 理插入物(Pencheva et al.,2012)。對于ApoE抗體中和實驗,40μg/mL的1D7 抗ApoE封閉抗體(Heart Institute,University of Ottawa,Ottawa,加拿大)或 40μg/mL的抗IgG對照抗體(AB-108-C,R&D Systems,Minneapolis,MN)在 測定開始時加到每個穿孔插入物。
基于慢病毒shRNA的基因敲降
如上述(Pencheva et al.,2012;Png et al.,2012),將shRNA整合入通過轉 染6μg的載體A、12μg的載體K和12μg的shRNA質粒到HEK-293T包裝 細胞中而制備的慢病毒顆粒。如上述(Pencheva et al.,2012),在10μg/mL 的聚凝胺(TR-1003-G,Millipore,Billerica,MA)的存在下進行慢病毒shRNA 轉導6個小時。轉導后,擴增細胞72個小時,在2μg/mL的嘌呤霉素(P8833, Sigma-Aldrich)的存在下培養細胞72個小時而進行慢病毒選擇。
使用如下的shRNA序列:
人類:
sh1LXRα: 5’-CCGGCCGACTGATGTTCCCACGGATCTCGAGATCCGTGGGAACATCA GTCGGTTTTT-3’
sh2LXRα: 5’-CCGGGCAACTCAATGATGCCGAGTTCTCGAGAACTCGGCATCATTGA GTTGCTTTTT-3’
sh1LXRβ: 5’-CCGGAGAGTGTATCACCTTCTTGAACTCGAGTTCAAGAAGGTGATAC ACTCTTTTTT-3’
sh2LXRβ: 5’-CCGGGAAGGCATCCACTATCGAGATCTCGAGATCTCGATAGTGGATG CCTTCTTTTT-3’
shApoE: 5’-CCGGGCAGACACTGTCTGAGCAGGTCTCGAGACCTGCTCAGACAGT GTCTGCTTTTT-3’
小鼠:
sh_mLXRα: 5’-CCGGGCAACTCAATGATGCTGAGTTCTCGAGAACTCAGCATCATTGA GTTGCTTTTT-3’
sh_mLXRβ: 5’-CCGGTGAGATCATGTTGCTAGAAACCTCGAGGTTTCTAGCAACATGA TCTCATTTTTG-3’
sh_mApoE: 5’-CCGGGAGGACACTATGACGGAAGTACTCGAGTACTTCCGTCATAGTG TCCTCTTTTT-3’
通過qRT-PCR的基因表達分析:
使用Total RNA Purification試劑盒(17200,Norgen,Thorold,加拿大)從 全細胞裂解物中提取RNA。然后,使用cDNA First-Strand Synthesis試劑盒 (18080-051,Invitrogen)反轉錄600ng的總RNA為cDNA,并且如前述 (Pencheva et al.,2012)使用ABI Prism 7900HT Real-Time PCR System (Applied Biosystems,Austin,TX)進行實時定量PCR擴增。一式四份地進行 每個PCR反應。根據用作內源對照的GAPDH使基因表達歸一化。
使用下面的引物:
人類:
ApoE正向:5’-TGGGTCGCTTTTGGGATTAC-3’
ApoE反向:5’-TTCAACTCCTTCATGGTCTCG-3’
GAPDH正向:5’-AGCCACATCGCTCAGACAC-3’
GAPDH反向:5’-GCCCAATACGACCAAATCC-3’
LXRα_正向:5’-GTTATAACCGGGAAGACTTTGC-3’
LXRα_反向:5’-AAACTCGGCATCATTGAGTTG-3’
LXRβ_正向:5’-TTTGAGGGTATTTGAGTAGCGG-3’
LXRβ_反向:5’-CTCTCGCGGAGTGAACTAC-3’
小鼠:
ApoE正向:5’-GACCCTGGAGGCTAAGGACT-3’
ApoE反向:5’-AGAGCCTTCATCTTCGCAAT-3’
GAPDH正向:5’-GCACAGTCAAGGCCGAGAAT-3’
GAPDH反向:5’-GCCTTCTCCATGGTGGTGAA-3’
LXRα正向:5’-GCGCTCAGCTCTTGTCACT-3’
LXRα反向:5’-CTCCAGCCACAAGGACATCT-3’
LXRβ正向:5’-GCTCTGCCTACATCGTGGTC-3’
LXRβ反向:5’-CTCATGGCCCAGCATCTT-3’
ABCA1正向:5’-ATGGAGCAGGGAAGACCAC-3’
ABCA1反向:5’-GTAGGCCGTGCCAGAAGTT-3’
ApoE促進子活性檢測
使用NheI和SacI限制性內切酶克隆由跨ApoE基因上游的980個 堿基對和下游的93個堿基對的序列組成的ApoE促進子到pGL3-Basic載體 (E1751,Promega Corporation,Madison,WI)的螢火蟲熒光素酶基因的上游。 然后,使用MluI和SacI限制性酶直接克隆多個增強子元件1(ME.1)和2 (ME.2)到ApoE促進子的上游。為評價LXR激動劑的ApoE促進子和 ME.1/ME.2-驅動的轉錄激活,5×104的MeWo細胞接種到24孔板中。次日, 100ng的pGL3-ME.1/ME.2-ApoE促進子構建物和2ng的pRL-CMV海腎熒 光素酶構建物(E2261,Promega)在1μM的DMSO、GW3965或T0901317 的存在下每種條件一式四份共轉化到細胞中。為評價LXRα或LXRβ的轉錄 的激活,接種5×104個表達對照shRNA或靶向LXRα或LXRβ的shRNA的 MeWo細胞到24孔板中。次日,在1μM的DMSO、GW3965或T0901317 的存在下,每種條件一式四份共轉染200ng的pGL3-ME.1/ME.2-ApoE促進 子構建物和2ng的pRL-CMV海腎熒光素酶到細胞中。在24個小時后,裂 解細胞,并使用Dual Luciferase Assay System(E1960,Promega)和Bio-Tek  Synergy NEO Microplate Reader分析細胞裂解物的螢火蟲熒光素酶和海腎熒 光素酶活性。歸一化螢火蟲熒光素酶信號為海腎螢光素酶信號,并且全部的 數據表示為相對于在DMSO處理的對照細胞中測量的熒光素酶活性的比。
使用下述克隆引物:
ApoE-促進子正向:5’-TCA TAG CTA GCG CAG AGC CAG GAT TCA  CGC CCT G-3’
ApoE-促進子反向:5’-TGG TCC TCG AGG AAC CTT CAT CTT CCT  GCC TGT GA-3’
ME.1正向:5’-TAG TTA CGC GTA GTA GCC CCC ATC TTT GCC-3’
ME.1反向:5’-AAT CAG CTA GCC CCT CAG CTG CAA AGC TC-3’
ME.2正向:5’-TAG TTA CGC GTA GTA GCC CCC TCT TTG CC-3’
ME.2反向:5’-AAT CAG CTA GCC CTT CAG CTG CAA AGC TCT G-3’
腫瘤組織化學
從小鼠切除腫瘤,并在4%的多聚甲醛中于4℃固定48個小時。然后, 石蠟包埋腫瘤,并切成5μm厚的增量。對于腫瘤中的內皮細胞含量分析, 用抗小鼠內皮細胞標記物MECA-32的一抗(Developmental Studies  Hybridoma Bank,The University of Iowa,IA)染色腫瘤切片,并用DAPI核染 色復染色。為確定癌細胞增殖和細胞凋亡,分別用抗增殖標記物Ki-67(Abcam, ab15580,Cambridge,MA)和細胞凋亡標記物裂解的半胱天冬酶3(9661,Cell  Signaling,Danvers,MA)的抗體染色腫瘤切片。各種綴合Alexa Flour染料的 二抗用于檢測一抗。用倒置熒光顯微鏡(Zeiss Axiovert 40CFL)測量熒光, 5×的放大率用于MECA-32和Ki-67染色,并且10×的放大率用于裂解的半胱 天冬酶3的染色。通過計算MECA-32或Ki-67陽性染色區域占總的腫瘤面 積的平均百分比而量化內皮細胞含量密度和腫瘤增殖速度。
分析原發性黑素瘤病變中的ApoE表達
在MSKCC從黑素瘤患者切除人原發性黑素瘤皮膚樣本,福爾馬林固定, 包埋在石蠟中,并切成5μm厚的增量。為確定ApoE蛋白質的表達,通過 兩個連續的二甲苯洗滌(每次5分鐘)而使樣本第一次脫石蠟,并以一系列 的乙醇洗滌(100%、95%、80%和70%的EtOH)再水化。通過在蛋白酶K 的存在下(5μg/mL)室溫孵育樣本20分鐘而恢復ApoE抗原。為猝滅內源 的氧化還原酶的活性,在3%的H2O2溶液中孵育切片。然后于室溫在三個連 續的抗生物素蛋白、生物素和馬血清封閉溶液中各封閉切片15分鐘(SP-2001, Vector Laboratories,Burlingame,CA)。通過用D6E10抗ApoE抗體(ab1908, Abcam)染色而檢測ApoE,所述抗體在4℃于PBS中以1:100的稀釋過夜使 用。然后,通過在綴合過氧化物酶的二抗(PK-4002,Vector Laboratories)中 孵育切片并暴露于DAB(SK-4105,Vector Laboratories)氧化反應而識別一抗。 以10×的放大率成像切片,并以盲方式進行分析。通過計數DAB陽性細胞 的數目并測量細胞外ApoE染色的面積而量化ApoE的表達。總的ApoE染色 信號表示為基于用于每個樣本的匹配的H&E染色的切片確定的每個指定的 腫瘤區域的染色區域的百分比。通過繪制作為在患者的原發性黑素瘤病變中 ApoE表達的函數的每個患者的無復發生存數據而產生描述患者的無轉移存 活時間的Kaplan-Meier曲線。其腫瘤具有低于群體的中值ApoE表達的ApoE 水平的患者分類為ApoE陰性,而其黑素瘤表達的ApoE大于中值的患者分 類為ApoE陽性。先前記錄的患者轉移性復發到例如肺、腦、骨、軟組織和 皮下組織和皮膚的位點的歷史記錄使得能夠回顧性確定在原發性黑素瘤位點 的ApoE表達與轉移性復發間的關系。
實施例2內源Mir-1908、Mir-199a-3p和Mir-199a-5p促進人黑素瘤轉移
為了鑒別黑素瘤轉移的miRNA調節子,用染色的MeWo和未染色的 A375人黑素瘤細胞系體內篩選(Pollack and Fidler,1982),以產生多個二代 (LM2)和三代(LM3)肺轉移性衍生物。MeWo-LM2和A375-LM3系的轉 移性潛力的比較顯示這些衍生物在肺定植測定中比它們各自的親本群體顯著 更有效地轉移(圖12A~B)。894個成熟miRNA的基于雜交的小RNA譜及 隨后的定量莖環PCR(qRT-PCR)揭示了四個miRNA(miR-1908、 miR-199a-3p、miR-199a-5p和miR-214)在多個A375和MeWo轉移性衍生 物中相對于各自的親本細胞上調超過兩倍(圖1A~B、12C)。多個轉移性衍 生物的miR-199a-3p、miR-199a-5p、miR-214和miR-1908的顯著誘導表明這 些miRNA的促進轉移的作用。基于生物發光信號定量和總的肺組織學, miR-199a-3p和miR-199a-5p(伴隨miR-199a發夾的過表達)和miR-1908前 體的逆轉錄病毒介導的轉化和過表達導致肺轉移性定植的強勁的增加(圖 1C、12D;9.64倍的增加,對于miR-1908P=0.016;8.62倍的增加,對于 miR-199a,P=0.028),而miR-214過表達未顯著地影響轉移。重要地,每個 miR-199a和miR-1908的過表達均增加了形成的轉移性結節的數目(圖12E), 與這些miRNA在轉移性引發中的作用一致。這些發現還揭示了miR-199a和 miR-1908足以增強轉移性定植。
接著,進行測定以檢查這些miRNA的內源水平是否促進了轉化。 為此,通過miR-Zip技術在高轉移性細胞中抑制了miR-1908和由miR-199a 發夾產生的兩種miRNA(miR-199a-3p和miR-199a-5p)的每種。這些miRNA 各自分別抑制了轉移性定植超過7倍(圖1D;對于miR-1908抑制,P=0.047; 對于miR-199a-3p抑制,P=0.010;對于miR-199a-5p抑制,P=0.015),并 顯著地減小了形成的轉移性結節的數目(圖12F)。
為確定這些miRNA是否還促進獨立細胞系中的轉化,在A375轉移性衍 生細胞系中沉默它們的表達。實際上,抑制miR-1908、miR-199a-3p或 miR-199a-5p顯著地降低了轉移性A375-LM3細胞的肺定植能力(圖1E),確 定這三種miRNA為人黑素瘤細胞轉移的內源促進子。
考慮到miR-1908、miR-199a-3p和miR-199a-5p在人細胞轉移的小鼠模 型中促進黑素瘤轉移的強大功能作用,進行另外的測定以檢查這些miRNA 的表達是否與人原發性黑素瘤病變的轉移的能力相關。為此,以不知情的方 式通過qRT-PCR分析從Memorial Sloan-Kettering Cancer Center(MSKCC)患 者獲得的71個原發性黑素瘤皮膚病變的miR-1908、miR-199a-3p和 miR-199a-5p的表達水平。與上述功能研究一致,與那些未誘導的相比,全 部三種miRNA在轉移的原發性黑素瘤中顯著地被誘導(圖1F;對于 miR-1908,P=0.037;對于miR-199a-3p,P=0.0025;對于miR-199a-5p,P =0.0068for),表明這些miRNA在原發性病變中上調的表達是指示黑素瘤癌 癥進展的早期事件。
實施例3Mir-1908、Mir-199a-3p和Mir-199a-5p促進細胞侵襲和內皮募 集
在該實施例中,進行測定以確定miR-1908、miR-199a-3p和miR-199a-5p 調節轉移的細胞機制。
首先,檢查這些miRNA是否通過增強增殖或腫瘤生長而促進了轉 移。與此相反,每個miRNA的過表達減小了細胞增殖(圖13A)。更重要地, miR-1908過表達未提高原發腫瘤的生長,而miR-199a的過表達實際上導致 腫瘤體積的顯著減小(35%,P<0.001)(圖2A),表明miR-1908和miR-199a 的促轉移(pro-metastatic)的作用對于腫瘤生長促進或增強細胞增殖不是繼 發的。
接下來,檢查這些miRNA是否調節細胞侵襲(關鍵的轉移性表型)。 表達較高水平的這些miRNA的轉移性LM2細胞顯示相對于它們的較低轉移 性親本群體顯著提高的基質膠侵襲能力(圖13B)。因此,過表達miR-199a 和miR-1908各自增強了親本MeWo細胞通過基質膠侵襲的能力(圖2B;對 于miR-199為提高三倍;對于miR-1908為提高二倍)。相反地,miR-199a-3p、 miR-199a-5p和miR-1908各自的抑制顯著地減小了MeWo-LM2(圖2C)以 及A375-LM3(圖2D)轉移性黑素瘤細胞衍生物的侵襲能力。
考慮到這些miRNA對轉移性進展的強的作用,進行進一步的分析,以 檢查它們是否可調節任何促轉移表型。雖然miR-199a或miR-1908的過表達 未調節黑素瘤細胞附著到內皮細胞(圖13C)、抗脫落凋亡(圖13D)、血清 饑餓的條件下的存活(圖13E)或集落形成(圖13F),但是每種miRNA顯 著增強了(超過三倍的提高)親本MeWo細胞在穿孔內皮募集測定中募集內 皮細胞的能力(圖2E)。與此一致,生理地過表達miR-199a和miR-1908的 轉移性Mewo-LM2細胞比它們的親本細胞更有效地募集內皮細胞(圖13G)。 相反地,在轉移性MeWo-LM2(圖2F)和A375-LM3細胞(圖2G)中抑制 miR-199a-3p、miR-199a-5p或miR-1908則抑制了內皮募集,與這些miRNA 增強轉移性黑素瘤細胞的內皮募集能力的要求和充分性一致。
為確定內源miR-199a-3p、miR-199a-5p和miR-1908是否在體內調節轉 移性細胞的內皮募集,通過進行標記人MeWo黑素瘤細胞的人波形蛋白和標 記小鼠內皮細胞的小鼠內皮細胞抗原(MECA-32)的共免疫染色而進行測定, 以檢查轉移性血管的密度。顯著地,抑制miR-199a-3p、miR-199a-5p或 miR-1908各自導致轉移性結節中血管密度的顯著減少(對于miR-199a-3p和 miR-199a-5p平均3倍,對于miR-19084.7倍)(圖2H;對于miR-199a-3p, P<0.001;對于miR-199a-5p,P<0.001for;并且對于miR-1908,P<0.001), 揭示了這些miRNA在促進轉移性內皮細胞含量和轉移性血管生成中的功能。 相反地,每種miRNA在差的轉移性黑素瘤細胞中的過表達顯著地提高了轉 移性血管密度(圖13H)。這些發現揭示了miR-199a-3p、miR-199a-5p和 miR-1908在黑素瘤進展中對于增強侵襲和內皮募集是必要的和充分的。
實施例4Mir-1908、Mir-199a-3p和Mir-199a-5p匯聚地及協同地靶向 Apoe和DNAJA4
在該實施例中,使用系統的和無偏的方法識別這些miRNA直接的分子 靶標。
由于miR-1908、miR-199a-3p和miR-199a-5p介導相同組的體內和 體外表型,并且miR-199a-5p和miR-199a-3p源自相同的前體發夾,所以假 設這些miRNA的促轉移表型可通過共同的靶基因的沉默而產生。考慮到哺 乳動物miRNA主要通過使靶標mRNA轉錄本失穩而起作用(Guo et al.,2010 Nature 466,835-840),在每種miRNA的功能喪失及功能獲得的情況下進行黑 素瘤細胞的轉錄組分析。這揭示了一小組被miR-199a和miR-1908兩者抑制 并在表達這些miRNA的較高內源水平的轉移性LM2衍生物中顯示較低的水 平的基因(圖14A)。定量RT-PCR驗證了兩個在高轉移性LM2細胞中被 miR-199a和miR-1908顯著地調節并被顯著地沉默的基因:代謝基因載脂蛋 白E(ApoE)和熱激蛋白DNAJA4(圖3A和圖14B-D)。
為確定ApoE和DNAJA4是否直接被miR-1908、miR-199a-3p和 miR-199a-5p靶向,通過異源的螢光素酶報告基因檢查每種miRNA對其假定 基因的穩定性的影響。有趣地,miR-199a的過表達抑制了ApoE和DNAJA4 二者的3’非翻譯區(UTR)和編碼序列(CDS)的穩定性,而miR-1908的 過表達使ApoE的3’UTR和DNAJA4的3’UTR和CDS失穩。與直接靶向一 致,突變每個靶上的miRNA互補序列消除了miRNA介導的調控(圖3B)。 在內源靶向的直接試驗中,轉移性LM2細胞中單個miRNA抑制導致提高的 靶標穩定性(圖3C),其在突變miRNA靶向位點時則被去除(圖14E),揭 示了ApoE被miR-1908和miR-199a-5p直接靶向,而DNAJA4直接地被三 種miRNA靶向(圖3D)。重要地,這兩個基因的CDS和3’UTR在表達三種 調節miRNA的生理更高水平的高轉移性LM2細胞中較不穩定,表明這些 miRNA的ApoE和DNAJA4的內源靶向與黑素瘤轉移相關(圖3E)。
考慮到miR-199a-3p、miR-199a-5p和miR-1908對共同靶基因的分子的 匯聚性,接下來檢查這些靶標(ApoE和DNAJA4)是否調節這些miRNA產 生的轉移性表型。在轉移性LM2細胞中過表達每個基因導致細胞侵襲和內皮 募集表型的顯著減少(圖3F~G、14F)。相反地,在差的轉移性細胞中使用 獨立的發夾敲降ApoE或DNAJA4顯著地增強了細胞侵襲和內皮募集(圖 3H~I,14G),揭示了ApoE和DNAJA4的作用為這些促轉移表型的內源抑 制子-與上述轉移促進miRNA的靶向一致。
實施例5ApoE和DNAJA4介導依賴于miR-199a和miR-1908的轉移性侵 襲、內皮募集和定植
為確定ApoE和DNAJA4是否是miR-199a和miR-1908下游的直接生物 效應子,進行測定,以檢查這兩個靶向基因是否上位地與每個miRNA相互 作用。如預期地,miRNA沉默降低了高轉移性黑素瘤細胞的侵襲和內皮募集 性能。重要地,在miRNA抑制的條件下ApoE或DNAJA4的敲將顯著地堵 塞了沉默每種miRNA時侵襲(圖4A和4C)及內皮募集(圖4B和4D)的 抑制。顯著地,在減少miR-1908或miR-199a-5p的細胞中這些基因的任一種 的敲降完全挽救了由miRNA抑制產生的轉移性定植的顯著抑制(圖4E~F, 15E)。相反地,在過表達miR-1908(圖4G-H、15F)或miR-199a(圖15G-I) 的細胞中ApoE或DNAJA4的過表達足以抑制細胞侵襲和內皮募集。此外, ApoE或DNAJA4的過表達足以抑制miRNA介導的轉移性定植(圖15J)。 重要地,高轉移性A375-LM3細胞的miRNA依賴的增強的細胞侵襲和內皮 募集(圖4I-J,15K)也需要ApoE和DNAJA4。
為確定ApoE和DNAJA4是否還體內調節miRNA依賴的轉移性內皮募 集,在miRNA抑制的條件下通過這些基因的每個的細胞敲降而形成的肺轉 移性結節中進行黑素瘤轉移(人波形蛋白)和內皮細胞(MECA-32)的共免 疫染色。顯著地,敲降ApoE或DNAJA4導致在具有miRNA沉默的細胞中 產生的轉移中顯著(>3.5倍)提高了轉移性血管密度(圖4K,對于ApoE和 DNAJA4敲降細胞,P<0.01)。這些發現揭示了ApoE和DNAJA4是黑素瘤 中這些促轉移miRNA誘導的miRNA依賴的轉移性侵襲、定植和內皮募集表 型的直接的下游效應子。
實施例6黑素瘤細胞分泌的Apoe是侵襲和內皮募集的必要且充分的調 節子,而Apoe的基因缺失促進了轉移
ApoE為分泌的因子。因此,可檢查黑素瘤細胞分泌的ApoE是否可抑制 侵襲和內皮募集。因此,通過ELISA檢測的細胞外ApoE水平在轉移性LM2 細胞中比在較少轉移的親本細胞中低3.5倍-轉移性LM2細胞表達更高水 平的miR-199a和miR-1908(圖5A)。內源miR-199a和miR-1908還顯著地 抑制了分泌的ApoE水平(圖5B和16A)。
接下來,通過使用中和抗體(1D7)抑制ApoE增強了表達高內源 水平的ApoE的親本MeWo細胞的細胞侵襲(圖5C;1.68倍提高)和內皮募 集(圖5D;1.84倍提高),所述中和抗體識別ApoE的受體結合結構域(圖 14C)。相反地,加入重組人ApoE顯著地抑制了轉移性LM2細胞的侵襲和內 皮募集(圖5E),轉移性LM2細胞顯示了低的內源ApoE水平(圖14C)。 重要地,加入重組的ApoE未影響黑素瘤細胞或內皮細胞在血清饑餓的條件 下的體外增殖(圖16B~C)或存活(圖16D~E),表明重組ApoE對這些表 型的抑制對降低的增殖或破壞的存活不是繼發的。與ApoE是miR-199a和 miR-1908的上位下游一致,用ApoE中和抗體1D7中和ApoE顯著地取消 了每個miRNA抑制所觀察到的抑制的侵襲和內皮募集表型(圖5F~G)。上 述發現揭示了黑素瘤細胞分泌的ApoE是黑素瘤中miRNA依賴的侵襲和內皮 募集表型的必要的和充分的抑制子。
進行進一步的檢測,以研究未得到良好表征的熱激蛋白DNAJA4介導內 皮募集和侵襲的機制。考慮到ApoE和DNAJA4顯示的表型的共性,假設 DNAJA4可起調節作用,并提高ApoE的水平。實際上,DNAJA4的敲降降 低了ApoE的轉錄水平(圖16F)以及分泌的ApoE水平(圖5H),而DNAJA4 過表達顯著地提高了ApoE的表達(圖16G)。與在ApoE的上游作用的 DNAJA4一致,加入重組ApoE消除了DNAJA4敲降時所觀察到的增強的細 胞侵襲和內皮募集表型(圖5I~J)。相反地,ApoE的抗體中和顯著地阻塞了 DNAJA4過表達表型所觀察到的侵襲和內皮募集的抑制(圖16H~I)。這些 發現揭示了DNAJA4通過ApoE表達和產生的分泌的正調控而抑制了黑素瘤 侵襲和內皮募集。
考慮到三種轉移促進miRNA與DNAJA4基因對ApoE的調控的匯聚性, 進行檢測以確定ApoE表達是否與人黑素瘤進展相關。為此,在痣、原發性 的和轉移性病變中分析公開的ApoE的基于陣列的表達數據(Haqq et al.,2005 Proc.Natl.Acad.Sci.U S A 102,6092-6097)。與轉移抑制功能一致,ApoE在 遠端器官轉移中的水平相對于原發性(P<0.025)和痣病變(P<0.0003)顯 著地低(圖5K)。
考慮到其與人黑素瘤進展顯著的相關,接下來檢查黑素瘤細胞中提高的 ApoE信號是否在抑制黑素瘤轉化中具有治療效果。更具體地,在注射到小 鼠前,用重組ApoE或BSA預培養轉移性MeWo-LM2細胞24個小時。顯著 地,用ApoE預處理癌細胞強烈地抑制轉移性定植超過300倍(圖5L)。該 黑素瘤細胞的ApoE預培養顯著地抑制了轉移,反應了ApoE對黑素瘤細胞 的作用對于轉移引發是關鍵的,因為用ApoE預處理的細胞呈現減小的侵襲 能力,需要侵襲能力以開始導致肺定植的轉移性事件。
考慮到ApoE對轉移和轉移性表型發揮的強的影響,以及其與人黑素瘤 進展強的相關性,進行進一步的檢測,以研究系統的ApoE基因缺失對黑素 瘤轉移的免疫活性小鼠模型中的黑素瘤進展的影響。與細胞外ApoE在轉移 中主要的抑制功能一致,注射到循環系統中的B16F10小鼠黑素瘤細胞在 ApoE遺傳缺失小鼠中呈現比它們的野生型同窩出生仔畜大7倍的轉移性定 植的提高(圖5M)。這些發現證實了系統和癌癥分泌的ApoE是人和小鼠黑 素瘤轉移的強的抑制子。
實施例7細胞外ApoE發散地靶向黑素瘤細胞LRP1和內皮細胞LRP8 受體
在這個實施例中,進行檢測,以研究ApoE抑制轉移的分子機制。
為了鑒別介導侵襲的ApoE受體,敲降黑素瘤細胞中全部四個已知的 ApoE受體VLDLR、LRP1、LRP8和LDLR(Hatters et al.,2006Trends Biochem. Sci.31,445-454;Hauser et al.,2011 Prog.Lipid Res.50,62-740。有趣地,敲降 LRP1而非其它ApoE受體消除了由重組ApoE引起的細胞侵襲抑制效果(圖 6A)。重要地,顯示低水平的ApoE的轉移性LM2細胞的LRP1敲降僅輕度 提高了細胞侵襲(圖17A),表明內源ApoE介導的LRP1的作用。
為確定LRP1是否還調節對侵襲和轉移性定植的miRNA依賴的作用,在 miRNA抑制的環境下敲降LRP1。在miRNA沉默的條件下LRP1的敲降恢復 了由miRNA抑制產生的侵襲抑制表型(圖6B、17B)。與這些體外結果一致, LRP1敲降顯著地增強了沉默miR-1908的LM2細胞的體內轉移性定植(圖 6C、17C)。這些發現揭示了LRP1是miRNA/ApoE依賴性的黑素瘤侵襲和 轉移性定植的上位性下游。
雖然侵襲表型反映了ApoE對黑素瘤細胞的細胞自主的作用,內皮募集 表型表明了癌細胞表達的ApoE直接對內皮細胞的非細胞自主作用。與此一 致,用ApoE預處理內皮細胞顯著地減小了它們遷移到高轉移癌細胞的能力 (圖6D)。為了識別介導內皮募集表型的內皮細胞上的ApoE受體,敲降內 皮細胞上全部四個已知的ApoE受體。有趣地,與癌細胞侵襲不同,內皮LRP8 而非其它受體的任一個的敲降選擇性并顯著地消除了由miRNA沉默引起的 對內皮募集的抑制(圖6E、17D-E)。這些發現與LRP8受體為對內皮募集的 miRNA/ApoE依賴的作用的下游內皮調節子一致。
接下來,進行檢測以檢查ApoE/LRP8信號是否還調節無癌細胞的系 統中總的內皮遷移。因此,存在于內皮細胞培養基中的ApoE的抗體的中和 顯著地增強了內皮遷移(圖6F),而重組ApoE在穿孔測定(圖6G)以及基 于梯度的趨化性檢測(圖6H))中足以以內皮細胞LRP8受體依賴的方式抑 制內皮遷移。重要地,加入ApoE導致體內VEGF誘導的內皮募集到皮下基 質膠栓塞的顯著抑制(大于40倍)(圖6I)。
考慮到ApoE在介導內皮募集中的必要性和充分性,進行進一步的測定 以檢查系統性的ApoE是否可調節轉移性血管生成。與黑素瘤細胞分泌的 ApoE對轉移性內皮內含物的強的抑制相一致(圖4K),與它們的野生型同 窩出生仔畜相比,遺傳缺失ApoE的小鼠顯示在B16F10小鼠黑素瘤細胞形 成的它們的肺轉移性結節中更高的血管密度(圖6J:2.41倍的增加,P= 0.0055)。總之,上述發現揭示了ApoE在轉移抑制中通過黑素瘤細胞LRP1 和內皮細胞LRP8受體介導的發散信號的雙重細胞自主/非細胞自主功能。
實施例8MiR-199a-3p、miR-199a-5p和miR-1908在黑素瘤轉移中作為強 的預后和治療靶標
為檢查文中描述的轉移促進子miRNA是否可用作轉移性結果的臨床預 測物,在獲自MSKCC患者的一隊人黑素瘤樣本中通過qRT-PCR以不知情的 方式量化miR-199a-3p、miR-199a-5p和miR-1908的表達水平。然后,確定 這些miRNA在原發性的黑素瘤病變中的水平和轉移性復發結果之間的關系。
重要地,其原發性黑素瘤病變表達更高(大于群體中值)水平的 miR-199a-3p、miR-199a-5p或miR-1908的患者更可能發展末端的轉移,并呈 現比其原發性黑素瘤表達更低水平的這些miRNA的每種的患者顯著短的無 轉移存活時間(圖7A-C,對于miR-199a-3p,P=0.0032,對于miR-199a-5p, P=0.0034,并且對于miR-1908,P=0.027)。顯著地,三種miRNA合計的 表達水平在分級具有高的轉移復發風險的患者與具有非常低的轉移復發風險 的患者中顯示最強的預后年齡(圖7D,P<0.0001)。這些臨床發現與這些 miRNA在癌癥進展調控中的的功能協同一致,并顯示這些分子是黑素瘤轉移 的臨床預后生物標記物。
考慮到目前缺少對預防黑素瘤轉移的有效治療的選擇,以及三種調節性 miRNA在黑素瘤轉移中的強的預后價值,這些miRNA治療性地靶向使用反 義LNA的治療(Elmer et al.,2008(a);Elmer et al.,2008(b))。用與成熟的 miR-199a-3p、miR-199a-5p或miR-1908反義的LNA寡核苷酸預處理的高轉 移性MeWo-LM2細胞呈現減小大約四倍的轉移性活性。考慮到這些miRNA 之間協同性的臨床證據,檢查了沉默全部三種miRNA對轉移性進展的影響。 顯著地,共轉染抗全部三種miRNA的LNA抑制了轉移性定植超過7倍,揭 示了內源miR-199a-3p、miR-199a-5p和miR-1908之間顯著的協同作用和協 同性(圖7E,P=0.004)。重要地,用三種LNA預處理這些miRNA的抑制 未導致體外增殖的減小(圖18A),表明顯著的轉移抑制表型不繼發于破壞的 增殖。在獨立的A375轉移性衍生系中組合的LNA介導的miRNA靶向還顯 著地抑制肺定植(圖18B)。
接下來,檢查組合的LNA誘導的miRNA抑制是否可抑制全身性的 黑素瘤轉移到多個末端器官。實際上,心臟內注射用靶向三種調控性miRNA 的LNA的組合預處理的高轉移性黑素瘤細胞揭示了內源miR-199a-3p、 miR-199a-5p和miR-1908促進全身性的黑素瘤轉移(圖7F)。組合的LNA 介導的三種miRNA的抑制導致末端位點(例如腦和骨,圖7H~I)中全身性 轉移性病灶數目減小(圖7G)。
進行進一步的檢測,以檢查全身地施予體內優化的LNA在黑素瘤轉化 預防中的治療效果。為此,注射高轉移性的MeWo-LM2細胞到小鼠中。次 日,以兩周為基礎,用低的總劑量(12.5mg/kg)的靶向miR-199a-3p、 miR-199a-5p和miR-1908的LNA靜脈注射治療小鼠四周。顯著地,組合的 LNA治療降低了肺的定植9倍(圖7J,P=0.031),而沒有任何明顯的毒性 的信號(圖18C)。總之,上述發現揭示了匯集到ApoE信號上的新的miRNA 依賴的調控網絡,以控制黑素瘤轉移性進展的細胞自主和非細胞自主特征(圖 7K)。上述基礎研究已經識別了一組在黑素瘤的臨床治療中具有強大的預后 和治療潛力的miRNA。
實施例9Apoe/LRP1信號的依賴于miRNA的靶向促進了通過CTGF誘導 的癌細胞的侵襲和內皮募集
在這個實施例中,識別結締組織生長因子(CTGF)為ApoE/LRP1信號 在癌細胞侵襲和內皮募集中的下游調節子。由qRT-PCR分析和ELISA確定 的CTGF的表達水平通過ApoE/LRP1信號調節(圖8A、8B和8C)。此外, 由CTGF介導ApoE/LRP1調節的癌細胞侵襲和內皮募集(圖8D、8E)。
實施例10CTGF介導miRNA依賴的轉移性侵襲、內皮募集和定植
在這個檢查中,進行測定以研究CTGF是否調節依賴于miRNA的侵襲 和內皮募集。簡言之,在靶向CTGF的封閉抗體的存在下,對過表達miR-199a 或miR-1908的親本MeWo細胞進行穿孔細胞侵襲和內皮募集測定。實際上, 發現依賴于mir-199a和mir-1908的轉移性侵襲和內皮募集由CTGF介導(圖 9A和9B)。為了研究體內黑素瘤轉移(轉移性定植)是否由CTGF介導,在 過表達miR-199a或miR-1908的條件下通過5×104個敲降CTGF的親本MeWo 細胞對肺轉移進行生物發光成像。在該條件下敲降CTGF導致體內黑素瘤轉 移的顯著減少(圖9C)。
實施例11用LXR激動劑GW3965處理提高了黑素瘤細胞ApoE和 DNAJA4的水平,并抑制了癌細胞的侵襲、內皮募集和轉移性定植
先前已經顯示了肝臟X受體(LXR)的小分子激動劑提高了Apo E的水 平。為了研究通過LXR活化提高Apo-E的水平是否導致治療益處,進行測 定,以評估LXR激動劑GW3965[化學名稱:3-[3-[N-(2-氯代-3-三氟代甲基 芐基)-(2,2-二苯基乙基)氨基]丙氧]苯乙酸鹽酸鹽])對Apo-E水平、腫瘤細胞侵 襲、內皮募集和體內黑素瘤轉移的作用(圖10)。在治療濃度的GW3965的 存在下培養親本MeWo細胞提高了ApoE和DNAJA4的表達(圖10A和10B)。 用GW3965預處理MeWO細胞減少了腫瘤細胞的侵襲(圖10C)和內皮募 集(圖10D)。為檢測GW3965是否可抑制體內轉移,給于小鼠包含GW3965 (20mg/kg)的基于谷物的飼料或對照飼料,并在尾靜脈注射4×104個親本 MeWo細胞到小鼠后使用生物發光檢測肺的轉移(圖10E)。以該方式口服施 予GW3965給小鼠導致體內黑素瘤轉移的顯著減少(圖10E)。
實施例12鑒別Mir-7為黑素瘤轉移的內源抑制子
在該實施例中,識別miR-7為黑素瘤轉移的內源抑制子(圖11)。為測 試miR-7是否抑制了體內黑素瘤的轉移,使用miR-Zip技術在親本MeWo細 胞中敲降其表達(圖11A)。在靜脈注射4×104個表達miR-7的短的發夾 (miR-Zip)抑制子(miR-7KD)的親本MeWo細胞后,肺轉移性定植的生 物發光成像圖顯著地提高了體內的肺轉移(圖11A)。相反地,miR-7在LM2 細胞中的過表達顯著地減小了體內肺轉移(圖11B)。
癌癥的復雜性需要使用系統性分析(Pe’er and Hacohen,2011)。通過系 統性全局的方法,揭示了miRNA的協同的網絡。miRNA i)在高轉移性的人 黑素瘤細胞中被上調,ii)對于黑素瘤中轉移性定植和血管生成是必要且充 分的,以及iii)是人黑素瘤轉移復發的強的病理預測因子。通過基于轉錄組 的及生物學指導的靶向識別方法,發現miR-1908、miR-199a-3p和 miR-199a-5p會聚地靶向熱激因子DNAJA4和代謝基因ApoE。轉移對每一種 單獨miRNA的需要表明這三種會聚的miRNA在促進黑素瘤轉移中是非冗余 的,同時,通過組合的miRNA抑制獲得的強的協同轉移抑制揭示了這些 miRNA之間的功能協同,通過對ApoE和DNAJA4的最大沉默而假定獲得。 鑒別ApoE為被三種轉移促進的miRNA負向調節的基因,被轉移抑制基因 (DNAJA4)正調節,并在臨床轉移樣本中被沉默,突出了該基因作為黑素 瘤進展的抑制子的顯著性。
實施例13鑒別LXRβ信號為黑素瘤中新的治療靶標
為了鑒別在黑素瘤中顯示廣泛表達的細胞核激素受體,檢查了在人黑素 瘤細胞系的NCI-60聚集(collection)中全部細胞核激素受體家族成員的表達 水平。數個受體在多個黑素瘤系中呈現穩定的表達,表明它們可代表黑素瘤 中新的潛在的靶標(圖19A和20A)。顯著地,這些中,肝臟X受體(LXR) 先前已經顯示在脂肪細胞和巨噬細胞中增強ApoE的轉錄(Laffitte et al., 2001),而發現RXR的藥學活化驅動ApoE在臨床前阿爾茨海默病模型中的 表達(Cramer et al.,2012)。
考慮到最近公開的ApoE在黑素瘤中的轉移抑制功能(Pencheva et al., 2012),LXRβ和RXRα在黑素瘤中的普遍的基底表達,以及治療地活化LXR 和RXR的藥學制劑的可用性,研究了黑素瘤細胞中LXR或RXR的活化是 否可抑制黑素瘤進展表型。考慮到例如ER和AR的細胞核激素受體在調節 乳腺和前列腺癌細胞的增殖中確立的功能,首先檢查了LXR或RXR在黑素 瘤細胞中的藥理激活是否可體外影響細胞的生長。
用兩種結構不同的LXR激動劑GW3965 2或T0901317 1或RXR激動劑 蓓薩羅丁處理黑素瘤細胞未影響細胞增殖或細胞的存活率(圖20B-C)。接 著評估了LXR或RXR活化對細胞侵襲和內皮募集—轉移性黑素瘤和轉移性 乳腺癌群體顯示的表型—的影響(Pencheva et al.,2012;Png et al.,2012)。突 變上不同的MeWo(B-Raf/N-Ras野生型)、HT-144(B-Raf突變體)和SK-Mel-2 (N-Ras突變體)人黑素瘤系以及SK-Mel-334.2(B-Raf突變體)原發性人黑 素瘤系用GW3965 2或T0901317 1處理一致地抑制了黑素瘤細胞通過基質膠 侵襲的能力,以及在穿孔測定中募集內皮細胞的能力(圖19B~C)。與之相 比,用蓓薩羅丁處理僅在一半的實驗的黑素瘤系中抑制了侵襲,并且它不顯 著地影響內皮募集表型(圖19B~C)。
考慮到LXR在多個黑素瘤系中廣泛地抑制細胞侵襲和內皮募集二者優 于RXR激動劑,研究了在調節LXR激動劑的抑制作用中對LXR信號的需 要。敲降黑素瘤LXRβ而非LXRα消除了GW3965 2和T0901317 1抑制侵襲 和內皮募集的能力(圖19D~G和圖20D~G),揭示了黑素瘤細胞LXRβ是誘 發這些體外表型的抑制中LXR激動劑的功能靶標。該分子發現與黑素瘤細胞 表達的主要LXR同種型LXRβ一致(圖19A,P<0.0001)。
LXRβ在黑素瘤中的普遍的基礎表達可能反映了LXR在控制脂質運輸、 合成和分解代謝中的總的功能(Calkin and Tontonoz,2013)。在這樣的穩定的 LXRβ表達對保持黑素瘤細胞代謝和生長很關鍵的同時,還使得LXR信號是 黑素瘤的廣譜治療靶向的有吸引力的候選物。
實施例14LXR激動劑的治療性遞送抑制了黑素瘤的腫瘤生長
最初開發LXR激動劑作為用于降低患有血脂障礙和動脈粥樣硬化的患 者中的膽固醇的口服藥物候選物(Collins et al.,2002;Joseph and Tontonoz, 2003)。在它們在大的動物預臨床模型中不能夠減小血脂水平后,在臨床上拋 棄了這些化合物(Groot et al.,2005)。
考慮到GW3965 2和T0901317 1體外抑制黑素瘤進展表型的強的能力 (圖19B~C),研究了治療性LXR活化是否可用于治療黑素瘤。實際上,在 形成測量的體積為5~10mm3的皮下腫瘤后,以低的劑量(20mg/kg)口服施 予GW3965 2或T0901317 1分別抑制了侵襲性B16F10小鼠黑素瘤細胞在免 疫活性模型中的腫瘤生長67%和61%(圖21A-B)。施予更高的LXR激動劑 劑量(100mg/kg)導致腫瘤生長減少80%(圖21A),與劑量依賴性抑制作 用一致。
口服施予GW3965 2還強列地抑制了MeWo(70%的抑制)和SK-Mel-2 (49%的抑制)人黑素瘤細胞系以及SK-Mel-334.2原發性人黑素瘤系(73% 抑制)的腫瘤生長(圖21C-E和圖22A)。
受LXR激動劑對小的腫瘤(5~10mm3)的強的腫瘤抑制作用所鼓舞(圖 21A-E),接著研究了LXR活化治療是否可抑制大的(~150mm3)腫瘤的生 長。
發現GW3965 2治療導致建立的大的B16F10腫瘤大約50%的降低(圖 21F)。重要地,建立腫瘤后,治療性遞送GW3965 2實質上延長了注射小鼠 B16F10細胞的免疫活性小鼠、具有來源于人MeWo的已建立黑素瘤系的腫 瘤異種移植的免疫妥協小鼠以及SK-Mel.334-2原發性人黑素瘤系的總的存 活時間(圖21G~I)。這些發現與多種突變亞型的黑變的以及無黑變的已建立 的黑素瘤腫瘤的LXR活化治療的廣譜反應性一致:B-Raf和N-Ras野生型 (B16F10和MeWo;圖21A~C)、B-Raf突變體(SK-Mel-334.2;圖21D)和 N-Ras突變體(SK-Mel-2;圖21E)。
接著嘗試確定LXR激動劑在抑制腫瘤生長中調節的細胞生物學表型。 與GW3965 2對黑素瘤細胞體外對內皮募集的抑制作用一致,GW3965 2給 藥導致腫瘤的內皮細胞內含物大約2倍的減少(圖21J)。該效果伴隨了體內 活性增殖腫瘤細胞的數目的不大(modest)的減小(23%)(圖21K),而沒 有凋亡細胞數目的變化(圖21L)。這些結果表明,除了減小局部的腫瘤侵襲, LXR活化主要通過抑制腫瘤的血管生成而抑制了黑素瘤腫瘤生長,導致體內 增殖的降低。
實施例15LXR激動抑制黑素瘤轉移到肺和腦,并抑制初期轉移的進展
LXR激動劑對黑素瘤腫瘤生長強的抑制作用促使我們檢查LXR活化是 否還可抑制黑素瘤細胞的轉移性定植。為此,用GW3965 2預處理人MeWo 黑素瘤細胞導致它們的轉移性定植能力超過50倍的降低(圖23A)。考慮到 這個顯著的抑制效果,接下來評估了口服施予LXR激動劑抑制轉化的能力。 口服施予GW3965 2或T0901317 1的免疫妥協的小鼠分別經歷了人MeWo 細胞的肺轉移性定植31倍和23倍的降低(圖23B-C)。GW3965 2治療還抑 制了HT-144黑素瘤系(圖23D)以及SK-Mel-334.2原發性黑素瘤系(圖23E) 的轉移性定植。
GW3965 2為有效地跨越血腦屏障并在腦中有效地活化LXR信號的 親脂性分子。與此一致,先前已經顯示口服遞送GW3965 2在阿爾茨海默病 的臨床前模型中改善了淀粉樣蛋白斑病理和記憶缺失(Jiang et al.,2008)。因 此,我們想知道LXR激動是否可在抑制黑素瘤腦轉移(急需有效治療的可 怕的黑素瘤后果)呈現治療活性(Fonkem et al.,2012)。顯著地,口服施予 GW3965 2抑制了在心臟內注射來源于MeWo親本系的腦轉移性黑素瘤細胞 后系統傳播和腦定植(圖23F)。這些結果揭示了LXR活化治療在多個黑素 瘤系和多個遠端器官轉移性位點的強的轉移抑制。
受在抑制轉移形成中強的作用所鼓舞(圖23A-F),接下來嘗試了確定 LXR活化治療是否可停止已經轉移散布的黑素瘤細胞的進展。首先檢測了 GW3965 2抑制在去除原發性腫瘤后從原位傳播的黑素瘤細胞肺定植的能力 (圖23G)。重要地,腫瘤切除后口服施予GW3965 2抑制了散播的黑素瘤 細胞的肺定植17倍(圖23H)。顯著地,用GW3965 2處理小鼠還顯著地抑 制了(28倍)在接種時從基線進展8倍的初期肺轉移的定植(圖23I)。與 LXR活化抑制轉移性引發一致,GW3965 2處理減少了形成的肉眼可見的轉 移性結節的數目(圖23J)。最終,在該‘輔助’(adjuvant)預臨床語境下用 GW3965 2處理小鼠顯著地延長了它們在轉移性定植后的存活時間(圖23K)。
實施例16LXR活化降低了黑素瘤遺傳驅動的小鼠模型中的黑素瘤進展 和轉移
通過在Braf致癌基因中發現的一個具有單氨基酸變異的主要突變體 B-RafV600E的激活突變而標記了大約60%的人黑素瘤腫瘤(Davies et al., 2002)。將近20%的黑素瘤呈現B-Raf中的激活突變,具有Pten腫瘤抑制子 的同時沉默,其驅動了惡性黑素瘤狀態的進展(Tsao et al.,2004;Chin et al., 2006)。最近,酪氨酸酶(Tyr)驅動的條件B-Raf活化和Pten缺失顯示在驅 動小鼠黑素瘤進展中遺傳地協同(Dankort et al.,2009)。
為確定LXR活化是否可以該遺傳引發的方式抑制黑素瘤進展,在 Tyr::CreER;B-RafV600E/+;Ptenlox/+和Tyr::CreER、B-RafV600E/+;Ptenlox/lox小鼠中通 過腹腔注射4-羥基他莫昔芬(4-HT)而誘導黑素瘤。顯著地,在引發黑素瘤 后口服施予GW3965 2減弱了腫瘤進展,并顯著地延長了PTEN雜合型 Tyr::CreER、B-RafV600E/+、Ptenlox/+以及PTEN純合型Tyr::CreER、 B-RafV600E/+;Ptenlox/lox小鼠de總的存活時間(圖24A-B和圖25A-B)。接下來, 檢測了GW3965 2在該遺傳背景下抑制黑素瘤轉移的性能。盡管在4-HT處 理的Tyr::CreER;B-RafV600E/+;Ptenlox/lox對照小鼠的肺或腦中未檢測到肉眼 可見的轉移,一致性地觀察到黑素瘤轉移到唾液腺淋巴結。重要地,用 GW3965 2治療的Tyr::CreER;B-RafV600E/+;Ptenlox/lox小鼠呈現死后檢測到的 淋巴轉移數目的減少(圖24C)。這些發現表明,除了其對原發性黑素瘤腫瘤 進展的抑制之外,LXR活化抑制了遺傳驅動的黑素瘤模型中的原位轉移。
B-Raf活化和Pten缺失在驅動黑素瘤進展中的協同可進一步被在家族黑 素瘤中經常突變的細胞周期調節子CDKN2A的失活所增強(Hussussian et al., 1994;Kamb et al.,1994)。因此,檢查了LXR活化對B-RafV600E/+;Pten-/-; CDKN2A-/-黑素瘤的影響,允許我們在更進攻性的遺傳驅動的黑素瘤進展模型 中檢測LXR激動的治療效果。重要地,GW3965 2的治療性遞送有力抑制了 注射到同基因型免疫活性小鼠中的B-RafV600E/+;Pten-/-;CDKN2A-/-原發性小 鼠黑素瘤細胞的腫瘤生長和肺轉移,并延長了具有B-RafV600E/+;Pten-/-; CDKN2A-/-黑素瘤負荷的小鼠的總的存活(圖24D-F)。總之,獨立的異種移 植和遺傳誘導的呈現人黑素瘤的不同的突變譜的免疫活性黑素瘤小鼠模型中 的黑素瘤進展的強抑制刺激了LXR活化治療的臨床試驗。
實施例17LXRβ的藥理活化通過轉錄地誘導黑素瘤細胞的ApoE表達而 抑制了黑素瘤表型
接下來,我們試圖確定介導黑素瘤進展的抑制的LXRβ的下游分子靶標。 為此,描繪了用LXR激動劑GW3965 2處理的人MeWo黑素瘤細胞的轉錄 組。
在365個響應于LXR活化而顯著地誘導的基因中,鑒別了先前驗證的巨 噬細胞和脂肪細胞中LXR的轉錄靶標ApoE(Laffitte et al.,2001)為黑素瘤 細胞中的上部(top)上調的分泌因子(圖26)。定量實時PCR(qRT-PCR) 驗證揭示了在多個人黑素瘤系中用獨立的LXR激動劑處理后,ApoE轉錄表 達的強的上調(圖27A~C)。
考慮到先前報道的ApoE在黑素瘤中的轉移抑制功能(Pencheva et al., 2012),我們研究了LXRβ活化是否通過ApoE的轉錄誘導抑制黑素瘤的進展。 實際上,發現GW3965 2和T0901317 1增強了包含融合到以前表征的兩個結 合LXR的多增強子元件(ME.1或ME.2)(Laffitte et al.,2001)任一個的ApoE 促進子的螢光素酶報告基因構建物的黑素瘤細胞驅動活性(圖28A)。重要地, 該轉錄誘導導致分泌的ApoE蛋白質的提高的水平(圖28B)。與ApoE在黑 素瘤細胞中直接的LXRβ靶向一致,用抗體中和細胞外ApoE完全阻止了 LXRβ介導的細胞侵襲和內皮募集的抑制,并進一步增強了相對于對照IgG 處理的這些表型(圖28C-G和圖27D-F),揭示了被細胞外ApoE調節的LXR 激動的作用。
此外,黑素瘤細胞中ApoE的分子敲降還阻止了GW3965 2介導的細胞 侵襲和內皮募集表型的抑制(圖27G-H)。與此一致,去除LXRβ而非LXRα 的黑素瘤細胞喪失了GW3965 2和T0901317 1上調ApoE轉錄以及最終的蛋 白質表達的能力(圖28H-I和圖27I-K)。總之,這些發現表明,LXRβ(黑 素瘤細胞表達的主要的LXR同種型)的藥理活化通過在黑素瘤細胞中轉錄地 活化ApoE表達而抑制了黑素瘤細胞的細胞固有的侵襲和內皮募集。
實施例18LXRβ活化治療對黑素瘤起源的及全身ApoE的需求 (engagement)
LXRβ誘導的細胞外ApoE對關鍵的黑素瘤表型的體外抑制表明LXR激 動劑的體內抑制作用可進一步地被外周組織中LXR的活化增強,其將用作細 胞外ApoE的重要來源。
重要地,考慮到患者中的慢性ApoE誘導,這樣的非轉化的組織較不易 于發展對LXR活化治療的抗性。因此,研究了治療性LXR激動是否通過誘 導衍生自黑素瘤細胞或全身組織的ApoE而抑制黑素瘤進展。與LXRβ激動 提高了體內黑素瘤細胞的ApoE表達一致,ApoE轉錄本水平在從飼喂補充 LXR激動劑的飼料的小鼠分離的黑素瘤原發性腫瘤及在黑素瘤肺和腦轉移 中上調(圖29A-E)。重要地,用GW3965 2或T0901317 1處理小鼠顯著地 提高了ApoE在小鼠的全身脂肪、肺和腦組織中的蛋白表達(圖30A-B),并 且還上調了ApoE在循環的白細胞中的表達水平(圖30C)。這些結果表明LXR 活化治療誘導黑素瘤細胞和全身組織的ApoE體內表達。
為確定黑素瘤衍生的以及全身性LXR活化對口服施予的LXR激動劑的 腫瘤抑制作用的體內需要,首先檢測了GW3965 2抑制LXRβ缺失的B16F10 小鼠黑素瘤細胞的腫瘤生長的能力。
與在人黑素瘤細胞中的發現一致,小鼠黑素瘤細胞的LXRβ的敲降消除 了GW3965介導的ApoE表達的誘導(圖29F~H)。盡管如此,黑素瘤細胞 LXRβ敲降不能夠阻止GW3965 2抑制腫瘤生長(圖29D),表明系統性LXR 活化在GW3965 2的腫瘤生長抑制中的作用。為鑒別LXR激動劑的介導該非 腫瘤自主黑素瘤生長抑制的LXR同種型,檢查了GW3965 2對植入到LXRα 或LXRβ的遺傳缺失小鼠的腫瘤的影響。有趣地,系統性LXRβ的遺傳切除 封閉了GW3965抑制黑素瘤腫瘤生長的能力,而LXRα失活則對GW3965的 腫瘤生長抑制無影響(圖6D)。重要地,GW3965 2(對LXRβ的活性比對 LXRα的活性高6倍的激動劑)對系統性ApoE表達的上調在LXRβ-/-而非 LXRα-/-小鼠中被消除(圖30E和圖29I)。這些結果表明,GW3965 2在外周 組織中對ApoE的誘導主要被系統性LXRβ活化驅動。與此一致,發現系統 性LXRβ在介導黑素瘤腫瘤生長抑制中是GW3965 2的主要分子靶標和效應 子。
接下來,檢查了LXR激動劑的體內黑素瘤抑制作用是否需要ApoE。 與黑素瘤細胞的LXRβ敲降對GW3965 2的腫瘤抑制活性缺少影響相一致, 黑素瘤細胞ApoE的去除也未阻止GW3965 2的腫瘤生長抑制(圖29F-H和 圖30F)。這些發現表明,GW3965 2的腫瘤抑制效果在全身組織中可通過 ApoE誘導被主要地調節。
實際上,GW3965 2在抑制ApoE遺傳失活的小鼠中的腫瘤生長完全 無效(圖30F),揭示了系統性的ApoE在驅動黑素瘤腫瘤生長抑制中作為系 統性LXRβ的下游效應子。有趣地,與原發性腫瘤生長調控相反,黑素瘤細 胞ApoE的敲降部分地防止了GW3965 2的轉移抑制作用(圖30G)。相似地, ApoE的遺傳失活也僅部分地防止了GW3965 2引發的轉移抑制(圖30G)。 GW3965驅動的轉移抑制僅在黑素瘤細胞ApoE敲降和全身ApoE的遺傳失活 的情況下完全被阻止(圖30G),指示了LXRβ在抑制轉移中需要黑素瘤起源 的和全身的ApoE的需要。因此,我們斷定LXRβ活化對原發性腫瘤生長的 影響主要由全身的ApoE誘導所引發,而LXRβ激動對轉移的影響則通過在 黑素瘤細胞和全身組織中的ApoE轉錄誘導所調節。
識別ApoE為LXRβ誘導的黑素瘤表型抑制的唯一的下游調節子進 一步突出了該基因作為黑素瘤進展的抑制子的重要性。為確定ApoE表達是 否是黑素瘤轉移結果的臨床預后,我們通過對71個臨床切除的人原發性黑素 瘤病變進行不知情的免疫組織化學分析而評估了ApoE蛋白的水平。
發現相對于其黑素瘤未轉移的患者,在其黑素瘤已轉移的患者的原發性 腫瘤中,黑素瘤已經轉移的患者呈現低大約3倍的ApoE表達(圖30H, P=0.002)。顯著地,患者的原發性黑素瘤病變中ApoE表達水平有效地分級 具有轉移性復發高風險的患者與具有轉移性復發低風險的患者(圖30I,P= 0.002)。這些觀察與揭示ApoE在遠端黑素瘤轉移中相對于原發性病變顯著 較低的水平一致(Pencheva et al.,2012)。共同地,該工作表明,作為單基因 的ApoE可能是原發性黑素瘤的預后和預測生物標記物,以識別i.)處于黑素 瘤轉移復發的風險,并因此ii.)可從LXRβ激動劑介導的ApoE誘導獲得臨 床益處的患者。
實施例19LXRβ活化治療抑制了抗達卡巴嗪及威羅菲尼的黑素瘤的生長
受LXRβ活化治療對大量具有不同突變背景的黑素瘤系的抑制黑素瘤腫 瘤生長和轉移的強的能力的鼓勵,接下來試圖確定抗用在轉移性黑素瘤治療 中的兩種主要臨床制劑—達卡巴嗪和威羅菲尼—的黑素瘤是否可響應于 LXRβ活化治療。
為此,通過在DTIC的存在下連續地培養黑素瘤細胞兩個月而產生 抗達卡巴嗪(DTIC)的B16F10克隆。這產生了與親本B16F10細胞系相比, 呈現響應于高劑量的DTIC處理的活力提高7倍的細胞群體(圖31A)。為了 確認該體外衍生的DTIC克隆在體內也抗DTIC,評估了達卡巴嗪處理對腫瘤 生長的影響。
雖然達卡巴嗪顯著地抑制了DTIC敏感性親本細胞系的生長(圖31B), 其未影響B16F10抗DTIC細胞的腫瘤生長(圖31C)。GW3965 2強烈地抑 制了抗DTIC的B16F10黑素瘤克隆的腫瘤生長超過70%(圖31C~D)。重要 地,口服遞送GW3965 2也強烈地抑制了由獨立的MeWo細胞系形成的體內 衍生的抗DTIC人黑素瘤腫瘤的生長(圖31E-F和圖32A)。
這些結果揭示了LXRβ激動有效地抑制了抗達卡巴嗪(FDA唯一批準的 轉移性黑素瘤中的細胞毒性化學治療劑)的多種黑素瘤細胞群體。我們的發 現對于黑素瘤的治療具有重要的臨床應用,因為用達卡巴嗪治療的全部IV 階段的患者最終通過發展抗該試劑的腫瘤而進展。
我們測試了LXRβ活化治療對抗最近批準的B-Raf激酶抑制劑威羅菲尼 (顯示抗B-Raf突變體黑素瘤活性的藥物(regimen))的黑素瘤細胞的影響 (Bollag et al.,2010;Sosman et al.,2012)。無數的研究者衍生了抗威羅菲尼的 黑素瘤系(Poulikakos et al.,2011;Shi et al.,2012,Das Thakur et al.,2013)。 GW3965 2處理抑制了先前衍生的SK-Mel-239抗威羅菲尼細胞系的生長 72%(圖31G),并且顯著地延長了具有抗威羅菲尼的黑素瘤負荷的小鼠的存 活(圖31H)。我們在不同的黑素瘤臨床前模型中的組合的藥理、分子和遺傳 研究中的發現確立了LXRβ靶向是通過轉錄誘導ApoE(黑素瘤侵襲和轉移性 血管生成的關鍵抑制子)而強烈地抑制黑素瘤腫瘤生長和轉移的新的治療方 法(Pencheva et al.,2012;圖31I)。
實施例20用ApoE處理抑制了多種癌癥類型的腫瘤細胞侵襲和內皮募 集,包括乳腺癌、腎細胞癌和胰腺癌
為了確定ApoE處理是否有效地治療除了黑素瘤以外的癌癥類型,進行 體外檢測以評價ApoE處理對幾種不同的癌細胞系的影響,包括乳腺癌、腎 細胞癌和胰腺癌細胞系(圖33)。
通過使用穿孔基質膠侵襲腔系統(354480,BD Biosciences)測試了癌細 胞體外通過基質膠侵襲的能力。在包含0.2%FBS的培養基中使各種癌細胞 系血清饑餓過夜。次日,在通過加入0.5mL的饑餓培養基到頂孔和底孔測定 之前,預平衡侵襲腔。同時,胰蛋白酶消化癌細胞,并使用臺盼藍死細胞拒 染染料而計數活細胞。然后,以1×105個細胞/1mL饑餓培養基的濃度重懸 浮癌細胞,接種0.5mL的包含5×104個細胞的細胞懸浮液到每個穿孔。為確 定重組ApoE對癌細胞侵襲的影響,在檢測的開始,以100μg/mL的濃度加 人重組ApoE3(4696,Biovision)或BSA到每個穿孔中。讓侵襲實驗在37℃ 進行24個小時。在完成測定后,在PBS中洗滌插入物,使用棉簽(q-tips) 從每個插入物的正面輕輕地擦去未侵襲的細胞,并且侵襲到基底插入物側的 細胞在4%的PFA中室溫固定15分鐘。在固定后,在PBS中洗滌插入物, 然后切割,并使用包含DAPI核著色劑的VectaShield封固劑(H-1000,Vector  Laboratories)封固到載玻片上。使用倒置熒光顯微鏡(Zeiss Axiovert 40 CFL) 以5×的放大率成像每個插入物的基側,并使用ImageJ量化DAPI陽性細胞 的數目。
實際上,用ApoE處理抑制了全部三種這些細胞類型的腫瘤細胞侵 襲和內皮募集(圖33A~I)。
實施例21LXR激動劑LXR-623、WO-2007-002563實施例19、 WO-2010-0138598實施例9和SB742881誘導ApoE在人黑素瘤細胞中的表 達
考慮到LXR激動劑GW3965 2和T0901317 1處理的ApoE活化導致抑 制腫瘤生長和轉化的治療益處,接下來檢查了其它LXR激動劑在人黑素瘤細 胞系中誘導ApoE表達的能力(圖34)。
為確定各種LXR激動劑(LXR-623、WO-2007-002563實施例19、 WO-2010-0138598實施例9和SB742881)對ApoE在黑素瘤細胞中表達的 影響,接種1×105個人MeWo黑素瘤細胞到6孔板中。次日,以指定的500nM、 1μM或2μM的濃度將DMSO或各種LXR激動劑加到細胞培養基中,并在 DMSO或藥物的存在下于37℃培養細胞48個小時。保持加到細胞培養基中 的DMSO的總量低于0.2%。使用Total RNA Purification試劑盒(17200, Norgen)從全細胞裂解物提取RNA。對于每種樣本,使用cDNA First-Strand  Synthesis試劑盒(Invitrogen)反轉錄600ng的RNA為cDNA。大約200ng 的cDNA與green PCR Master Mix以及用于檢測人ApoE的相應的正 向引物和反向引物混合。以一式四份進行每個反應,并使用ABI Prism 7900HT  Real-Time PCR System(Applied Biosystems)通過實時定量PCR擴增測量 ApoE mRNA的表達水平。使用ΔΔCt方法確定相對的ApoE表達。GAPDH 用作歸一化目的的內部對照。
實際上,用LXR激動劑LXR-623、WO-2007-002563實施例19、 WO-2010-0138598實施例9和SB742881的處理全部導致各種程度的ApoE 表達的誘導(圖34A~C)。
實施例22用LXR激動劑GW3965處理抑制了腎癌、胰腺癌和肺癌的體 外腫瘤細胞侵襲
我們已經證明了用LXR激動劑處理導致黑素瘤腫瘤細胞侵襲的抑 制。考慮到該效果由ApoE表達的活化調節,我們假設用LXR激動劑處理將 導致乳腺癌、胰腺癌和腎癌的體外腫瘤細胞侵襲的抑制,因為這些癌癥類型 響應于ApoE處理。為了測試該假設,我們通過用LXR激動劑GW3965 2 處理乳腺癌、胰腺癌和腎癌細胞系而進行了體外腫瘤細胞的侵襲實驗(圖 35)。
用1μM的DMSO或GW3965處理各種細胞系(5×104RCC人腎臟癌細 胞,5×104個PANC1人胰臟癌細胞和5×104個H460人肺癌細胞)56個小時。 在DMSO或GW3965的存在下于0.2%FBS培養基中使細胞血清饑餓16個 小時。在血清饑餓后,使用基質膠侵襲腔系統(354480,BD Biosciences)使 細胞經穿孔侵襲測定。在測定前,通過加入0.5mL的饑餓培養基到頂部和底 部的孔中而預平衡侵襲腔。同時,胰蛋白酶消化癌細胞,并使用臺盼藍計數 活細胞。然后,以1×105個細胞/1mL饑餓培養基的濃度重新懸浮癌癥細胞, 并接種包含5×104個細胞的0.5mL的細胞懸浮液到每個穿孔。讓侵襲測定在 37℃進行24個小時。在完成測定后,在PBS中洗滌插入物,使用棉簽從每 個插入物的正面輕輕地擦去未侵襲的細胞,并且侵襲到基底插入物側的細胞 在4%的PFA中室溫固定15分鐘。在固定后,在PBS中洗滌插入物,然后 切割,并使用包含DAPI核著色劑的VectaShield封固劑(H-1000,Vector  Laboratories)封固到載玻片上。使用倒置熒光顯微鏡(Zeiss Axiovert 40 CFL) 以5×的放大率成像每個插入物的基側,并使用ImageJ量化DAPI陽性細胞 的數目。
實際上,用GW3965 2處理在全部三種測試的腫瘤類型中都導致腫 瘤細胞侵襲的抑制(圖35A~C)。這進一步證明了LXR激動劑治療各種癌癥 類型的寬的治療潛力。
實施例23用LXR激動劑GW3965治療抑制了體內乳腺癌腫瘤生長
我們已經證明LXR激動劑抑制乳腺癌、胰腺癌和腎癌的體外癌進展表 型。為研究LXR激動劑治療是否抑制乳腺癌原發性腫瘤體內生長,用對照食 物或添加LXR激動劑GW3965 2的食物處理注射MDA-468人乳腺癌細胞的 小鼠(圖36)。
為確定口服遞送的GW3965 2對乳腺癌腫瘤生長的影響,2×106個 MDA-468人類乳腺癌細胞在50μL的PBS和50μL的基質膠中重懸浮,并 且細胞懸浮液注射到7周齡的Nod Scidγ雌性小鼠的兩個下存儲(lower  memory)脂肪墊。在注射癌細胞之前兩天,指定小鼠對照飼料處理或添加 GW3965的飼料的處理(75mg/kg/天)。在Research Diets,Inc.的小鼠飼料中 配制GW3965 2藥物化合物,使用數顯卡尺測量腫瘤的尺寸,并且計算腫瘤 的體積為(小直徑)2×(大直徑)/2。
用GW3965處理導致體內乳腺癌腫瘤大小的顯著減小(圖36)。
實施例24LXR激動劑LXR-623、WO-2007-002563實施例19、 WO-2010-0138598實施例9和SB742881處理對體外黑素瘤進展表型的效果
我們已經證明具有變化的效力的各種LXR激動劑在黑素瘤細胞中誘導 ApoE表達的能力(圖34)。由于LXR激動劑對癌癥的治療效果是通過活化 ApoE的表達,我們假設任何指定的LXR激動劑的治療效力與其誘導ApoE 表達的能力直接相關。為了確認這一點,我們量化了各種LXR激動劑處理對 體外內皮募集和黑素瘤細胞的腫瘤細胞侵襲的效果。如圖37中顯示,LXR 激動劑體外抑制癌癥進展表型的程度與LXR激動劑誘導ApoE的效力相關。
細胞侵襲:用1μM的DMSO、LXR-623、WO-2007-002563實施例 19、WO-2010-0138598實施例9或SB742881處理MeWo人黑素瘤細胞56 個小時。在每種相應的藥物或DMSO存在下,在0.2%的FBS培養基中使細 胞血清饑餓16個小時。在血清饑餓后,使用基質膠入侵腔系統(354480,BD  Biosciences)使細胞經歷穿孔侵襲測定。在進行測定前,通過加入0.5mL的 饑餓培養基到頂部的孔和底部的孔而預平衡侵襲腔。同時,胰蛋白酶消化癌 細胞,并使用臺盼藍計數活細胞。然后,以2×105個細胞/1mL的饑餓培養基 的濃度重新懸浮癌細胞,接種0.5mL的包含1×105個細胞的細胞懸浮液到每 個穿孔。讓侵襲實驗在37℃進行24個小時。當完成檢測后,在PBS中洗滌 插入物,使用棉簽從每個插入物的正面輕輕地擦去為侵襲的細胞,并且侵襲 到基底插入物側的細胞在4%的PFA中室溫固定15分鐘。在固定后,在PBS 中洗滌插入物,切除,并用包含DAPI核著色劑的VectaShield封固劑(H-1000, Vector Laboratories)封固到載玻片上。使用倒置熒光顯微鏡(Zeiss Axiovert 40 CFL)以5×的放大率成像每個插入物的基側,并使用ImageJ量化DAPI陽 性細胞的數目。
內皮募集:以1μM的DMSO、LXR-623、WO-2007-002563的實施例19、 WO-2010-0138598的實施例9或SB742881處理MeWo人黑素瘤細胞56個小 時。然后,在每種藥物或DMSO的存在下接種5×104個癌細胞到24孔板中, 并在開始測定前附著16個小時。在0.2%的包含FBS的培養基中使人類臍靜 脈內皮細胞(HUVEC細胞)饑餓過夜。次日,1×105個HUVEC細胞接種到 裝在底部的包含癌細胞的每個孔中的3.0μm的HTS Fluoroblock插入物 (351151,BD Falcon)。讓HUVEC細胞遷移到癌細胞20個小時,然后在PBS 中洗滌插入物,在4%的PFA中固定,用DAPI標記,并封固到載玻片上。 使用倒置熒光顯微鏡(Zeiss Axiovert 40CFL)以5×放大率成像每個插入物 的基側,并且使用ImageJ量化DAPI陽性細胞的數目。
強烈誘導ApoE表達的LXR激動劑(例如WO-2010-0138598實施例9 和SB742881)比較低功效的LXR激動劑更有效地抑制癌癥進展表型(圖 37)。這進一步證明了LXR激動劑治療癌癥的治療益處是ApoE誘導的結果。
實施例25LXR激動劑處理抑制黑素瘤體內腫瘤生長
我們已經證明誘導ApoE表達的LXR激動劑抑制了體外腫瘤活性。為證 實這些激動劑是否抑制黑素瘤的體內腫瘤生長,用LXR-623、 WO-2007-002563實施例19、WO-2010-0138598實施例9或SB742881處 理注射了B16F10黑素瘤細胞的小鼠。
為評價口服施予的LXR-623、WO-2007-002563實施例19、 WO-2010-0138598實施例9或SB742881對黑素瘤腫瘤生長的效果,5×104個B16F10小鼠黑素瘤細胞重懸浮在50μL的PBS和50μL的基質膠中,并 且細胞懸浮液皮下注射到7周齡C57BL/6小鼠的兩個較低的背側。每日觸診 小鼠腫瘤的形成,
并在檢測到測量的體積為5~10m3的腫瘤后,小鼠被分成對照食物或包含每 個分別的LXR激動劑的食物:LXR-623(20mg/kg/天)、WO-2007-002563實 施例19(100mg/kg/天)、WO-2010-0138598實施例9(10mg/kg/天或100 mg/kg/天)或SB742881(100mg/kg/天)。在Research Diets,Inc的小鼠食物 中配制LXR藥物化合物。使用數顯卡尺測量腫瘤的大小,并且如下計算腫瘤 的體積:(小直徑)2×(大直徑)/2。
與我們的體外數據一致,有效誘導ApoE體外表達的LXR激動劑 (WO-2010-0138598實施例9和SB742881)顯著地抑制黑素瘤原發性腫瘤 的體內生長(圖38)。這也與我們的證明強力誘導ApoE表達的其它LXR激 動劑(GW3965 2,T0901317 1)也抑制原發性腫瘤的體內生長的結果一致(圖 21)。
因此,上述實施例專注于表征分子以及其發揮其作用的分子機制。 為此,發現ApoE靶向在兩種不同細胞類型上的兩個不同的但是同源的受體。 作用在黑素瘤細胞LRP1受體上的ApoE抑制黑素瘤侵入,而其作用于內皮 細胞LRP8受體則抑制了內皮的遷移。來自功能喪失、功能獲得、異位顯性、 臨床相關以及體內選擇衍生物表達分析的結果產生了其中三種miRNA匯聚 地靶向轉移抑制網絡以限制ApoE分泌的表型,從而抑制黑素瘤細胞上的 ApoE/LRP1信號和內皮細胞上的ApoE/LRP8信號(圖7K)。雖然上述系統 分析已經鑒別ApoE和DNAJA4為這些miRNA調節的轉移性表型的主要目 標和直接介導物,不能排除三種miRNA可單獨地保持其沉默可有助于轉移 性進展的另外的靶基因。然而,ApoE或DNAJA4敲降完全挽救用單個miRNA 沉默時見到的轉化抑制表型的能力強烈地暗示這些基因是對轉移的miRNA 依賴效果的關鍵介導物。
上述結果揭示了ApoE在抑制黑素瘤轉移性進展中的必要的且充分的功 能的組合的分子、遺傳和體內證據。ApoE以脂蛋白結合以及無脂質狀態分 布在循環系統中(Hatters et al.,2006)。雖然已經顯示無脂質的重組的ApoE 足以抑制黑素瘤侵入以及內皮遷移,包含在脂蛋白顆粒中的ApoE可能也抑 制黑素瘤侵入和內皮募集。重組ApoE抑制這些促轉移性表型以及用抗體介 導的ApoE中和看到的提高的黑素瘤侵襲和內皮募集表型的能力表明,ApoE 分子自身是這些表型的關鍵調節物。與文中公開的發現一致,以前發現ApoE 的合成肽片段通過未知的機制抑制內皮遷移(Bhattacharjee et al.,2011)。這 里公開的發現與黑素瘤細胞分泌的及系統性內源ApoE在抑制內皮募集中的 功能一致,其對于破壞的內皮細胞生長不是繼發的。
上述分子的、遺傳的和體內研究揭示了內源的癌癥衍生的ApoE通過內 皮LRP8受體信號在調節內皮轉移和癌血管生成中的功能。ApoE/LRP8信號 介導的穩健的非細胞自主的內皮募集表型表明,ApoE還可在其它癌癥類型 中調節轉移性血管生成,并且仍需要研究ApoE在癌癥血管生物學中的這樣 的普通作用。ApoE是在脂質、心血管和神經退行性疾病中具有已經得到確 認的功能的多態分子。其三種主要的變異體ApoE2、ApoE3和ApoE4在人類 群體中顯示不同的表現,其中ApoE3是最常見的變異體(Hatters et al.,2006)。 三種亞型在包含ApoE受體結合結構域的N末端結構域的殘基112和158處 有差別。認為這些結構變異在變異體中產生不同的功能屬性。與此一致,三 種ApoE亞型的差別為它們對LDL受體家族成員的結合親和力、脂蛋白結 合偏好和N末端穩定性。即,與ApoE3和ApoE4相比,ApoE2具有50倍至 100倍的減弱的LDL受體結合能力(Weisgraber et al.,1982),而ApoE4與其 它兩個變異體不同,其優選結合大的低密度脂蛋白(Weisgraber et al.,1990), 并呈現最低的N末端穩定性(Morrow et al.,2000)。這些功能差異賦予病理 生理學性能以選擇ApoE亞型。而認為在78%的人群中發現的ApoE3是中性 等位基因,ApoE2與III型高脂蛋白血癥相關(Hatters et al.,2006),并且ApoE4 代表主要已知的阿爾茨海默病的遺傳危險因子(Corder et al.,1993),并且還 與心血管疾病的發展的風險的小的提高相關(Luc et al.,1994)。考慮到在上 述研究中分析的多個人黑素瘤細胞系對于ApoE3等位基因以及重組ApoE3 抑制黑素瘤侵入和內皮募集的性能是純合的,上述發現與ApoE3抑制黑素瘤 轉移性進展是充分且必要的是一致的。然而,未來將有興趣確定ApoE2和 ApoE4是否可調節這些促轉移性表型至與ApoE3相似的程度,以及具體的 ApoE基因型是否可給于黑素瘤轉移性進展的增強的風險。
除了原發性黑素瘤損傷的外科切除,目前沒有有效的預防黑素瘤轉移的 治療。基于元分析,用干擾素預防黑素瘤轉移增加的5年總存活率不足3%, 而III期實驗數據證明的顯著的生存優點仍是顯著的(Garbe et al.,2011)。在 遺傳去除系統ApoE的情況下,黑素瘤轉移進展的顯著增強表明調節ApoE 水平可對黑素瘤(全球每年造成大約48,000例死亡的疾病)具有顯著的治療 意義(Lucas et al.,2006)。考慮到ApoE抑制黑素瘤侵襲、內皮遷移、轉移性 血管生成和轉移性移植的強勁能力,旨在藥理地誘導內源ApoE水平的治療 方法可通過降低轉移發生率而顯著降低黑素瘤的致死率。
上述基于體內的無偏選擇的方法導致發現被來自代表黑色素型和無黑色 素型黑素瘤兩者的獨立的患者黑素瘤細胞系的癌細胞的解除控制的協同地和 顯著地促進轉移的miRNA。盡管先前未表征miR-1908,miR-199a已經涉及 肝細胞癌(Hou et al.,2011;Shen et al.,2010)和骨肉瘤(Duan et al.,2011), 其與黑素瘤相反,顯示miR-199a表達水平的下調。這些差異與在各自癌癥類 型中建立的miRNA的組織特異的表達譜一致。先前揭示提高的miR-199a水 平與眼色素層黑素瘤進展相關的臨床相關的研究支持識別miR-199a為黑素 瘤轉移的促進子(Worley et al.,2008),表明了誘導的miR-199a表達可為與 原發位點無關的轉移性黑素瘤的定義性特征。以前的研究已經涉及另外的 miRNA促進黑素瘤轉移性進展,例如miR-182(Segura et al.,2009)、miR-214 (其在轉移性黑素瘤細胞中上調,但在上述研究中未功能性地進行;Penna et al.,2011)和miR-30b/miR-30d(Gaziel-Sovran et al.,2011)。已經報道這些 miRNA的每個僅較小地調節黑素瘤轉化,導致當過表達或敲降miRNA時, 分別提高或減小轉移調節1.5倍至2倍。相反地,過表達miR-199a或miR-1908 增強轉移9倍(圖1C),而組合的miRNA敲降系統地抑制黑素瘤轉化超過 70倍(圖7E)。因此,文中公開的研究代表匯聚地并強力地促進人黑素瘤轉 化的多個miRNA的第一個系統性的發現,以及第一個分配細胞自主性/非細 胞自主性雙功能給癌癥中的內源轉移調節miRNA。
以前對乳腺癌中miRNA的系統分析主要揭示了多個microRNA在體內 選擇的轉移性乳腺癌細胞中表達水平的降低(Tavazoie et al.,2008)。這些發 現與后來發現在乳腺癌中的許多另外的轉移抑制miRNA一致(Shi et al.,2010; Wang and Wang,2011),識別若干miRNA作為p53腫瘤抑制子的直接的轉錄 靶標(He et al.,2007),miRNA在乳腺癌中相對于正常組織下調(Calin and  Groce,2006;Iorio et al.,2005),drosha和dicer在乳腺癌(Yan et al.,2011)和 轉移性乳腺癌(Grelier et al.,2011)中下調,以及通過dicer敲降的總miRNA 沉默的促腫瘤發生和促轉移的效果(Kumar et al.,2007;Kumar et al.,2009; Martello et al.,2010;Noh et al.,2011)。與乳腺癌不同,在黑素瘤中的上述發 現揭示了一組在轉移性人類黑素瘤中上調的miRNA,提高了miRNA加工在 黑素瘤中以促腫瘤發生和促轉移的方式實際地起作用的有意思的可能性。與 此一致,黑素細胞的發育需要dicer(Levy et al.,2010),并且最近在臨床病理 研究中發現dicer表達與人類黑素瘤進展正相關(Ma et al.,2011)。當這些發 現與這里公開的發現結合時,刺激了調查黑素瘤轉移對dicer功能性需要的進 一步研究(Bernstein et al.,2001)。
黑色素型和無黑色素型黑素瘤轉移的體內選擇模型的建立允許識別高 度轉移的黑素瘤細胞顯示的細胞表型。所述工作揭示,除了增強侵襲,黑素 瘤細胞在高度轉移的黑素瘤細胞中募集內皮細胞的能力相對于轉移性差的 黑素瘤細胞顯著地增強。此外,發現轉移的三種主要的轉錄后調節因子強烈 地介導內皮募集。進一步發現這些miRNA調控的下游信號通路也調節內皮 募集。這些發現揭示了內皮募集為轉移性黑素瘤細胞的定義性特征(defining  feature)。最近還發現增強的內皮募集能力為轉移性乳腺癌的定義性特征, 其中,通過靶向促進內皮募集的兩種不同的信號通路的miRNA介導 miR-126對轉移的抑制(Png et al.,2012)。在乳腺癌中,內皮募集提高了 轉移性起始而非腫瘤生長的可能性。相似地,這里研究的黑素瘤轉移促進子 miRNA極大地增強了轉移性定植,而沒有增強原發性腫瘤生長,并增加了 轉移性結節的數目-與這些miRNA以及它們的調控網絡在轉移性引發而 非腫瘤生長促進中的作用一致。總之,這些發現與到轉移性小生境(niche) 中的內皮募集在這些不同的上皮癌類型中起轉移性起始和移植的促進子的 作用一致。內皮細胞在癌癥進展中這樣的非典型的功能與內皮細胞在血液循 環刺激增強的腫瘤生長中的已知功能形成對比。已知內皮細胞在器官發生期 間通過提供誘因(cue)給鄰近的細胞而在發育中起這樣的非典型的功能 (Lammert et al.,2001)。最近這樣的線索還顯示促進器官再生(Ding et al., 2011;Ding et al.,2010;Kobayashi et al.,2010)。需要進一步的工作以確定促 進轉移開始的內皮細胞提供的轉移刺激因子。
miR-199a-3p、miR-199a-5p和miR-1908單獨地預測黑素瘤患者群中無 轉移存活的的能力表明每種miRNA作為黑素瘤癌癥進展(progression)臨 床預測物的顯著性。重要地,三種miRNA的合計的標記(aggregate  signature)將高風險的患者與基本無轉移復發的風險的患者分級的顯著及高 度有意義的能力(圖7D)揭示了這些miRNA的協同,以及它們作為用于 識別可受益于miRNA抑制治療的患者的子集的黑素瘤生物標記物的臨床潛 力(Sawyers,2008)。治療性miRNA靶向通過使用已經在小鼠(Elmer et al., 2008(b);Krützfeldt et al.,2005;Obad et al.,2011)和靈長類動物(Elmer et al., 2008(a))中顯示對抗miRNA的體內LNA而獲得發展的勢頭,并且目前正 在人類臨床試驗中被測試。所述三種miRNA的強大的預后能力、通過用靶 向miR-199a-3p、miR-199a-5p和miR-1908的LNA的混合物治療高度轉移 的黑素瘤細胞而獲得的強力的協同轉移抑制的原理論證的證明(圖7E)以 及治療性遞送的體內優化的靶向這些miRNA的LNA的轉移抑制效果(圖 7J)激發了旨在確定在高風險的黑素瘤轉移(目前缺乏有效的化學治療選擇 的結果)的患者中組合靶向這些促轉移和促血管生成的miRNA的治療潛能 的進一步臨床研究。
上述實施例和優選的實施方式的說明應認為是說明性的,而非限制如權 利要求書所述限定的本發明。易于理解,可利用上述特征的無數變化和組合, 而不背離權利要求書中說明的本發明。不認為這樣的變化背離了本發明的范 圍,并且全部這樣的變化包含在下述權利要求書的范圍內。文中引用的全部 對比文獻以其整體并入本文。

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